miRNAs與斑塊易損性研究進展

董芝芝 劉蓉 趙秋霞 陳悅

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院超聲科，湖北 宜昌 443003)

腦卒中是我國死亡損失壽命年和傷殘調(diào)整壽命年的首要原因〔1〕，部分腦卒中歸因于頸動脈粥樣硬化易損斑塊破裂〔2〕。動脈粥樣硬化是慢性炎癥性疾病〔3〕，多基因和環(huán)境因素共同影響其發(fā)展〔4〕。早期檢測頸動脈斑塊易損性有助于識別高風險腦卒中患者〔5〕。研究表明微型核糖核酸(miRNAs)在動脈粥樣硬化斑塊的形成進展中起一定作用〔4，5〕，通過檢測miRNAs表達水平，有可能預(yù)測頸動脈斑塊易損性及腦卒中風險。

1 斑塊易損性

1844年，丹麥藝術(shù)家Bertel Thorvaldsen的尸檢結(jié)果首次報告了斑塊破裂的概念。隨后Davies描述了斑塊破裂的特征及炎癥在斑塊易損性發(fā)展中的作用〔6〕。1989年，Muller等將血流動力學(xué)改變不明顯、易破裂的斑塊命名為易損斑塊。易損斑塊為具有破裂傾向、易于發(fā)生血栓形成和(或)進展迅速的危險斑塊，主要標準為：活動性炎癥(大量單核/巨噬細胞浸潤)、薄纖維帽(厚度<100 μm)伴較大的脂核(成分>40%)、內(nèi)皮細胞剝脫伴表面血小板聚集、有損傷或破裂傾向的斑塊、重度狹窄；次要標準為：表面鈣化結(jié)節(jié)、黃色反光、斑塊內(nèi)出血、內(nèi)皮功能障礙、正性重塑〔7〕。

2 miRNAs

近年來，miRNAs(由18～25個核苷酸組成的短RNA)作為生物標志物和潛在的治療靶點，在其作為疾病診療的關(guān)鍵介質(zhì)作用備受關(guān)注。miRNAs與mRNA的3′非編碼區(qū)(UTR)位點直接和(或)互補結(jié)合抑制基因表達，導(dǎo)致翻譯抑制和(或)降解〔8〕，調(diào)節(jié)超過三分之一的人類基因〔9〕，是動脈粥樣硬化斑塊易損性的潛在調(diào)節(jié)因子〔3〕。miRNAs與細胞凋亡、細胞成熟、氧化應(yīng)激、細胞外基質(zhì)降解、血管生成和炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等有關(guān)〔10〕，可通過其表達水平調(diào)節(jié)平滑肌細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的功能，影響動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的不同階段。

3 miRNAs與斑塊易損性的分子機制

3.1miRNAs調(diào)控血管平滑肌細胞增殖、遷移及表型變化 平滑肌細胞是動脈粥樣硬化斑塊的主要成分之一〔3〕，在斑塊發(fā)展過程中，易損斑塊常顯示為平滑肌細胞凋亡和(或)纖維帽中平滑肌細胞數(shù)量減少〔11〕，常見原因為血管平滑肌細胞的增殖、遷移和表型發(fā)生了變化〔4〕。

平滑肌細胞增殖、遷移可增加斑塊纖維帽的穩(wěn)定性。研究表明，細胞增殖和遷移可能是通過miRNAs調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白〔包括細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及其抑制劑〕、靶向轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路(如miR-26a、miR-599)、激活胰島素樣生長因子(如miR-133)等引起的〔4〕。miR-221/miR-222通過抑制細胞CDK抑制劑p27kip1的表達促進血管平滑肌細胞增殖和內(nèi)膜增厚，miR-221/miR-222的缺失可能是細胞增殖減少導(dǎo)致纖維帽變薄和斑塊破裂的基礎(chǔ)〔12〕。miR-181b過表達可升高細胞周期蛋白(cyclin)-CDK復(fù)合物，導(dǎo)致細胞S和G2/M周期激活，促進血管平滑肌細胞增殖和遷移。miR-638通過靶向孤核受體(NOR)1/cyclinD途徑抑制血小板衍生生長因子(PDGF)-BB-誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖和遷移〔13〕。miR-210通過降低結(jié)腸腺瘤樣息肉基因(APC一種多蛋白復(fù)合物)的表達，促進β-連環(huán)蛋白易位進入細胞核，激活無翅型MMTV整合位點家族成員(Wnt)靶基因轉(zhuǎn)錄，可能是血管平滑肌細胞增殖的潛在機制之一〔14〕。

