鏈格孢霉毒素樣品處理及分析方法研究進(jìn)展

王昌釗，喬蓉霞，李子豪，林芳

(1.西安海關(guān)技術(shù)中心，西安 710068； 2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，西安 710065)

鏈格孢霉，又名交鏈孢霉，是一類在自然環(huán)境中廣泛分布的真菌，具有腐生、內(nèi)生和植物致病性[1-2]，能引起如煙草赤星病、馬鈴薯早疫病等多種經(jīng)濟(jì)植物病害，也是導(dǎo)致水果、蔬菜及冷藏食品腐敗變質(zhì)的主要微生物[3]。鏈格孢霉毒素是鏈格孢霉在適宜條件下產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物，目前已知具有明顯毒性的有70 多種，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可以將其分為5 種不同的類型：(1)二苯并吡喃酮類，典型有鏈格(交鏈)孢酚(AOH)、鏈格(交鏈)孢酚單甲醚(AME)；(2)四氨基酸衍生物類，典型有如細(xì)交鏈孢菌酮酸(TeA)；(3)苝醌類，典型有鏈格(交鏈)孢毒素(ATXs)；(4)混雜結(jié)構(gòu)，典型有騰毒素(TEN)；(5)長(zhǎng)鏈氨基多元醇的丙三羧酸酯類，典型有番茄交鏈孢菌毒素(AAL)。蘋果、柑橘、番茄、蘿卜、高粱、小麥等果蔬和谷物及飼料，均可在田間、運(yùn)輸或冷藏環(huán)境下受到真菌的污染而腐敗，繼而產(chǎn)生并累積上述鏈格孢霉毒素[4]。

楊勝利等[5]調(diào)查了林縣居民糧食中互隔交鏈孢霉污染情況及人群中AOH 和AME 暴露水平，結(jié)果顯示2004 年河南林縣居民糧食中互隔交鏈孢霉及其相關(guān)毒素污染狀況有不同程度的減輕，此與當(dāng)?shù)厥彻馨┌l(fā)生率的降低可能有一定的關(guān)系。2016～2018 年國(guó)家食品污染物監(jiān)測(cè)顯示小麥及其制品中TeA 和TEN 的污染嚴(yán)重，檢出率超過(guò)90%[6]。陳蓓等[7]對(duì)江蘇省內(nèi)小麥粉中4 種交鏈孢毒素污染情況進(jìn)行調(diào)查，在105 份小麥粉樣品中，TeA、AOH、TEN 檢出率為100%，AME 檢出率為88%。鏈格孢霉毒素對(duì)人或牲畜具有誘變性、致癌性和致畸性等慢性或急性毒性作用[8-9]，其中TeA 急性毒性相對(duì)較高，被美國(guó)食品藥物管理局列入有毒化學(xué)物質(zhì)登記冊(cè)中，巴伐利亞規(guī)定了高粱和小米等嬰兒食品中的TeA 限量標(biāo)準(zhǔn)為500 μg/kg[10]。在我國(guó)食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及進(jìn)出口商品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中，鏈格孢霉毒素也列入監(jiān)測(cè)范圍，目前已有發(fā)布實(shí)施的地方標(biāo)準(zhǔn)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也在制定中。近年來(lái)隨著研究不斷深入，鏈格孢霉毒素的危害和污染現(xiàn)狀引起各個(gè)國(guó)家的重視，筆者總結(jié)了近幾年鏈格孢霉毒素樣品處理方法和檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展。

1 樣品處理方法

樣品處理技術(shù)是獲得準(zhǔn)確、可靠檢測(cè)結(jié)果的前提和保障，樣品處理過(guò)程包括樣品制備、提取、分離純化和濃縮等步驟，以最大程度地從復(fù)雜基質(zhì)中提取待測(cè)組分為目的。鏈格孢霉毒素的樣品處理(凈化與富集)方法主要有液液萃取技術(shù)[11]、固相萃取(SPE)技術(shù)[12]、逆流色譜法(CCC)[13]、基于QuEChERS 原則的處理技術(shù)[14]等。在固相萃取(SPE)技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了分散固相萃取(dSPE)法、分子印跡固相萃取(MISPE)法。

1.1 液液萃取技術(shù)

