乳酸菌干燥工藝研究進(jìn)展及在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

唐 輝， 徐奇友， 李愛科， 王薇薇， 陳麗仙， 喬 琳*

（1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000；2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧食品質(zhì)營養(yǎng)研究所，北京 100037）

隨著大規(guī)模、集約化生態(tài)養(yǎng)殖模式的發(fā)展，飼用乳酸菌制劑在畜禽、水產(chǎn)等養(yǎng)殖領(lǐng)域作為飼料添加劑用于促進(jìn)動物生長、動物疾病防治、增強(qiáng)動物免疫力、抑制病原菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面，以安全、有效、無毒副作用等特點逐漸成為飼用抗生素的替代品之一（Kong等，2020）。飼用乳酸菌制劑是由乳酸菌經(jīng)過發(fā)酵、濃縮、包被、干燥等過程制成的固態(tài)菌劑，飼喂動物后通過在動物消化道內(nèi)的定植發(fā)揮益生功能（何江波等，2020）。然而，乳酸菌在加工、運輸、儲存及在動物胃腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程中，常常受到高溫、氧化、機(jī)械、冷凍、酸、膽鹽等逆境環(huán)境的影響而遭受損傷，甚至死亡，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，由于水產(chǎn)飼料在加工過程中普遍進(jìn)行高溫制?；蚺蚧?，往往很難保證飼料中存在足夠數(shù)量的乳酸菌來實現(xiàn)其益生功效（王瑞雪等，2020）。因此，目前很多學(xué)者針對提高乳酸菌存活率的干燥工藝及干燥時的損傷機(jī)制進(jìn)行研究以提高飼用乳酸菌制劑的抗逆性。本文對乳酸菌制劑的干燥工藝、干燥時的損傷機(jī)制及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 乳酸菌的干燥工藝

乳酸菌作為一類益生菌，無論是用作食品添加劑還是飼料添加劑，其發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)與前提是在胃腸道中達(dá)到一定的活菌數(shù)。美國FDA推薦食品中益生菌的活菌數(shù)不低于1.0×106CFU/g或CFU/mL（Tripathi和Giri，2014）。然而，相較于芽孢桿菌、酵母菌等其他益生菌，乳酸菌的抗逆性差，在生產(chǎn)加工、運輸儲存和使用過程中十分容易失活。因此，為了生產(chǎn)出活菌數(shù)高、穩(wěn)定性強(qiáng)的乳酸菌制劑，乳酸菌發(fā)酵液需經(jīng)過特殊的加工處理技術(shù)，包括真空冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥等工藝。

1.1乳酸菌的真空冷凍干燥真空冷凍干燥是19世紀(jì)初出現(xiàn)的用于生物體脫水的技術(shù)，自1909年Shackell將其用于凍干細(xì)菌和血清后，經(jīng)過上百年的發(fā)展，如今已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物制劑的生產(chǎn)及保藏中，真空冷凍干燥工藝是保證乳酸菌存活率與活性的最有效的后處理方法（王威等，2016）。

其技術(shù)原理是根據(jù)水的相平衡關(guān)系：水有固、液、氣三相，隨著壓力的降低，水的冰點變化不大，沸點卻越來越低，并逐漸向冰點靠近，當(dāng)壓力降至一定真空度，冰點沸點重合，固態(tài)水就不經(jīng)液態(tài)直接升華為氣體（余淑嫻等，2007）。乳酸菌的凍干就是利用這一原理，主要可分為預(yù)凍、一次干燥、二次干燥三個過程。乳酸菌發(fā)酵液通過預(yù)冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的液體凍結(jié)成固態(tài)；一次干燥除去細(xì)胞內(nèi)外的自由水，二次干燥除去部分結(jié)合水，一次干燥后殘余水分含量為5%，二次干燥后殘余水分含量僅為1%（Assegehegn等，2019）。使用此方法所得的干燥菌粉水分含量低，微生物的代謝活動緩慢，生長繁殖受到抑制，但不會失去活力，干制品保持原有骨架結(jié)構(gòu)和形態(tài)，由于干燥是在真空狀態(tài)下進(jìn)行，隔絕了氧氣，因此一些易氧化的物質(zhì)得到了保護(hù)，且凍干制品是直接由冰晶升華而制成的，因而具有多孔結(jié)構(gòu)，具有理想的速溶性和迅速復(fù)水性（Ferronatto等，2021；胡方洋等，2020）。

