高效液相色譜法測定蒲公英提取物中10 種活性物質

李健華，黃錦波

[1.廣東省江門生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，廣東江門 529000； 2.吉姆斯(廣州)實驗技術有限公司，廣州 510000]

蒲公英具有清熱、祛火、解毒和利尿等功效[1]，可用作蔬菜、藥材、飼料與保健品[2]，蒲公英提取物應用范圍更廣[3]。蒲公英在全國各地均有種植，如安徽，東北三省，廣東信宜等。不同產區(qū)的蒲公英提取物中的活性物質有一定的區(qū)別[4]。建立蒲公英提取物中活性物質含量分析方法，既可區(qū)別不同產區(qū)的蒲公英提取物，也可初步判斷哪些地區(qū)的土壤或者氣候條件更適合種植蒲公英，同時也能給相關的種植農戶提供一定的技術參考[5-7]。

目前，測定蒲公英提取物中活性物質的方法主要有液相色譜法[8]和液相色譜-串聯質譜法[9]。楊麗群[10]采用高效液相色譜法測定蒲公英提取物中的咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸；冀新花[11]用高效液相色譜法測定蒲公英提取物中綠原酸；李盛建等[12]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法同時測定蒲公英提取物配方顆粒中綠原酸、咖啡酸等6 種成分的含量；原琦等[13]利用高效液相色譜-質譜法分析蒲公英中4 種有效成分。但筆者參考文獻[14]，采用高效液相色譜-串聯質譜法測定蒲公英提取物中10 種活性物質時發(fā)現，兒茶素需要的霧化溫度高，氮氣消耗量大，不利于控制檢測成本，而綠原酸、α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸在正負模式下無明顯響應。目前采用液相色譜法同時測定蒲公英提取物中兒茶素、紅景天苷、綠原酸、阿魏酸、α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、甘草酸銨、甘草次酸、槲皮素、山奈酚10 種活性物質的研究還未見報道。筆者建立了高效液相色譜法測定蒲公英提取物中上述10 種活性物質的含量，該方法分析效率高，成本低，為進一步研究蒲公英的活性成分提供了一種可行的檢測方法，也可以初步判斷哪些地區(qū)的土壤或者氣候條件更適合種植蒲公英，為相關的種植農戶提供一定的技術參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-1260 型，配有二極管陣列檢測器(DAD)和自動進樣系統，美國安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：BSA224S-CW 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯科學儀器有限公司。

兒茶素、紅景天苷、甘草酸銨對照品：質量分數分別為98.1%、99.7%、94.4%，批號分別為110877-202005、110818-202009、10731-202122，中國食品藥品檢定研究院。

α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸對照品：質量分數分別為99%、98.0%，批號分別為CDCTGS09010039IP、CDCT-C15644200，上海安譜實驗科技股份有限公司。

綠原酸、阿魏酸、甘草次酸、槲皮素、山奈酚純度標準物質：質量分數分別為99.4%、99.8%、99.9%、99.3%、99.5%，編號分別為GBW(E) 09528、GBW(E)09518、GBW(E) 09530、GBW(E) 09526、GBW(E)09525，中國醫(yī)學科學院藥物研究所。

蒲公英提取物樣品：市售。

實驗用水為去離子水，由賽多利斯Sartorius arium?comfort Ⅱ型純水儀制備。

1.2 溶液配制

10 種活性物質混合對照品儲備液：分別稱取兒茶素、紅景天苷、綠原酸、阿魏酸、α-紅沒藥醇、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、甘草酸銨、甘草次酸、槲皮素、山奈酚對照品適量，用甲醇溶解并稀釋至各組分質量濃度均約為1 000 μg/mL 的混合對照品儲備液。

10 種活性物質系列混合標準工作溶液：精密移取10 種活性物質混合對照品儲備液0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL ，分別置于7 只10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，配制成各組分質量濃度均分別為1、5、10、20、40、80、100 μg/mL 的系列混合標準工作溶液。

1.3 色譜條件

色 譜 柱：SCION-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國瓦里安儀器有限公司)；柱溫箱溫度：35℃；檢測波長：兒茶素、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、α-紅沒藥醇為200 nm，甘草酸銨、甘草次酸為272 nm，紅景天苷、綠原酸、阿魏酸為316 nm，槲皮素、山柰酚為366 nm；進樣體積：10 μL；流動相：A 為甲醇，B 為0.2%甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度淋洗程序

1.4 樣品處理

稱取樣品約1 g(精確到0.1 mg)于10 mL 棕色容量瓶中，加入2 mL 水，混勻，超聲15 min，再加入5 mL 甲醇，繼續(xù)超聲15 min，用甲醇稀釋至標線，過濾，即得樣品溶液。

1.5 定量方法

取10 種活性物質系列混合標準工作溶液和樣品溶液，按1.3 色譜條件進樣分析，以待測組分的質量濃度為橫坐標(x)、對應的色譜峰面積為縱坐標(y)繪制標準工作曲線，采用外標法進行定量。樣品中活性物質的質量分數w按照式(1)計算：