液液萃取法是基于雜質(zhì)和待測(cè)物在不同溶劑中溶解度的差異來(lái)完成萃取凈化，根據(jù)相似相容原理，鏈格孢霉毒素的提取一般使用甲醇、乙腈等試劑。液液萃取技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速、易于實(shí)現(xiàn)、操作快速等特點(diǎn)，但存在有機(jī)溶劑用量大、不能滿足高通量檢測(cè)需求、目標(biāo)物易流失等問(wèn)題[15]。

ZHOU Jian 等[16]首次將分散液液微萃取技術(shù)用于谷物中5 種鏈格孢霉毒素的提取。利用基于QuEChERS 原則的處理技術(shù)提取并鹽析后，將上清液進(jìn)行分散液液微萃取(DLLME)，然后使用光電二極管陣列/熒光檢測(cè)器聯(lián)用的超高效液相色譜儀和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定谷物中的AOH、AME、ALT、TEN、TeA 5 種鏈格孢霉毒素，定量限為2.1～120.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為72.7%～109.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%～9.62% (n=6)。PUNTSCHER 等[17]利 用 甲醇-水-甲酸(體積比為79∶20∶1)溶液提取番茄醬、葵花籽油和小麥粉中天然存在的17 種游離和修飾型的鏈格孢霉毒素，為了降低葵花籽油的黏度、提升樣品的均勻性和萃取效率，振蕩前在葵花籽油樣品中加入正己烷，去除葵花籽油樣品中正己烷層后，使用甲醇-水(體積比為10∶90)稀釋萃取液，經(jīng)離心、濾膜過(guò)濾后使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定。該方法檢出限為0.03～9.00 μg/kg，定量限為0.60～18.00 μg/kg，AOH-3-硫酸鹽、AME-3-硫酸鹽、細(xì)格菌素等在小麥粉中的加標(biāo)回收率低于70%，其它鏈格孢霉毒素的加標(biāo)回收率為75%～100%，該方法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)。PUNTSCHER 等[18]利用甲醇-水-甲酸(體積比為79∶20∶1)溶液提取蘋果樣品中ATX II 等17 種游離和修飾型的鏈格孢霉毒素，上層液使用甲醇-水(體積比為10∶90)稀釋，離心后經(jīng)LC-MS/MS法測(cè)定，首次測(cè)定了蘋果樣品中具有高遺傳毒性的ATX II。

1.2 固相萃取技術(shù)

固相萃取是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使樣品中的基體和干擾物分離，然后經(jīng)洗脫劑洗脫，從而使目標(biāo)化合物得到分離和富集。相比于液液萃取，固相萃取法簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，降低了有機(jī)試劑的消耗。其中真菌毒素免疫親合固相萃取柱的使用，大大降低了基體干擾，提高了樣品凈化度。但免疫親和固相萃取方法只能針對(duì)一種或一類真菌毒素進(jìn)行凈化，無(wú)法應(yīng)用在高通量檢測(cè)中。近年來(lái)，新型材料包括碳基納米材料、生物材料和高分子聚合物材料的發(fā)展促進(jìn)了固相萃取技術(shù)在鏈格孢霉毒素樣品處理中的應(yīng)用。

TANVEER 等[19]以還原型氧化石墨烯-氧化鋅(rGO-ZnO)納米復(fù)合材料作為分散固相萃取吸附劑，同時(shí)富集和純化黃連中AME 等12 種真菌毒素，研究了影響分散固相萃取方法性能的關(guān)鍵參數(shù)，以乙腈-水-甲酸(體積比為80∶19∶1)溶液作為萃取溶液，以2%乙腈溶液作為吸附液，15 mg rGOZnO 作為吸附劑，正己烷作為洗脫液，1%甲酸-甲醇溶液作為解吸液進(jìn)行純化和富集，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)法進(jìn)行分析，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，定量限為0.09～0.41 μg/kg，加標(biāo)回收率為70.3%～105.7%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～15.0% (n=6)。