然而，冷凍干燥可能導(dǎo)致細(xì)胞的膜損傷，蛋白質(zhì)、DNA變性等，導(dǎo)致細(xì)胞活性和活力的喪失，保護(hù)劑在真空冷凍干燥過程中對保持細(xì)胞活力具有重要作用（Fonseca等，2015）。許多冷凍保護(hù)劑，如糖類、蛋白質(zhì)、維生素等已被用于在冷凍干燥和隨后的儲存過程中盡量減少細(xì)胞活力的損失。辛國芹等（2021）使用25%脫脂奶粉、7.5%海藻糖、0.75%甘油做植物乳桿菌BLPS-9的凍干保護(hù)劑，凍干后其存活率為91.01%，凍干菌粉活菌數(shù)可達(dá)6×1011CFU/g，在4℃和-20℃條件下儲存28 d后菌粉活菌數(shù)無明顯損失，具有較好的應(yīng)用價值。張雅碩等（2019）在優(yōu)化副干酪乳桿菌的凍干保護(hù)劑過程中，以15%脫脂奶粉、20%蔗糖、7%聚乙烯吡咯烷酮、1.3%谷胱甘肽為復(fù)合保護(hù)劑，經(jīng)-196℃下預(yù)凍15 min后凍干，凍干后存活率為99.8%，菌粉活菌數(shù)達(dá)到2.4×1011CFU/g，在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌體結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)飽滿，表明復(fù)合保護(hù)劑對細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。Savedboworn等（2017）使用蛋白質(zhì)和海藻糖的混合物作保護(hù)劑對植物乳桿菌進(jìn)行真空冷凍干燥，在-18℃條件下預(yù)凍17 h后，轉(zhuǎn)入0.110 mBar、-50℃的真空冷凍干燥機(jī)中凍干18 h后，其存活率為98.13%，將凍干后菌粉在4℃條件下貯藏168 d，對其進(jìn)行穩(wěn)定性評估，結(jié)果表明，凍干菌粉在長期儲存過程中仍保持較低含水量和較高的活菌數(shù)，含水量為2.13%，菌粉活菌數(shù)為9.22 log CFU/g。Jofré等（2015）在凍干鼠李糖乳桿菌時使用葡萄糖、乳糖、脫脂乳混合物作為凍干保護(hù)劑，凍干后其存活率高于94%，顯著高于單獨使用或不使用保護(hù)劑后的存活率。周佳豪等（2020）用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.0%海藻糖、8.5%低聚木糖、11.5%脫脂乳粉、1.0%谷氨酸鈉的混合保護(hù)劑凍干干酪乳桿菌，凍干后存活率為98.24%，顯著高于未添加保護(hù)劑的菌劑存活率79.24%。

雖然真空冷凍干燥是一種常用且成熟的干燥技術(shù)，但其也有缺點，真空冷凍干燥工藝設(shè)備投資大，生產(chǎn)周期長，能源消耗高，是一種昂貴且分批的生產(chǎn)過程（Broeckx等，2016）。高昂的成本致使使用真空冷凍干燥工藝生產(chǎn)的乳酸菌制劑很難用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。

1.2乳酸菌的噴霧干燥 噴霧干燥是通過蠕動泵將乳酸菌發(fā)酵液和載體的混合液輸送到霧化器霧化成微小液滴后在干燥室高溫空氣的作用下快速傳熱傳質(zhì)，完成干燥并形成顆粒的過程，是一種經(jīng)濟(jì)、高效的菌粉生產(chǎn)工藝，噴霧干燥生產(chǎn)的菌粉流動性好、含水量低、顆粒均勻，且成本較真空冷凍干燥低4~7倍（Sosnik等，2015；Golowczyc等，2011）。

噴霧干燥過程一般可分為恒速干燥和降速干燥兩個階段：霧化的液滴與高溫氣流接觸后，表面的水分在高溫作用下，快速蒸發(fā)，由于液滴表面的水分充足，因此干燥的速率維持恒定，隨著干燥的進(jìn)行，液滴內(nèi)溶解的溶質(zhì)積累到細(xì)胞表面及細(xì)胞表面的水分的減少，水分蒸發(fā)緩慢，便進(jìn)入降速干燥階段，此過程由于細(xì)胞和高溫氣流直接接觸，且細(xì)胞大量脫水，因此對細(xì)胞的損傷一般發(fā)生在此階段（蔣曉瑩，2019）。根據(jù)空氣和液體進(jìn)入干燥室的方向，可分為并流、逆流和混流三種模式，因為乳酸菌對溫度很敏感，因此通常采用并流方式，即液滴和氣體同時從一個方向進(jìn)入干燥室，在這種模式下，最濕的液滴與最高溫度接觸，最干燥的顆粒與最低溫度接觸，從而減少溫度對乳酸菌的損傷（Broeckx等，2016）。Ananta等（2005）研究表明，乳酸菌噴霧干燥后的存活率與在干燥室停留的時間和出口溫度密切相關(guān)，停留時間長，出口溫度高，對乳酸菌損傷大，增加進(jìn)口溫度能加快干燥速率從而減短停留時間，但進(jìn)口溫度的升高會增加溫度對乳酸菌造成的損傷，因此尋找合適的進(jìn)出口溫度對保證乳酸菌存活率至關(guān)重要。劉博等（2017）在優(yōu)化羅伊氏乳桿菌噴霧干燥條件時發(fā)現(xiàn)，控制出口溫度為80℃時，羅伊氏乳桿菌存活率隨著進(jìn)口溫度在110~150℃內(nèi)升高而降低；控制進(jìn)口溫度為120℃時，羅伊氏乳桿菌的存活率隨著出口溫度在50~90℃內(nèi)的升高而降低。熊濤等（2015）在制備植物乳桿菌NCU116發(fā)酵劑的過程中，進(jìn)風(fēng)溫度為125℃時，干燥后菌粉存活率為89.95%，活菌數(shù)為10.96 log CFU/mL，進(jìn)風(fēng)溫度為140℃時，存活率為60%，活菌數(shù)為9.8 log CFU/mL。

