羊棲菜多酚通過核轉錄因子-κB/絲裂原活化蛋白激酶通路緩解脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥反應

黃 平，洪靜霞，米 杰，張攀學，李 超，楊文鴿

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

炎癥是宿主應對感染、細胞應激或組織損傷的一種防御適應性反應，受多種信號通路調控，以保證炎癥過程的啟動、維持和消退[1-2]。當機體免疫反應異?；钴S，可引起過度炎癥，導致細胞和組織損傷[3]。巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過執(zhí)行多種功能（吞噬、產生和分泌多種細胞因子和生長因子）參與免疫調節(jié)[4]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又稱內毒素，為革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的組成成分，可作用于膜受體激活多種細胞（巨噬細胞、上皮細胞、內皮細胞等）信號轉導系統(tǒng)，促進促炎細胞因子和其他炎性介質的合成及釋放，引發(fā)炎癥反應[5]。LPS激活巨噬細胞的過程主要包括：巨噬細胞膜上Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）識別LPS，使TLR4胞內的基團構象發(fā)生變化，將信號傳入胞內，激活細胞中多種蛋白質磷酸化級聯(lián)反應鏈，最終激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）和核轉錄因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路，促進多種炎癥介質的基因轉錄和蛋白表達，如一氧化氮（NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其上游炎癥酶誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6等[6-7]。

羊棲菜（Hizikia fusiformis）作為一種可食性褐藻，廣泛分布于我國浙江沿海一帶，富含多種活性物質，營養(yǎng)價值高[8]。羊棲菜多酚（Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs）是羊棲菜中重要活性物質之一，約占藻體干質量的2%，HFPs主要為間苯三酚衍生物及連苯三酚衍生物，具有抗氧化[9]、抗菌[10]、抗炎[11]及抑制代謝酶[12]等作用。倪立穎等[11]采用LPS刺激胚胎期斑馬魚建立體內炎癥模型，評估HFPs提取物的抗炎活性，結果表明HFPs提取物顯著降低胚胎斑馬魚體內NO水平、細胞死亡率和活性氧生成率。Yang等[13]在研究HFPs體外抗炎功效時發(fā)現，其減少了巨噬細胞促炎因子（NO、IL-6和TNF-α）的分泌。目前，有關HFPs抗炎作用的報道主要集中于其對部分炎性介質的影響，而缺乏系統(tǒng)而深入的機制研究。本研究采用LPS誘導RAW264.7巨噬細胞建立體外炎癥模型，基于MAPKs和NF-κB信號通路，從基因、蛋白相對表達水平和細胞吞噬功能等方面評估HFPs的抗炎活性，為其在新型抑炎制劑的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜干制品（產自浙江洞頭海域） 溫州星貝海藻食品有限公司。

小鼠巨噬細胞RAW264.7 中國科學院細胞庫。

達爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基、胎牛血清 美國HyClone公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、LPS、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、高效RIPA細胞快速裂解液 北京索萊寶科技有限公司；N-(1-萘基)乙二胺鹽酸鹽、對氨基苯磺酰胺 上海源葉生物科技有限公司；TRIzol試劑 美國Omega公司；綠色熒光微球 北京百靈威科技有限公司；Taq-based聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本ToYoBo公司；FastStart Essential DNA Green Master 美國Roche公司；c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）兔單克隆抗體、p-JNK兔單克隆抗體、p38 MAPK兔多克隆抗體、p-p38 MAPK兔多克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體、p-NF-κB p65兔單克隆抗體、iNOS兔多克隆抗體 武漢愛博泰克生物科技公司；Tris緩沖鹽溶液+吐溫（Tris buffered saline+tween，TBST）洗膜液 山東思科捷生物技術有限公司；增強型化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）免疫印跡檢測試劑 江蘇新賽美生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1300系列A2型生物安全柜、梯度PCR儀、恒溫恒濕培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher Scientific公司；SpectraMax i3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；CFX 96 Touch實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Gallios流式細胞儀 美國Beckman公司；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D轉印槽 北京六一儀器廠；ChemiScope 4300 pro化學發(fā)光成像系統(tǒng) 上海勤翔科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊棲菜多酚的制備

參照Wang Chen[14]、李亞嫻[15]等的方法并略作修改。取干燥羊棲菜粉末，加入體積分數60%乙醇溶液超聲輔助浸提（料液比1∶20（m/V）、50 ℃、60 min），抽濾后真空減壓蒸餾去除乙醇，獲羊棲菜粗多酚溶液，依次采用等體積石油醚、乙酸乙酯分級萃取，真空減壓蒸餾后凍干，獲得HFPs粉末。測得HFPs粉末總酚含量為（23.67±0.24）mg/g。利用無菌水配制成多酚母液，再以細胞培養(yǎng)液稀釋至不同濃度，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