RICO-YUSTE 等[20]合成了對(duì)AOH、AME 有選擇性的分子印跡多孔聚合物微球體，用于食品樣品中AOH、AME 的提取。使用4-乙烯基吡啶(VIPY)和甲基丙烯酰胺(MAM)作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)作為交聯(lián)劑，3，8，9-三羥基-6H-二苯并[b，d]吡喃-6-酮(S2)作為鏈格孢酚替代模板，經(jīng)優(yōu)化后的MISPE 法選擇性分離鏈格孢霉毒素，使用高效液相色譜法或串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。根據(jù)歐洲委員會(huì)第2002/657/EC 號(hào)決議，MISPE 法已通過(guò)UPLC-MS/MS 法驗(yàn)證，用于番茄汁和香油中AOH 和AME 的測(cè)定，其定量限為1.1～2.8 μg/kg，加標(biāo)回收率為92.5%～106.2%。

ABOU-HANY 等[21]制備了多孔分子印跡聚合物微球，可選擇性地鍵合AOH，在二苯并[b，d]吡喃-6-酮骨架上的不同位置具有不同數(shù)量的酚基團(tuán)和不同程度的O-甲基化。

堿性、酸性或中性單體混合物，以二乙烯基苯或乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，在毒素分子的4 種分子模擬物存在下聚合，通過(guò)篩選確定微珠的最佳組分為N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯。經(jīng)優(yōu)化的MISPE 法分離，使用配有熒光檢測(cè)器的液相色譜儀測(cè)定了番茄樣品中添加的5 種濃度水平(33～110 μg/kg)的AOH，加標(biāo)回收率為81%～103%。

1.3 逆流色譜法

逆流色譜技術(shù)(CCC)是當(dāng)前分離技術(shù)的一個(gè)熱點(diǎn)，已在世界范圍內(nèi)得到了推廣應(yīng)用。FAN Chen等[13]使用分析型逆流色譜儀，在優(yōu)化的CCC 操作條件下，使用兩相溶劑系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了一種使用逆流色譜法進(jìn)行富集和凈化鏈格孢霉毒素的樣品處理方法，最后經(jīng)高效液相色譜分析。樣品中的AOH、AME 和TeA 被提取并富集在固定相中，然后將固定相作為流動(dòng)相反方向在線完成洗脫，富集因子為87～114，加標(biāo)回收率為81.14%～110.94%。用該方法檢測(cè)蘋果汁和葡萄酒樣品中的鏈格孢霉毒素的檢出限為0.03～0.14 μg/L。

1.4 基于QuEChERS 原則的樣品處理方法

傳統(tǒng)固相萃取凈化法操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，分析成本較高，不能同時(shí)凈化多種真菌毒素。而依據(jù)QuEChERS 原則的樣品處理方法，利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用吸附雜質(zhì)，從而達(dá)到除雜凈化的目的。由于多種凈化填料組合可以高效去除多種雜質(zhì)，且操作簡(jiǎn)便快速，溶劑用量少，精確度和準(zhǔn)確度高，適用的真菌毒素范圍廣，QuEChERS 成為目前真菌毒素分析應(yīng)用較多的樣品處理原則[22]。

BERARDIS 等[23]采用基于QuEChERS 原則的處理方法，開(kāi)發(fā)了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定番茄和水果產(chǎn)品中的AOH、AME、TEN 和TeA 4 種鏈格孢霉毒素，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。在番茄和水果產(chǎn)品中，TeA 的加標(biāo)回收率為98.8%～108.9%。應(yīng)用該方法測(cè)定了從意大利市場(chǎng)收集的57 個(gè)番茄和水果樣品，在部分樣品中檢出了TeA，其中在番茄醬中檢出TeA 高達(dá)814 μg/kg。

周貽兵等[24]根據(jù)QuEChERS 原則對(duì)番茄樣品進(jìn)行處理。首先加入酸化乙腈，超聲提取30 min，用于提取AOH、AME、ALT、TEN 和TeA 5 種鏈格孢霉毒素，隨后加入0.5 g 氯化鈉和5 g 無(wú)水硫酸鎂，脫水后離心，在提取液中加入25 mg C18作為凈化劑除去色素等共提取物。ZHENG Ruihang 等[25]基于QuEChERS 原則優(yōu)化了處理方法，樣品經(jīng)水和1.5%甲酸-乙腈溶液萃取，然后經(jīng)氯化鈉鹽析提取凈化樣品，使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了混合果泥中細(xì)交TeA、AOH、AME、ALT、TEN、ALS 和ATX-Ⅰ7 種鏈格孢霉毒素。結(jié)果表明，7 種鏈格孢霉毒素的質(zhì)量濃度在0.5～200.0 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996，平均加標(biāo)回收率為79.5%～106.7%。