雖然噴霧干燥處理量大、成本低、效率高，但是處理溫度通常都會高于70℃，導(dǎo)致微生物細(xì)胞受到的高溫脅迫也是最大的，細(xì)胞存活率與活性會受到很大的影響。蔣艾廷等（2019）發(fā)現(xiàn)，在溫度高于50℃時，乳酸菌的可培養(yǎng)性顯著下降，噴霧干燥時，己糖激酶、乳酸脫氫酶、ATP酶等關(guān)鍵酶活性顯著降低，且產(chǎn)酸性能下降。同時，在噴霧干燥時，菌體在高滲、氧化、機(jī)械應(yīng)力逆境條件下，菌體的膜蛋白、膜脂質(zhì)、甚至遺傳物質(zhì)DNA會遭受嚴(yán)重?fù)p傷，造成菌體存活率降低（王瑞雪等，2020）。此外，隨著細(xì)胞在干燥室的下降及細(xì)胞表面水分的流失，細(xì)胞會直接和高溫空氣接觸并升溫直至出口溫度，因此乳酸菌在干燥室的停留時間和出口溫度及含水量成為影響乳酸菌干燥后存活率的重要因素。公丕民（2019）在保加利亞乳桿菌噴霧干燥的研究中發(fā)現(xiàn)，在出口溫度為70℃時，細(xì)胞會遭受熱損傷和脫水損傷，而在60℃時，細(xì)胞僅遭受脫水損傷，且隨著出口溫度的降低，細(xì)胞的存活率升高。同時，Gong等（2019）指出在出口溫度為70℃，液滴含水量低于0.31 g/g時，保加利亞乳桿菌的存活率急速降低的原因是細(xì)胞和熱空氣直接接觸造成的。Ananta等（2005）在噴霧干燥鼠李糖乳桿菌時發(fā)現(xiàn)，膜損傷是細(xì)胞死亡的主要原因，且隨著出口溫度的升高，膜解體程度逐漸增加。

1.3乳酸菌的流化床干燥 流化床干燥是將乳酸菌發(fā)酵液霧化噴涂到通過空氣流化的固體顆粒載體上或是對含有菌體的流化固體顆粒進(jìn)行干燥的一種方法（Broeckx等，2016）。干燥時可以用設(shè)定好溫度的氣流對物料進(jìn)行干燥，溫度可以根據(jù)物料性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，與噴霧干燥相比，因其溫和的溫度和良好的傳質(zhì)效率，可以實現(xiàn)物料在低溫條件下的高效干燥，干燥的成本與噴霧干燥相當(dāng)或略低于噴霧干燥，該工藝也適用于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，干燥時間（從1 min到2 h）比噴霧干燥長，但是熱失活可以最小化，因此更適合乳酸菌等熱敏物質(zhì)的干燥處理（趙強(qiáng)強(qiáng)等，2020）。

Wirunpan等（2016）將乳酸桿菌1464添加到蝦飼料中使用流化床工藝進(jìn)行干燥，在進(jìn)氣溫度為50℃時，飼料顆粒水分由26.5%降至11%以下僅需50 min，且進(jìn)風(fēng)溫度越高，達(dá)到平衡含水量時間越短，在進(jìn)風(fēng)溫度為50~80℃時相應(yīng)的菌株存活率為96.87%~89.54%。Toledo等（2010）將短乳桿菌添加到魚飼料中使用流化床工藝進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為40℃，2 mm和4 mm魚飼料顆粒分別干燥40 min和60 min后，其含水量分別約為5%和7%，干燥后的活菌數(shù)分別為8.8、8.9 log CFU/g，在4℃條件下存儲42 d后，其存活率分別為87.5%、93.26%。Mille等（2004）發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)氣溫度為35℃、空氣流速為1300 L/min條件下流化床干燥30 min后，酪蛋白粉中的植物乳桿菌存活率為80%。根據(jù)Nag等（2013）的研究，流化床干燥能保持干酪乳桿菌在25℃條件下儲存12周后活菌數(shù)仍保持為7.7 log CFU/g。