式中：w——樣品中活性物質的質量分數，μg/g；

ρ——樣品溶液中活性物質的質量濃度，μg/mL；

V——樣品溶液定容體積，mL；

m——樣品質量，g。

2 結果與討論

2.1 儀器工作條件優(yōu)化

2.1.1 分析波長

采用二極管陣列檢測器在190～400 nm 波長范圍內對樣品溶液進行掃描，結果發(fā)現，兒茶素、α-紅沒藥醇、去二甲愈木酸在200 nm 處響應最強，甘草酸銨、甘草次酸在272 nm 處有較強的吸收，紅景天苷、綠原酸、阿魏酸在316 nm 處有較強的吸收，而槲皮素、山奈酚在366 nm 處的吸收最強，因此選擇兒茶素、α-紅沒藥醇、去二甲愈木酸的分析波長為200 nm，甘草酸銨、甘草次酸的分析波長為272 nm，紅景天苷、綠原酸、阿魏酸的分析波長為316 nm，槲皮素、山奈酚的分析波長為366 nm。

2.1.2 色譜柱

分別選用SCION-C18型反相色譜柱、ZORBAX Rx-SIL 型正相色譜柱和APS-2 Hypercil 型正反兩用色譜柱進行試驗。結果發(fā)現，使用ZORBAX Rx-SIL 型色譜柱時不出峰，使用APS-2 Hypercil 型色譜柱時僅出現1 個色譜峰，而選用SCION-C18型色譜柱時10 種活性物質出峰良好，分離度與響應值均比較理想，因此選用SCION-C18型色譜柱作為分析柱。

2.1.3 流動相配比與流量

參考文獻[15]，選擇甲醇-0.2%甲酸水溶液為流動相。由于10 種活性物質的極性不同，需選擇梯度淋洗方式進行分離。紅景天苷、兒茶素、綠原酸極性相對較大，出峰時間較早，為了延長其出峰時間，在0～10 min 時，水相體積分數保持80%；阿魏酸、槲皮素與山奈酚的極性相對偏中性，出峰時間較兒茶素、綠原酸晚，故在10～30 min 時，水相體積分數由80%逐漸減小到50%；而甘草酸銨、甘草次酸、紅沒藥醇的極性相對較弱，在30～50 min 時，水相體積分數由50%逐漸減小到10%，在50～60 min 時，水相體積分數再從10%調回80%。

一般而言，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(簡稱C18柱)作為分析柱時，流動相的流量越大，目標色譜峰保留時間越小[16]。當流動相流量為1 mL/min 時，紅景天苷色譜峰與兒茶素色譜峰發(fā)生重疊，分離度小于0.5。為了提高色譜峰分離度，在0～10 min 時，流動相流量為0.3 mL/min，在10～30 min 時流量為0.5 mL/min。由于30 min 后目標峰僅余2 個，因此在30～50 min 流動相流量改為1 mL/min，以縮短分析時間，在50～60 min 時，流量則改回0.3 mL/min。

在優(yōu)化的儀器工作條件下，10 種活性物質混合標準溶液和加標樣品溶液的色譜圖分別如圖1 和圖2 所示。

圖1 10 種活性物質混合標準溶液色譜圖

圖2 加標樣品溶液的色譜圖

2.2 線性方程與檢出限

在1.3 色譜條件下，分別測定10 種活性物質系列混合標準工作溶液，以各組分質量濃度為橫坐標(x)、色譜峰面積為縱坐標(y)繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數。

取10 種活性物質的質量濃度均為20 μg/mL的混合標準溶液，用甲醇逐級稀釋，在1.3 色譜條件下進行測定，記錄色譜峰面積，以3 倍信噪比對應的質量濃度作為待測物質的檢出限。

10 種活性物質的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限見表2。

表2 10 種活性物質的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限

2.3 加標回收與精密度試驗

取蒲公英提取物樣品，測定其中10 種活性物質的含量。分別向樣品中添加0.16、0.32、0.8 mL的10 種活性物質混合對照品儲備液，按1.4 方法每種加標濃度水平平行處理6 份樣品溶液，在1.3 色譜條件下分別進行測定，計算各待測物質的加標回收率和測定結果的相對標準偏差，結果見表3。由表3 可知，10 種活性物質的加標回收率為86.2%～104.3%，測定結果的相對標準偏差為0.2%～4.8%。表明該方法具有良好的準確度和精密度，可用于檢測蒲公英提取物中的10 種活性物質。

表3 加標回收與精密度試驗結果

3 結語

建立了高效液相色譜法同時測定蒲公英提取物中10 種活性物質的含量，采取梯度淋洗方式進行分離，利用二極管陣列檢測器檢測，提高了分析效率，降低了分析成本，方法精密度、準確度高。