2 分析方法

食品中鏈格孢菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜(TLC)法[26]、氣相色譜(GC)法[27]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[28]、高效液相色譜(HPLC)法[29]、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法[30]、酶聯(lián)免疫(ELISA)法[31]等。其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法和免疫分析法成為鏈格孢菌毒素色譜檢測(cè)的主要方法。近年來(lái)發(fā)展的新型分析方法包括加壓毛細(xì)管電色譜法、組合表面增強(qiáng)拉曼光譜法在鏈格孢霉毒素分析中也得到了應(yīng)用，大大提高了鏈格孢霉毒素分析的靈敏度。

2.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

LC-MS/MS 法具有選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)以及優(yōu)良的定性鑒定能力，可使樣品處理過(guò)程得到簡(jiǎn)化，在真菌毒素的高通量檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，成為目前鏈格孢霉毒素最常用的檢測(cè)方法。

XING Lijie 等[32]優(yōu)化了樣品預(yù)處理?xiàng)l件，包括稀釋溶劑、萃取溶劑和根據(jù)QuEChERS 原則純化參數(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，采用正電噴霧離子源，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下同時(shí)測(cè)定TeA、AOH、AME、ALT、TEN 5 種鏈格孢霉毒素，5種鏈格孢霉毒素在1～200 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，定量限為0.32～0.77 μg/kg，加標(biāo)回收率為73.8%～111.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10% (n=6)。

液相色譜高分辨質(zhì)譜憑借其超高的質(zhì)量分辨率和精確相對(duì)分子質(zhì)量的功能，在真菌毒素多組分的篩查與確證中也得到了越來(lái)越多的青睞。FAN Yingying 等[33]使用改進(jìn)的樣品處理方法，建立了超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-HRMS)法測(cè)定水果樣品中20 種真菌毒素，包括AOH、AME、TeA、TEN、ALT、ATX-1、ATX II 等鏈格孢霉毒素，其定量限為0.20～7.39 μg/kg，加標(biāo)回收率為81.2%～99.2%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于9.8%。

2.2 加壓毛細(xì)管電色譜法

加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)法是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型微分離分析技術(shù)，結(jié)合了毛細(xì)管電泳與液相色譜的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)在填充有高效液相填料的毛細(xì)管電色譜柱兩端施加高壓直流電場(chǎng)，使樣品在毛細(xì)管色譜柱中的保留行為同時(shí)受到電滲流及其在流動(dòng)相與固定相之間分配系數(shù)的影響，大大提高了樣品分離能力。薛羚偉等[34]以霉變柑橘為待測(cè)樣品，建立了同時(shí)檢測(cè)AME、AOH 和ALT 3 種鏈格孢霉毒素的固相萃取-加壓毛細(xì)管電色譜(SPE-pCEC)快速檢測(cè)方法，樣品經(jīng)乙腈提取，無(wú)水MgSO4和NaCl 脫水鹽析，C18SPE 萃取凈化，以C18毛細(xì)管色譜柱為分離柱，以含0.1%甲酸的乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用熒光檢測(cè)器分析。該方法質(zhì)量濃度線性范圍為2～200 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.1～0.9 μg/kg。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)是指在特殊制備的一些金屬良導(dǎo)體表面或溶膠中，在激發(fā)區(qū)域內(nèi)，由于樣品表面或近表面的電磁場(chǎng)的增強(qiáng)導(dǎo)致吸附分子的拉曼散射信號(hào)大大增強(qiáng)的現(xiàn)象[35]。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)是一種具有超高靈敏度的指紋光譜技術(shù)，由于其無(wú)需樣品預(yù)處理、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，目前在電化學(xué)、生物醫(yī)藥、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