相比成本高昂的真空冷凍干燥及處理溫度高的噴霧干燥，流化床干燥工藝成本低、溫度溫和、效率高，是處理乳酸菌的有效方法。然而流化床干燥也會導(dǎo)致菌體的死亡等應(yīng)激反應(yīng)，所以有必要考察流化床干燥過程中影響乳酸菌存活率和穩(wěn)定性的因素，其中優(yōu)化保護(hù)劑配方及干燥工藝是提高乳酸菌在流化床干燥后存活率及在逆境環(huán)境下保持穩(wěn)定的有效策略。

用于乳酸菌流化床干燥的保護(hù)劑可以是單一物質(zhì)，也可以是混合物。常用的保護(hù)劑主要由糖類和蛋白質(zhì)構(gòu)成，也可以是小分子的氨基酸、山梨醇、谷氨酸鈉和抗壞血酸等相溶性介質(zhì)。Strasser等（2007）在使用流化床干燥屎腸球菌時，以葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麥芽糖糊精的混合物做保護(hù)劑，結(jié)果表明，添加保護(hù)劑的細(xì)胞干燥后存活率為70%，而不添加保護(hù)劑的細(xì)胞干燥后存活率僅為10%。Stummer等（2012）使用脫脂乳作為屎腸球菌M74的流化床干燥保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)干燥后細(xì)胞的可培養(yǎng)性顯著高于不添加保護(hù)劑的對照組，添加100%脫脂乳后干燥細(xì)胞與新鮮細(xì)胞的可培養(yǎng)性無顯著性差異，添加脫脂乳相比不添加脫脂乳干燥后細(xì)胞的相對PI強(qiáng)度和相對DHR123強(qiáng)度均顯著降低。由此可見，添加保護(hù)劑對乳酸菌在干燥、儲存時保持活性具有積極意義。

研究流化床干燥的工藝變量和工藝條件對提升乳酸菌細(xì)胞活力具有顯著影響。干燥時選擇合適的細(xì)胞載體、包衣材料，對流化床干燥后制劑的顆粒形狀、流動性以及存活率至關(guān)重要，載體、包衣材料不規(guī)則或具有黏性會導(dǎo)致床層不均勻，顆粒結(jié)塊及干燥速率降低，常用的流化床干燥載體材料有脫脂乳、馬鈴薯淀粉、藻酸鹽和酪蛋白（Santivarangkna等，2010a）。此外，干燥時溫度過高、較大的霧化壓力及流速會造成細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞以及干燥不均勻甚至結(jié)塊。Azim等（2012）使用流化床工藝對凍干羅伊氏乳桿菌C10菌粉使用硬脂酸進(jìn)行包衣時發(fā)現(xiàn)，在70℃下呈熔融狀態(tài)的硬脂酸以流速為40 g/min的速率傳輸?shù)竭_(dá)噴頭時，其溫度往往低于熔點，硬脂酸凝固，造成管道堵塞，為了保證硬脂酸在到達(dá)噴頭時，仍保持熔融狀態(tài)，研究者選擇在150℃條件下融化硬脂酸，同時流速增加到80 g/min以減少熱量在管道內(nèi)的散失，保證在到達(dá)噴頭時入口溫度為70℃以上，然而，隨著硬脂酸包被羅伊氏乳桿菌過程的進(jìn)行，硬脂酸在流化床干燥室內(nèi)上層快速積累，并落到床層底部，影響下部物料的循環(huán)，最終在流化床干燥室內(nèi)形成一個大團(tuán)塊，造成濕式死床。Bensch等（2014）將植物乳桿菌菌懸液和D-山梨醇混合后噴涂到麥芽糊精載體上，控制工藝參數(shù)為：進(jìn)風(fēng)溫度40℃、空氣流量85 kg/h、床層溫度36℃、霧化壓力4 Bar，雖然在干燥過程中觀察到膜完整性的喪失，但仍成功制備出活菌數(shù)為2.7×109CFU/g的菌粉，可見控制流化床工藝參數(shù)對保證乳酸菌存活率的重要性。此外，干燥后的含水量也是影響乳酸菌制劑儲存穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，含水量5%~10%被認(rèn)為是保證乳酸菌制劑穩(wěn)定儲存的合理范圍（Toledo等，2010）。