完全培養(yǎng)基（含10%（體積分數，下同）胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基）培養(yǎng)RAW264.7細胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，細胞融合度約80%時進行傳代。

1.3.3 RAW264.7細胞活力測定

取對數生長期細胞，以3×105個/mL接種于96 孔板，每孔100 μL。待細胞貼壁后，更換為含不同質量濃度（0（即對照組）、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs的新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM/F12無酚紅培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育4 h。再次棄去上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，37 ℃振蕩30 min，測定540 nm處OD540nm值。按公式（1）計算細胞活力。

1.3.4 RAW264.7細胞NO相對含量測定

參照1.3.3節(jié)方法進行細胞接種，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，將細胞分為3 組：陰性對照組、LPS陽性對照組、HFPs+LPS組。陰性對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；LPS陽性對照組加入含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h；HFPs+LPS組經含不同質量濃度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。采用Griess法測定各組在540 nm處OD540nm值，按公式（2）計算NO相對含量。

1.3.5 RAW264.7細胞炎癥相關基因相對表達量的測定

取對數生長期細胞，以4×105個/mL接種于6 孔板，每孔2.5 mL。細胞分為3 組：陰性對照組，LPS陽性對照組、HFPs+LPS組。LPS陽性對照組在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激3、6、12、24 h；HFPs+LPS組經含不同質量濃度（30、60、90、120 μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激3、6、12、24 h；陰性對照組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后吸棄培養(yǎng)液，用含不同質量濃度（0、30、60、90、120 μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L、pH 7.2（后同）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞2 次，每孔加入500 μL TRIzol試劑提取總RNA，并將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green嵌合熒光法與引物（表1）進行實時熒光定量PCR。測定目的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和內參基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.6 RAW264.7細胞吞噬能力的測定

參照李煜等[16]的方法并略作修改。按照1.3.5節(jié)方法分組進行藥物處理，陰性對照組為無LPS和HFPs處理，LPS組和HFPs+LPS組LPS刺激3 h后，去除培養(yǎng)基，加入1 mL熒光微球工作液（1×107個/mL）避光孵育2 h。收集細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2 次，加入1 mL PBS重懸細胞，經75 μm尼龍膜過濾后立即采用流式細胞儀測定細胞熒光強度。以實驗組與陰性對照組熒光強度的比值百分數表征細胞吞噬能力。

1.3.7 MAPKs、NF-κB信號通路關鍵蛋白相對表達量測定

按照1.3.5節(jié)方法進行分組和處理，陰性對照組為無LPS和HFPs處理，LPS組和HFPs+LPS組LPS刺激誘導24 h后，收集細胞。加入200 μL RIPA細胞裂解液于冰上裂解30 min，離心（12 000 r/min、4 ℃）10 min取上清液。采用BCA蛋白質量濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液調整蛋白質量濃度為2 mg/mL，95 ℃加熱10 min使蛋白變性然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；濕轉到聚偏二氟乙烯膜；5%（質量分數）脫脂奶粉（TBST溶液配制）封閉1 h；一抗4 ℃孵育12 h；二抗室溫孵育2 h；加入ECL試劑進行顯色反應，測定蛋白條帶灰度值。以β-actin為內參，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相應蛋白磷酸化水平。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

每個實驗重復3 次，結果均以平均值±標準差表示，采用Prism 8.3軟件進行單因素方差分析。采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 HFPs對RAW264.7細胞活力的影響

如圖1所示，與對照組相比，當HFPs質量濃度不高于160 μg/mL時，其對細胞活力無明顯作用；進一步提高多酚質量濃度后，HFPs顯著抑制細胞增殖（P＜0.05），并呈劑量依賴性，當HFPs質量濃度達到350 μg/mL，細胞活力顯著降為對照組的50%（P＜0.05）。

圖1 HFPs對RAW264.7細胞活力的影響Fig. 1 Effects of HFPs on the viability of RAW264.7 cells

2.2 HFPs對RAWA264.7細胞NO相對含量的影響

巨噬細胞經LPS刺激后，可產生多種炎性介質包括促炎細胞因子、前列腺素和NO等。如圖2所示，與陰性對照組相比，細胞經LPS刺激24 h后，其NO相對含量顯著升高（P＜0.05）。與陽性對照相比，采用HFPs預處理可劑量依賴性緩解LPS刺激導致的NO產生，且當HFPs質量濃度為100 μg/mL以上時，抑制效果顯著（P＜0.05）。

圖2 HFPs對RAW264.7細胞NO生成量的影響Fig. 2 Effect of HFPs on NO production in RAW264.7 cells