GUO Zhiming 等[36]提出了一種結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和咖啡環(huán)效應(yīng)的SERS 技術(shù)，構(gòu)建了AOH 的高通量無(wú)標(biāo)記檢測(cè)模型，通過(guò)優(yōu)化干燥溫度和液滴體積，構(gòu)建了穩(wěn)定的咖啡環(huán)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)了蘋果中AOH 含量。通過(guò)咖啡環(huán)富集提高了檢測(cè)靈敏度，AOH 檢出限為1 μg /L，加標(biāo)回收率為82.06%～108.13%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.28% (n=5)。SERS技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)和咖啡環(huán)效應(yīng)相結(jié)合，有望對(duì)水果及其產(chǎn)品中的AOH 進(jìn)行高通量無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。

3 快速檢測(cè)技術(shù)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法設(shè)備價(jià)格昂貴、對(duì)人員操作要求較高。同時(shí)對(duì)于復(fù)雜基體的樣品，由于共萃物的影響存在基質(zhì)效應(yīng)，造成質(zhì)譜信號(hào)的增強(qiáng)或抑制。通常需要采用內(nèi)標(biāo)物或基體匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。但同位素內(nèi)標(biāo)種類有限且價(jià)格昂貴；而基體匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線配制費(fèi)時(shí)費(fèi)力，適用性較差，因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速且經(jīng)濟(jì)高效的鏈格孢霉毒素等真菌毒素檢測(cè)方法引起了越來(lái)越多研究者的興趣。

3.1 酶聯(lián)免疫法

1971 年Engvall 和Perlmann 將酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)用于免疫球蛋白G (IgG)的定量測(cè)定，使酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成為液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。

SINGH 等[37]使用對(duì)AOH 有特異性的多克隆抗體，開(kāi)發(fā)了一種間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫(ic-ELISA)分析法，用于檢測(cè)面包和麩皮樣品中的AOH，面包中的檢出限為(2.4±0.6) μg/kg，半數(shù)抑制濃度(IC50)為(15.2±2.6) μg/kg；麩皮提取物中的檢出限為(8.4±1.2) μg/kg，半數(shù)抑制濃度(IC50)為(52.8±10.8) μg/kg。該方法對(duì)AOH 具有非常高的特異性，回收率均大于75%，其檢測(cè)結(jié)果與質(zhì)譜法獲得的結(jié)果相當(dāng)，該方法適用于面包和麩皮樣品中AOH 的快速檢測(cè)。WANG Jianyi 等[38]建立了一種新型的基于半抗原和單克隆抗體的ic-ELISA法，用于同時(shí)分析小麥中的AOH 和AME。AOH與4-溴丁酸乙酯發(fā)生烷基化反應(yīng)，水解純化后與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)免疫接種小鼠，成功產(chǎn)生兩種單克隆抗體(mAbs)，一種既能識(shí)別AOH 又能識(shí)別AME，另一種可以特異性識(shí)別AOH。mAb 13D8 識(shí)別AOH 和AME 半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為9.4 μg/L和9.7 μg/L。通過(guò)mAb 13D8 建立了ic-ELISA 法以同時(shí)檢測(cè)AOH 和AME，其檢出限分別為0.7 μg/L 和1.0 μg/L。小麥樣品的平均加標(biāo)回收率為84.5%～107.6%，變異系數(shù)小于10%。該方法的檢測(cè)結(jié)果與HPLC-MS/MS 法相同，表明該方法適用于同時(shí)測(cè)定小麥中AOH 和AME。

LIANG Yifan 等[39]制備了針對(duì)TeA 的特異性單克隆抗體，建立了ic-ELISA 法檢測(cè)TeA，半數(shù)抑制濃度(IC50)和檢出限分別為18.50 ng/mL 和1.00 ng/mL，在啤酒、蘋果汁和葡萄汁中的平均加標(biāo)回收率為85.0%～120.0%。XIAO Zhili 等[40]用水合肼將異細(xì)交鏈孢菌酮酸(ITeA)衍生化以產(chǎn)生抗原ITeAH，該抗原進(jìn)一步與乙醛酸反應(yīng)生成半抗原ITeAHGA，與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合后用作免疫原。通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備與ITeAH 選擇性結(jié)合的高度特異性的單克隆抗體，用于構(gòu)建異源ic-ELISA法，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為7.8 μg/L，檢出限為0.5 μg/L，食品樣品的加標(biāo)回收率為82.3%～109.8%，該方法與HPLC-MS/MS 方法之間具有良好的相關(guān)性，從而證實(shí)了ic-ELISA 法在食品樣品中ITeA 的篩選和檢測(cè)中的適用性。