使用流化床工藝對乳酸菌進(jìn)行多層包被也是一種提高乳酸菌干燥后穩(wěn)定性的有效方法。乳酸菌的包被是采用天然或合成高分子材料（壁材）將乳酸菌（芯材）包裹起來形成封閉微型膠囊的技術(shù)（紀(jì)瑞等，2018）。包被后形成的微膠囊主要有壁材完全包被芯材的儲集型、芯材分散在壁材內(nèi)部或表面的基質(zhì)型以及包被后再包衣的涂層基質(zhì)型三種類型（吳軍林等，2019）。與擠壓、乳化、噴霧包埋方法相比，使用流化床的工藝對乳酸菌進(jìn)行包被可使制粒、干燥、包衣在一個過程中完成，包被時，芯材（添加或不添加保護(hù)劑）被置于流化床干燥器底部通有熱空氣的床層，并在空氣作用下流化，壁材溶液則通過頂部的霧化裝置噴灑到芯材上最終形成微膠囊。然而包埋形成的微膠囊，通常由于壁材與流動氣流的原因，造成微膠囊結(jié)構(gòu)的高孔隙率，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，因此常常需對微膠囊進(jìn)行包被，即雙層或多層包被（Laelorspoen等，2014；Mokarram等，2009）。Pitigraisorn等（2017）使用流化床方法對嗜酸乳桿菌的海藻酸鹽微膠囊使用雞蛋蛋白和硬脂酸鎂進(jìn)行包衣，發(fā)現(xiàn)未包衣的海藻酸鹽微膠囊由于水分溢出，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)塌陷，而包衣的膠囊則結(jié)構(gòu)完整，暴露于70℃、相對濕度為100%的環(huán)境中30 min后，包衣的微膠囊菌株活性僅降低了0.6~1.3 log CFU/g，而未經(jīng)過包衣的微膠囊菌株活性降低了3.3 log CFU/g。Schell和Beermann（2014）將蟲膠通過流化床頂噴的方式對羅伊氏乳桿菌的甜乳清微膠囊進(jìn)行包衣，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過包衣的微膠囊在4℃避光條件下儲存28 d后菌落數(shù)顯著高于未經(jīng)過包衣的甜乳清微膠囊，在模擬胃腸道的條件下經(jīng)過蟲膠包衣的存活率為76.74%，而未經(jīng)蟲膠包衣的存活率僅為25%。

2 干燥對乳酸菌的損傷機(jī)制

干燥期間，乳酸菌在高溫、脫水、滲透壓、氧化、機(jī)械等逆境條件下會遭受損傷，對細(xì)胞的功能性結(jié)構(gòu)和組分包括膜脂質(zhì)、膜蛋白、酶、胞內(nèi)蛋白、細(xì)胞器、遺傳物質(zhì)等造成不可逆改變，其中，熱損傷、脫水損傷和冷凍損傷被認(rèn)為是造成乳酸菌干燥時損傷的主要因素（李明慧等，2018；Peighambardoust等，2011）。

2.1熱損傷 細(xì)胞內(nèi)多種生物組分及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有熱敏性，這些組分在高溫作用下變性或破壞會導(dǎo)致細(xì)胞代謝及生理功能紊亂，甚至死亡。Teixeira等（2010）利用DSC技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在熱處理保加利亞乳桿菌時，64℃以下細(xì)胞膜被破壞，65℃以上細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)等細(xì)胞組分被破壞，69℃時核糖體被破壞，90℃時DNA被破壞。而有研究者指出，DNA變性所需的溫度高于殺死乳酸菌的溫度，因此，具有活性的乳酸菌DNA的破壞通常不被認(rèn)為由高溫造成，但值得注意的是，作為合成蛋白質(zhì)主要場所的核糖體在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量通常超過10000個，其在高溫作用下發(fā)生不可逆失活或破壞會直接影響細(xì)胞基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能異常或死亡（Miles，2006）。此外，高溫通常會打開酶等生物大分子的高階結(jié)構(gòu)，打破單體單元間的連接，從而影響生物大分子的活性。綦曉青（2016）發(fā)現(xiàn)，微生物在高溫下乳酸脫氫酶的活性會顯著降低，而乳酸脫氫酶是催化細(xì)胞膜脂肪酸鏈去飽和的重要酶，可提高脂肪酸鏈的不飽和度，提高細(xì)胞膜的流動性，乳酸脫氫酶活性的降低，造成細(xì)胞膜流動性大大降低，對菌株造成損傷。另有研究表明高溫會破壞乳酸菌細(xì)胞壁S層蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其與肽聚糖的交聯(lián)受到抑制，從而影響細(xì)胞壁的生理功能（張曉寧，2019）。