2.3 HFPs對RAW264.7細胞iNOS mRNA和蛋白表達的影響

如圖3A所示，LPS顯著刺激細胞iNOS基因轉錄（P＜0.05），且iNOSmRNA表達水平隨LPS誘導時間延長而增加。HFPs預處理24 h后再經LPS誘導細胞，HFPs對iNOSmRNA表達水平的影響與LPS刺激時間有關，短期LPS刺激（0～12 h）后HFPs對iNOSmRNA表達水平無明顯作用，而當LPS誘導時間延長至24 h時，HFPs（60～120 μg/mL）處理顯著降低了iNOSmRNA相對表達量（P＜0.05）。蛋白免疫印跡實驗進一步印證了該結果，60～120 μg/mL HFPs預處理顯著降低了LPS誘導24 h巨噬細胞iNOS蛋白水平（P＜0.05）（圖3B、C）。

圖3 HFPs對RAW264.7細胞iNOS mRNA和蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of HFPs on the expression of iNOS mRNA and protein in RAW264.7 cells

2.4 HFPs對RAW264.7細胞炎癥基因相對表達量的影響

采用實時熒光定量PCR測定HFPs對LPS誘導的巨噬細胞中重要促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因相對表達量，以及炎癥相關酶COX-2基因相對表達量的影響。如圖4所示，LPS刺激不同時間后，所有炎癥介質的mRNA表達水平均顯著提高（P＜0.05）。HFPs對促炎細胞因子的抑制作用與其劑量、LPS誘導時間及細胞因子種類相關。與LPS組相比，靜息狀態(tài)細胞經HFPs處理再經LPS誘導12、24 h后，IL-1β和IL-6的基因相對表達量顯著下降；HFPs顯著抑制LPS誘導3 h后TNF-α基因的相對表達，而在LPS誘導6～24 h的抑制作用總體不明顯。在LPS誘導24 h，較低劑量HFPs（30、60 μg/mL）預處理對COX-2基因表達具有顯著抑制作用，但提高劑量后該抑制效果消失，甚至出現反向促進作用，120 μg/mL HFPs預處理促使COX-2相對表達量較LPS組顯著上升（P＜0.05）。

圖4 HFPs對RAW264.7細胞炎癥介質基因相對表達量的影響Fig. 4 Effect of HFPs on gene expression of inflammatory mediators in RAW264.7 cells

2.5 HFPs對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

如圖5所示，與陰性對照組相比，LPS刺激3 h顯著促進了細胞吞噬熒光微球的能力（P＜0.05）。經60、90、120 μg/mL HFPs預處理后，LPS誘導的小鼠巨噬細胞吞噬能力受到顯著抑制（P＜0.05）。

圖5 HFPs對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig. 5 Effect of HFPs on phagocytic capacity of RAW264.7 cells

2.6 HFPs對RAW264.7細胞MAPKs、NF-κB信號通路關鍵蛋白磷酸化水平的影響

采用蛋白免疫印跡法測定巨噬細胞中MAPKs和NF-κB信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平。如圖6所示，與陰性對照組相比，LPS刺激3 h后細胞中p38、JNK和p65蛋白的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）。90、120 μg/mL HFPs預處理對LPS誘導的巨噬細胞中p38和p65的磷酸化產生顯著抑制作用（P＜0.05），且呈一定的劑量依賴性，但對JNK的磷酸化沒有顯著影響，表明HFPs的抗炎作用可能與其靶向作用于p38 MAPK和NF-κB p65有關。

圖6 HFPs對RAW264.7細胞MAPKs和NF-κB信號通路關鍵蛋白磷酸化水平的影響Fig. 6 Effect of HFPs on the expression of key proteins involved in MAPKs and NF-κB signaling pathways in RAW264.7 cells

3 討 論

巨噬細胞是機體免疫應答的第一道防線，具有識別、吞噬、清除細菌及外來異物等功能[17]。然而，當巨噬細胞被異常激活，可分泌大量促炎細胞因子進而引發(fā)炎癥風暴，導致機體組織損傷，故其靜息-激活的動態(tài)平衡在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[18]。針對過度免疫反應，一般可通過阻斷或抑制炎癥相關因子的表達達到緩解炎癥及其引起的機體損傷。

細胞增殖能力是機體的重要生命特征和體現細胞活力的重要指標。MTT法是一種簡單、快捷、無放射性污染測定細胞活力的方法[19]，在本研究中用于評估HFPs對小鼠巨噬細胞的潛在細胞毒性。結果顯示，HFPs的最大安全質量濃度為160 μg/mL，即不高于該劑量時HFPs對RAW264.7細胞活力無影響。