3.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析時(shí)酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)測(cè)定光信號(hào)的強(qiáng)弱間接反應(yīng)被測(cè)物濃度，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、方法穩(wěn)定、測(cè)定快速等優(yōu)點(diǎn)[41]。

YAO Chayuan 等[42]以AOH 羧甲基衍生物與載體蛋白作為免疫原，設(shè)計(jì)并合成了一種新的AOH 半抗原，用于誘導(dǎo)產(chǎn)生高質(zhì)量的抗AOH 抗體。采用優(yōu)化后的ic-CLEIA 法檢測(cè)AOH，具有良好的靈敏度，其檢出限為0.068 μg/L，質(zhì)量濃度線性范圍為0.11～1.23 μg/L，果汁和糧谷類樣品的平均加標(biāo)回收率為72.7%～115.8%，變異系數(shù)小于14.3%。ic-CLEIA 法分析結(jié)果與HPLC-MS/MS 法具有很好的關(guān)聯(lián)性，二者分析結(jié)果一致。該方法可以作為檢測(cè)食品樣品中AOH 的一種有效的篩選工具。MAN Yan 等[43]使用金納米粒子(GNP)開(kāi)發(fā)了一種新型微流體免疫比色法用于指示不同濃度的AME，以及利用紫外光譜和智能手機(jī)成像技術(shù)監(jiān)測(cè)金納米粒子的顏色變化。AME-BSA 修飾的磁性納米粒子(MNPs-BSA-AME)用作捕獲探針和快速分離純化，AME 單克隆抗體修飾的金納米粒子(GNP-mAb)用作檢測(cè)探針和信號(hào)放大的催化劑。在574 nm 下微流體免疫比色法能夠檢測(cè)出質(zhì)量濃度為12.5 ng/L 的AME，當(dāng)AME 質(zhì)量濃度為200 ng/L 時(shí)可以使用智能手機(jī)成像技術(shù)檢測(cè)，分析時(shí)間少于15 min。通過(guò)分析加入AME 的水果樣品，紫外光譜、智能手機(jī)成像技術(shù)的加標(biāo)回收率分別為91.19%～94.15%和90.63%～93.9%。

3.3 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是指用固定化的生物體成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為敏感元件的傳感器。一般根據(jù)生物傳感器中分子識(shí)別元件即敏感元件可分為免疫傳感器、酶?jìng)鞲衅鳌⑽⑸飩鞲衅?、?xì)胞傳感器和組織傳感器。目前，對(duì)于鏈格孢霉毒素分析，主要以免疫傳感器技術(shù)為主，同時(shí)使用光敏元件作為信息轉(zhuǎn)換器，利用光學(xué)原理工作的光學(xué)免疫傳感器，是免疫傳感器的重要分支。在利用免疫傳感器技術(shù)時(shí)，不同于大分子，低分子質(zhì)量真菌毒素的檢測(cè)主要基于競(jìng)爭(zhēng)性免疫原理，樣品中待測(cè)物與免疫傳感器標(biāo)記的抗體或抗原競(jìng)爭(zhēng)數(shù)量有限的結(jié)合位點(diǎn)，免疫標(biāo)記信號(hào)隨著待測(cè)物的增加而降低，通過(guò)濃度-信號(hào)關(guān)系，獲得待測(cè)物的含量水平[44]?；谛盘?hào)變化機(jī)制，真菌毒素檢測(cè)中常見(jiàn)的光學(xué)免疫傳感器主要有比色免疫傳感器、熒光免疫傳感器、電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器、表面離子體共振免疫傳感器、電化學(xué)免疫傳感器等[45]。