2.2脫水損傷 水是維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的必需成分，無論采取何種方式的干燥，脫水都是造成細(xì)胞損傷和死亡的原因之一，維持細(xì)菌正常生理狀態(tài)的最低水分含量是33.33%，維持乳酸菌制劑長時間儲藏的基本要求是殘余水分含量低于7%，水分活度低于0.25（Peighambardoust等，2011）。脫水時，細(xì)胞內(nèi)含量較多的自由水的喪失對細(xì)胞的損傷較小，反而是含量較少且與胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合水的喪失才是引起細(xì)胞損傷與死亡的主要原因，脫水引起的細(xì)胞損傷位點主要有細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。

細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層構(gòu)成，磷脂分子的極性頭部之間通過氫鍵與水分子相連，各分子間通過疏水作用和范德華力維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和保證流動性。當(dāng)脫水時，磷脂分子極性頭部之間連接的水分子被除去，導(dǎo)致極性頭部之間出現(xiàn)空缺，穩(wěn)定的雙分子層結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜由流動的液晶相轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃拥哪z相，細(xì)胞膜的流動性是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，流動性的喪失導(dǎo)致膜上酶及轉(zhuǎn)運蛋白等功能受到影響，造成細(xì)胞死亡（Shi等，2018）。

隨著細(xì)胞脫水，細(xì)胞質(zhì)的黏性逐漸增大，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)黏度達(dá)到1014Pa/s時，細(xì)胞質(zhì)會進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，玻璃化是一種亞穩(wěn)定狀態(tài)，同時具有固體和流體的特性，這種特性有助于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，阻止胞內(nèi)化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)的變化與擴(kuò)散，遏制脫水時細(xì)胞損傷的進(jìn)一步發(fā)生（Fernanda等，2016）。細(xì)胞發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變時的溫度稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，只有溫度低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度才會發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，水含量越低，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度越低，在干燥時，由于水分的喪失，即使使用流化床工藝對物料進(jìn)行干燥，細(xì)胞質(zhì)也很難發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，但在干燥后的低溫儲存過程中，細(xì)胞質(zhì)會發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變（Khalloufi等，2010）。

2.3冷凍損傷 真空冷凍干燥是保存乳酸菌最方便最成功的方法，然而，真空冷凍干燥不可避免地對乳酸菌造成損傷，導(dǎo)致活性降低甚至死亡。

在冷凍干燥前，一般會對乳酸菌進(jìn)行預(yù)冷凍，在超低溫下細(xì)胞內(nèi)大量水分快速形成冰晶，對細(xì)胞膜、細(xì)胞器、核膜等造成機(jī)械損傷，冰晶的大小跟預(yù)凍溫度有關(guān)，預(yù)凍溫度低，凍結(jié)速率快，細(xì)胞內(nèi)水分還未滲透出細(xì)胞，形成的冰晶大；相反，預(yù)凍溫度高，形成的冰晶??；冰晶越大，對細(xì)胞的損傷越大（牛春華等，2019）。王飚等（2009）在冷凍干燥德氏乳桿菌時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜的通透性顯著增加，細(xì)胞的活性大大降低。Castro等（1996）發(fā)現(xiàn)在冷凍干燥保加利亞乳桿菌前后，細(xì)胞內(nèi)外的K+和Na+的比例發(fā)生了很大的改變，表明細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變。此外，在低溫下，細(xì)胞膜上的飽和脂肪酸含量會升高，不飽和脂肪酸含量會降低，細(xì)胞膜的流動性降低，導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常（吳文茹等，2017）。

真空冷凍干燥還會造成乳酸菌DNA構(gòu)象的改變，Hlaing等（2017）報道稱鼠李糖乳桿菌GG在真空冷凍干燥過程中，其DNA由B型構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)锳型構(gòu)象，相較于B型構(gòu)象，A型構(gòu)象的結(jié)構(gòu)更緊密，不利于轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶的結(jié)合，從而影響基因的表達(dá)。Santivarangkna等（2010b）利用傅利葉-紅外光譜技術(shù)（FT-IR）觀察細(xì)胞的FT-IR圖譜猜想，冷凍干燥瑞士乳桿菌細(xì)胞生理損傷的原因可能是DNA/RNA的改變。