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的組成成分，又名內毒素，是引起機體炎癥損傷的重要誘因，可激活巨噬細胞產生NO、iNOS、COX-2等多種炎癥介質和IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子[20-22]。IL-1β大量產生于炎癥初期，其局部激活是介導促炎反應的中心環(huán)節(jié)，可導致繼發(fā)性炎癥介質的產生[20]；TNF-α具有多效性，能增加血管內皮細胞通透性，激活中性粒細胞和淋巴細胞，促進其他細胞因子的合成和釋放[23]；IL-6作為重要促炎細胞因子，可誘導B細胞分化和產生抗體，誘導T細胞活化、增殖及分化，參與機體免疫應答[24]。研究表明，這些細胞因子及其他炎性介質的大量釋放，與炎癥相關性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[25-26]。本研究結果表明，RAW264.7細胞經LPS刺激后，其炎癥介質基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）表達顯著增加，而這一現象在HFPs預處理后得到緩解，并呈劑量和時間依賴性。Kim等發(fā)現間苯三酚可降低LPS刺激的RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達水平，抑制巨噬細胞炎癥反應[27]。Kang等則研究發(fā)現褐藻Eisenia bicyclis提取物抑制LPS激活的HepG2細胞中iNOS和COX-2的表達[28]。結合本研究結果，表明HFPs及其他褐藻多酚可通過調節(jié)多種炎性介質的基因轉錄水平來抑制炎癥的發(fā)生。

巨噬細胞的吞噬功能在機體防御病原體感染中發(fā)揮重要作用。需要注意的是，過多的免疫細胞（包括巨噬細胞）被激活，將增加炎癥風暴風險[18]。流式細胞術結合熒光標記廣泛應用于巨噬細胞吞噬功能評估[16]。本研究利用該技術檢測了HFPs對RAW264.7細胞吞噬功能的影響。結果顯示，RAW264.7細胞經LPS刺激后，其吞噬熒光微球的能力顯著提升，這與Wen Li等[29]的發(fā)現一致。采用HFPs預處理后，LPS誘導的細胞吞噬能力受到抑制，表明HFPs通過調節(jié)細胞吞噬功能緩解了炎癥反應。

NF-κB是具有多種生物活性的核轉錄因子，能通過快速調節(jié)細胞內基因的表達，調控細胞增殖、凋亡、突變和炎癥反應等生理病理過程[30]。細胞經內毒素刺激可誘發(fā)信號級聯(lián)反應，激活NF-κB并核轉位，啟動下游基因的轉錄與蛋白的表達，促進炎癥相關因子的合成與分泌[18]。Yoon等發(fā)現馬尾藻（Sargassum micracanthum）提取物通過NF-κB信號通路抑制LPS誘導RAW264.7細胞中iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6等mRNA水平的上調[31]。Yayeh等研究表明，在LPS誘導的RAW264.7細胞中，褐藻Eisenia bicyclis多酚提取物通過抑制NF-κB p65及其上游激酶的磷酸化降低NF-κB的轉錄活性[32]。除NF-κB外，MAPK也是巨噬細胞炎癥信號轉導中的重要因子，其磷酸化可進一步導致NF-κB的激活[33]。Jung等[34-35]研究發(fā)現，苷苔（Ecklonia cava）提取物能夠降低LPS誘導的小鼠BV2小膠質細胞中NF-κB的核轉位及其DNA結合能力，而這一現象與抑制MAPKs的激活有關。目前，NF-κB/MAPKs信號通路的激活水平，即相關蛋白的表達和磷酸化水平，被廣泛應用于評估和篩選抗炎活性物質。本研究發(fā)現，LPS刺激可顯著促進關鍵蛋白的磷酸化（p-p65、p-p38、p-JNK），而HFPs預處理可劑量依賴性抑制p-p65和p-p38的表達，表明HFPs的抗炎活性與調控p38 MAPK和NF-κB p65信號通路有關。不同抗炎藥物的抗炎機制不同，但主要通過阻斷或遏制炎癥相關通路，或直接中和機體中促炎介質以達到抗炎效果[36]。本實驗結果表明，HFPs可選擇性抑制LPS激活的p38/NF-κB信號通路，減少了IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2等的表達，從而緩解炎癥。

綜上所述，HFPs可通過抑制NF-κB/MAPKs信號通路蛋白p65和p38的磷酸化水平，減少促炎細胞因子和其他炎性介質的合成與分泌，降低巨噬細胞吞噬作用，從而發(fā)揮抗炎活性。值得注意的是，許多報道證實了體內外試驗結果具有良好的相關性[37]，但生物體內情況復雜，化合物在體內外的作用效果可能出現差異，如多酚進入體內后可能會被胃液分解成小分子酚類物質，導致效果減弱[38]。因此，在體外實驗的基礎上還需結合體內實驗，以確定HFPs在完整生物體中產生的抗炎作用，為其開發(fā)新的抗炎藥物提供重要依據。