3.3.1 比色免疫傳感器

MAN Yan 等[46]基于磁性納米粒子(MNP)開(kāi)發(fā)了一種高靈敏性的比色免疫傳感器，通過(guò)非聚集金納米粒子(GNP)檢測(cè)水果中的AME。AMEBSA-Fe3O4MNP 結(jié)合物、游離AME 分子與單克隆抗體(mAb)-GNP 結(jié)合物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)鍵合，經(jīng)磁分離后直接測(cè)量未聚集的GNP 上清液的紫外吸光度，其吸收強(qiáng)度與樣品中AME 的濃度成正比。在優(yōu)化條件下，AME 的檢出限為0.16 ng/mL，質(zhì)量濃度線性范圍為0.08～0.48 μg/L。該比色免疫傳感器與AME 類似物的交叉反應(yīng)性較低，水果樣品的加標(biāo)回收率為80.6%～90.7%。

3.3.2 熒光免疫傳感器

分子印跡聚合物(MIPs)是人工合成的對(duì)給定化合物及其結(jié)構(gòu)類似物有著特異選擇性的理想材料，其作為一種選擇性吸附劑在異構(gòu)體分離、固相萃取、化學(xué)傳感器和模擬生物傳感器等方面應(yīng)用十分廣泛。RICO YUSTE 等[47]利用含有β-二酮基團(tuán)的TeA 可作為Eu(III)離子的螯合配體，誘發(fā)Eu(III)離子在615 nm 的敏化發(fā)光，對(duì)食品中的TeA 進(jìn)行檢測(cè)。使用烯丙基丙二酸二乙酯或乙酰乙酸烯丙酯作為功能單體，將其以不同的摩爾比與分子模板(TeA)和交聯(lián)劑(乙二醇二甲基丙烯酸酯)混合，制備了系列Eu(III)-分子印跡聚合物作為發(fā)光傳感器，用于測(cè)定大米提取物中的TeA，質(zhì)量濃度線性范圍為1.7～20 mg/L，檢出限為0.5 mg/L，并通過(guò)HPLC-DAD 進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

3.3.3 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器

QUíLEZ ALBURQUERQUE 等[48]設(shè)計(jì)了一種能發(fā)紅光、可聚合、對(duì)TeA 敏感的新型釕(II)-聯(lián)吡啶-2，2'-聯(lián)咪唑絡(luò)合物探針，其外圍的N—H 基團(tuán)在水-有機(jī)溶劑混合介質(zhì)中可識(shí)別包括TeA 在內(nèi)的1，3-二羰基化合物的烯醇式結(jié)構(gòu)，當(dāng)二者結(jié)合后，可引起釕(II)的發(fā)光強(qiáng)度和發(fā)光壽命的降低。該探針含有丙烯酸酯基團(tuán)，在TeA 存在下可與甲基丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯發(fā)生自由基聚合，在200 nm 的二氧化硅核心上形成厚度為9 nm的分子印記聚合物殼，從而得到基于MIP 的發(fā)光傳感器(SiO2@Ru-MIP)。SiO2@Ru-MIP 納米復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)TeA 的檢測(cè)響應(yīng)時(shí)間小于5 s，在穩(wěn)態(tài)檢測(cè)和時(shí)間分辨發(fā)光檢測(cè)條件下，該納米復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)TeA的檢出限分別為63.8、75.2 μg/L。

3.3.4 基于適配體的光波導(dǎo)生物傳感器

基于適配體的傳感器，對(duì)多種真菌毒素具有優(yōu)異的識(shí)別能力，由于其具有制備簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快、靈敏度高、成本低以及易于原位測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究人員越來(lái)越多的興趣，在近十年內(nèi)適配體傳感器在食品中真菌毒素檢測(cè)方面得到了快速發(fā)展。適配體對(duì)于開(kāi)發(fā)靈敏且快速的適配體傳感器具有很大的希望，但其長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)且難以識(shí)別關(guān)鍵結(jié)合域(CBD)。WANG Shuo 等[49]設(shè)計(jì)了第一個(gè)用于AOH 檢測(cè)的適配體傳感器，建立了基于縮短和多價(jià)適配體的光波導(dǎo)傳感器超靈敏和快速檢測(cè)小麥中AOH 的方法，而且還提供了制備小分子靶標(biāo)的多價(jià)適配體的方法。該研究中，原始59 nt AOH 適配體的5 nt CBD 確認(rèn)為兩個(gè)AT 堿基對(duì)之間的“C”凸起，將AOH-59 縮短為23 nt 適配體。通過(guò)將一個(gè)或兩個(gè)CBD 加入AOH 6C 中獲得30 nt 二價(jià)適配體B-2-3 (KD=445 nmol/L)和39 nt 三價(jià)適配體T-2-3(KD=274 nmol/L)。 基 于AOH 6C、B-2-3- 和T-2-3的光波導(dǎo)適配體傳感器具有很低的檢出限(S/N=3)，分別為(42±3)、(6±1)、(2±1) fmol/L。以基于AOH 6C 的傳感器檢測(cè)小麥粉中的AOH，其檢出限為0.037 μg/kg，是ELISA 法檢測(cè)得到的檢出限的1/20～1/230。