此外，由于細(xì)胞內(nèi)外液組成的不同，電解質(zhì)濃度不同，在冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)外液結(jié)冰不同步，一般是凝固點稍高的細(xì)胞外液先結(jié)冰，造成細(xì)胞外液溶質(zhì)濃度升高，滲透壓高于細(xì)胞內(nèi)液滲透壓，為維持滲透壓平衡，細(xì)胞內(nèi)液中水分或者溢出到細(xì)胞外，降低細(xì)胞外液濃度，或者在胞內(nèi)結(jié)冰，提高細(xì)胞內(nèi)液濃度，這種細(xì)胞內(nèi)外液溶質(zhì)濃度都升高的效應(yīng)被稱為溶質(zhì)效應(yīng)（李寶磊，2011）。這種效應(yīng)通常會導(dǎo)致兩種損傷：（1）胞內(nèi)水分大量溢出，造成脫水，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性大幅增加，喪失物質(zhì)屏障功能，胞內(nèi)外溶質(zhì)相互滲透，細(xì)胞代謝紊亂，細(xì)胞死亡；（2）胞內(nèi)的高電解質(zhì)環(huán)境導(dǎo)致功能性蛋白高級結(jié)構(gòu)的破壞，喪失生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷（Waghmare等，2021）。

3 乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

隨著人們對水產(chǎn)品需求的增大，在資源有限的條件下，促生長類抗生素的使用在一定程度上強(qiáng)化了水產(chǎn)品的產(chǎn)量和效益，但藥品殘留卻易導(dǎo)致環(huán)境退化、抗性致病菌株的產(chǎn)生、抗生素在生物體內(nèi)積累等問題，為解決這類問題，乳酸菌制劑以其獨特的優(yōu)越性逐漸成為促生長類抗生素替代品之一（Zhang等，2015）。研究表明，乳酸菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有著很好的效果。

3.1促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長 乳酸菌能改善水產(chǎn)動物的生長性能，降低餌料系數(shù)，提高水產(chǎn)品產(chǎn)量。Giri等（2013）在高露斯塔野鯪基礎(chǔ)飼料中添加1.0×1010CFU/g的植物乳桿菌VSG3并飼喂60 d后，試驗組的魚體增重為125.66 g，顯著高于不添加植物乳桿菌VSG3的對照組120 g；試驗組特定生長率為1.88%，與對照組的1.83%之間具有顯著性差異，試驗組餌料系數(shù)為1.57顯著低于對照組1.71。Wang等（2008）向尼羅羅非魚養(yǎng)殖缸中添加1.0×107CFU/mL的屎腸球菌ZJ4，考察菌株ZJ4對尼羅羅非魚生長性能的影響，結(jié)果表明，與不添加屎腸球菌ZJ4的對照組相比，試驗組尼羅羅非魚日增重顯著升高。Wang和Gu（2010）給凡納濱對蝦飼喂含有1.0×107CFU/mL嗜酸乳桿菌RS058的飼料，養(yǎng)殖35 d后，試驗組日增重較對照組顯著提升。鄭玉等（2017）在凡納濱對蝦飼料中拌喂植物乳桿菌，發(fā)現(xiàn)試驗組的存活率和特定生長率顯著增加，餌料系數(shù)顯著降低。

3.2調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物腸道菌群 正常動物腸道中棲居著大量的微生物菌群，受遺傳、飲食和自然條件等多種因素的影響，它們不僅與宿主之間保持著一種動態(tài)平衡關(guān)系，菌群與菌群間也存在一定比例的聯(lián)系，即動物腸道的微生態(tài)平衡（Shen等，2006）。腸道菌群與生物體的健康有著密切的關(guān)系，并且對宿主的營養(yǎng)吸收、免疫應(yīng)答和腸黏膜的形態(tài)都有影響（Sha等，2016）。研究表明，水產(chǎn)動物腸道中主要微生物類群為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門 （Gao等，2014；Roeselers等，2011）。Gao等（2014）發(fā)現(xiàn)變形菌門細(xì)菌是養(yǎng)殖池塘刺參腸道內(nèi)第一優(yōu)勢菌群。Huang等（2016）發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌門以變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門為主。

乳酸菌能通過競爭營養(yǎng)、分泌代謝產(chǎn)物、競爭定植位點等方式調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物的腸道菌群（崔艷紅等，2018）。Sha等（2016）發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌及其上清液能顯著提高凡納濱對蝦腸道內(nèi)放線菌的豐度。夏雨等（2020）通過LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌YRL45能提高赤桿菌屬的豐度，降低凡納濱對蝦腸道內(nèi)的致病菌發(fā)光桿菌屬的豐度，減少其對腸道菌群的影響。Sun等（2012）使用含有1.0×108CFU/g屎腸球菌的飼料飼喂斑馬魚60 d后發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中后腸的物種豐富度和Shannon指數(shù)均顯著高于對照組，變性梯度凝膠電泳條帶與序列分析比對表明，屎腸球菌特異性增加了斑馬魚腸道中變形菌門、放線菌門和潛在益生菌物種。Zhang等（2014）在黑鯛飼料中添加乳酸菌發(fā)現(xiàn)，其腸道微生物菌群的DGGE圖譜的條帶數(shù)顯著增加。

3.3抑制致病菌 水產(chǎn)動物生活的水體環(huán)境存在許多致病菌，如球菌、弧菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌等，致病情況取決于水體中病原菌的濃度及機(jī)體免疫力的高低。乳酸菌主要通過兩種途徑抑制病原菌，一種是乳酸菌可產(chǎn)生乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素等多種代謝產(chǎn)物，乳酸與過氧化氫使腸道pH維持在較低水平，迫使大部分常見病原菌無適宜的生長環(huán)境，細(xì)菌素對葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌具有拮抗作用；另一種抑菌途徑是乳酸菌在腸道內(nèi)的定植可競爭病原菌的營養(yǎng)物質(zhì)和定植位點（曲木等，2021）。

Feng等（2019）從鯉魚腸道內(nèi)分離出多株乳酸乳球菌，體外條件下發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、尤其是嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用（抑菌圈>17 mm），能降低嗜水氣單胞菌對鯉魚腸液黏蛋白的黏附作用。劉長軍（2018）發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能通過增強(qiáng)羅非魚的中腸黏多糖的分泌量和提高NFkB、TNF-α和IL-10細(xì)胞因子的表達(dá)來增強(qiáng)抗病力，降低嗜水氣單胞菌攻毒后的死亡率。Dash等（2015）的研究結(jié)果表明，植物乳桿菌能提高羅氏沼蝦免疫能力，有效促進(jìn)羅氏沼蝦生長，提高對弧菌的抗病力，這與Kongnum等（2012）在飼料中拌喂植物乳桿菌提高凡納濱對蝦對弧菌抵抗力的結(jié)論一致。

3.4調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物的免疫力 目前，乳酸菌調(diào)節(jié)宿主免疫機(jī)能的機(jī)理尚不明確，可能是通過菌體表面的大分子糖類和蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)或是代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)宿主的免疫活性（曲木等，2021）。目前的研究表明，乳酸菌能通過提高水產(chǎn)動物的非特異性免疫來增強(qiáng)水產(chǎn)動物的整體抗病力。Wang等（2008）在尼羅羅非魚的養(yǎng)殖缸中添加屎腸球菌ZJ4，羅非魚的髓過氧化物酶活性和吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活動顯著提高，髓過氧化物酶利用氧化自由基產(chǎn)生次氯酸，具有殺死病原體的能力，吞噬細(xì)胞在呼吸爆發(fā)期間，能產(chǎn)生超氧陰離子及其活性衍生物，這些衍生物具有強(qiáng)大的殺菌活性，從而增強(qiáng)羅非魚的免疫力。Yang等（2019）使用含屎腸球菌Y17的飼料飼喂擬穴青蟹6周后，擬穴青蟹血清超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組。鄭玉等（2017）分別將融合乳桿菌和植物乳桿菌以拌料方式投喂凡納濱對蝦飼養(yǎng)8周后，凡納濱對蝦血清堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性較對照組均顯著升高。Dash等（2014）使用植物乳桿菌作為飼料添加劑飼喂羅氏沼蝦90 d后，羅氏沼蝦酚氧化酶活性顯著高于對照組，試驗組的嗜水氣單胞菌清除率為48%~72%，對照組為38%。Tarkhania等（2020）對里海擬鯉投喂含1.0×107CFU/g屎腸球菌的飼料，8周后，里海擬鯉血清溶菌酶和堿性磷酸酶活性較對照組顯著增加。以上結(jié)果表明乳酸菌通過增強(qiáng)參與非特異性免疫相關(guān)的酶活性來提高水產(chǎn)動物的免疫力，從而防止細(xì)菌病毒的侵染。

4 展望

飼用乳酸菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用，不僅能解決大規(guī)模集約化養(yǎng)殖帶來的水產(chǎn)動物病害防控難題，同時也能解決以往化學(xué)藥物和抗生素過量使用對生態(tài)環(huán)境的破壞，逐漸成為抗生素的優(yōu)良替代品之一。然而，乳酸菌的低抗逆性限制了飼用乳酸菌制劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用，制備出高活性高抗逆性的飼用乳酸菌制劑是近年來研究者面臨的挑戰(zhàn)。與真空冷凍干燥和噴霧干燥相比，處理條件溫和的流化床干燥不僅節(jié)約了成本，還降低了高溫對乳酸菌的損傷，對于提升飼用乳酸菌制劑的抗逆性具有很大的應(yīng)用潛力，因此研究乳酸菌的流化床干燥保護(hù)劑、制粒包衣工藝、干燥時的損傷機(jī)制對制備出高活性高抗逆性的乳酸菌制劑并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有實際意義。