3.4 快速檢測(cè)試紙和試劑盒

CAI Peiyuan 等[50]篩選出具有高親和力的TeA特異性IgG 單克隆抗體(McAb)，建立了基于單克隆IgG 的高靈敏鉑修飾膠體金免疫檢測(cè)TeA 的方法，其用于TeA 檢測(cè)的ic-ELISA 法的半數(shù)抑制濃度(IC50) 為2.50 μg/L，檢 出 限 為0.17 μg/L。將鉑修飾的金納米粒子(Au @PtNP)優(yōu)化為Au @Pt0.4NP，并將所得的Au @Pt0.4NP 探針設(shè)計(jì)為催化沉淀型四甲基聯(lián)苯胺，目測(cè)檢測(cè)痕量TeA 的檢出限為0.39 μg/L，與現(xiàn)有的膠體金試紙條相比，NP-McAb 試紙條的檢測(cè)靈敏度大大提高。所開(kāi)發(fā)的試紙條可用于檢測(cè)蘋果汁和番茄醬中的TeA，與UHPLC-MS/MS 法的結(jié)果一致，該試紙條可用于快速檢測(cè)實(shí)際樣品中的TeA。

KONG Dezhao 等[51]基于TeA 單克隆抗體開(kāi)發(fā)了一種橫向流動(dòng)免疫層析(ICA)試紙，可用于谷物和果汁中的TeA 分析，其目測(cè)檢出限分別為1 600 μg/kg 和400 μg/L。小麥和蘋果汁樣品的檢出限分別為126.4 ng/g 和65.3 μg/L，所開(kāi)發(fā)的試紙對(duì)TeA 檢測(cè)有效，適用于樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩查。

鐘紅等[52]通過(guò)對(duì)TeA 進(jìn)行衍生化，與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到人工抗原，經(jīng)動(dòng)物免疫獲得特異性多克隆抗體，用ic-ELISA 法檢測(cè)TeA，制備了具有靈敏、快速、高通量、精準(zhǔn)、重復(fù)性高等特性的TeA 快速檢測(cè)試劑盒。MAN Yan 等[53]制備了抗AME 單克隆抗體(mAb)和經(jīng)4-溴丁酸甲酯與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)的AME 免疫原，合成了膠體金納米顆粒(CGN)和CGNs-mAb 結(jié)合物，開(kāi)發(fā)了一種快速、便攜式、半定量的免疫層析試紙條。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法測(cè)定櫻桃和柑橘中AME 的加標(biāo)回收率分別為86.1%和80.7%，目測(cè)檢出限約為10 μg/L。

4 結(jié)語(yǔ)

鏈格孢霉毒素在果蔬、谷物和飼料中均廣泛存在，危害飼養(yǎng)動(dòng)物和人類健康，目前已引起社會(huì)的普遍關(guān)注，因此必須從種植、生產(chǎn)加工和流通等環(huán)節(jié)做好預(yù)防工作并加強(qiáng)檢測(cè)，世界各國(guó)已開(kāi)始制定食品、飼料中鏈格孢霉毒素相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、各種免疫分析和生物傳感器方法被越來(lái)越多地用于鏈格孢霉毒素的檢測(cè)，一些專門針對(duì)食品中鏈格孢霉毒素的快速檢測(cè)儀器將陸續(xù)被推出。但是，目前樣品處理仍舊是個(gè)短板，時(shí)間相對(duì)冗長(zhǎng)，急需發(fā)展高選擇性、高效、高通量的樣品處理技術(shù)。此外，新的高靈敏度分析方法，以及高效、靈敏的樣品處理-分析檢測(cè)聯(lián)用技術(shù)將具有廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用潛力。