促進平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換可能影響纖維帽完整性。正常情況下，平滑肌細胞為收縮表型，為了應(yīng)答血管損傷和(或)炎癥信號，平滑肌細胞去分化為合成表型(促動脈粥樣硬化)〔11〕，有可能增加斑塊易損性。miRNAs是平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)因子之一。miR-143/miR-145通過調(diào)節(jié)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因促進血管平滑肌細胞表型從收縮狀態(tài)到增殖、遷移狀態(tài)的轉(zhuǎn)換〔15，16〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-143/miR-145缺陷小鼠顯示為收縮-合成表型轉(zhuǎn)換的平滑肌細胞，其收縮能力降低〔4〕，增加斑塊易損性。miR-21抑制血管平滑肌細胞中張力蛋白同源物基因(PTEN)、程序性細胞死亡蛋白(PDCD)4和Sprouty蛋白同源物(SPRY)1的翻譯及其他mRNA靶點〔如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-α和原肌球蛋白(TPM)1〕，有助于細胞從收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)換〔16〕。miR-663通過增加血管平滑肌細胞分化標記的表達，如平滑肌α-肌動蛋白(SMA)、鈣調(diào)素和平滑肌肌球蛋白重鏈(MYH11)等促進平滑肌細胞從收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)換〔4〕。

因此，miRNAs有可能作為一種新型的生物標記物評估纖維帽厚度及斑塊形態(tài)，從而評估斑塊易損性，預(yù)測腦卒中風險。

3.2miRNAs調(diào)控巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥、凋亡 巨噬細胞是形成易損斑塊的重要炎癥細胞〔10〕，可介導(dǎo)免疫細胞、炎癥因子的聚集〔17〕，miRNAs通過調(diào)節(jié)巨噬細胞分化及炎癥，參與巨噬細胞生物學(xué)行為〔11〕，在斑塊進展中產(chǎn)生影響。TOLL樣受體(TLR)4配體刺激巨噬細胞，使其極化為M1炎癥型(經(jīng)典激活細胞)，白細胞介素(IL)-4刺激時巨噬細胞極化為M2抗炎型(交替激活)；M1炎癥型激活后，小分子miRNAs上調(diào)，如miR-155等〔18〕。miR-155通過靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子B細胞淋巴瘤因子(Bcl)6、髓樣分化蛋白(MyD)88-和(TRIF)-依賴的信號通路誘導(dǎo)M1炎癥型極化等調(diào)控巨噬細胞功能的多個方面，如炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)在低密度脂蛋白(LDL)受體敲除小鼠中，骨髓造血細胞缺乏miR-155通過巨噬細胞極化為M1炎癥型增加斑塊易損性，強調(diào)了miR-155在調(diào)節(jié)巨噬細胞譜系的炎癥信號通路中的重要性〔11〕。miR-342-5p通過靶向絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)1增加巨噬細胞中miR-155的表達，促進促炎介質(zhì)如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-6的表達〔18〕。miR-181b通過靶向Notch1信號(Notch信號的異常激活與巨噬細胞功能失調(diào)有關(guān))調(diào)節(jié)巨噬細胞極化，影響動脈粥樣硬化斑塊易損性〔19〕。

動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，miRNAs通過調(diào)節(jié)巨噬細胞自噬及線粒體功能增加膽固醇外流〔20〕，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進巨噬細胞凋亡，使斑塊內(nèi)脂質(zhì)壞死核心增加、纖維帽變薄，擴大斑塊面積〔21，22〕。Canfrán-Duque等〔21〕在小鼠模型實驗中發(fā)現(xiàn)miR-21在巨噬細胞中高度表達，miR-21缺失促進巨噬細胞在動脈壁中的浸潤、增加巨噬細胞炎性細胞因子的誘導(dǎo)、加速誘導(dǎo)細胞凋亡，增加泡沫細胞形成，降低巨噬細胞吞噬能力。巨噬細胞自噬將脂滴運送到溶酶體內(nèi)，溶酶體酸脂肪酶水解并清除膽固醇，miR-33過表達可通過自噬通路反向轉(zhuǎn)運膽固醇、降低血清高密度脂蛋白(HDL)水平，加速游離膽固醇誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡和促炎癥表型轉(zhuǎn)化〔23，24〕，增加斑塊易損性。綜上，了解miRNAs調(diào)控巨噬細胞的潛在機制，通過阻斷不需要的途徑或?qū)⒕奘杉毎只{(diào)控為M2抗炎型，可成為臨床易損斑塊治療的新靶點。

3.3miRNAs調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡及炎癥反應(yīng) 內(nèi)皮細胞在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展中起一定作用。內(nèi)皮細胞受損可致血管收縮異常，增加血小板聚集、白細胞黏附和血栓形成。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，miRNAs通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖和遷移影響內(nèi)皮功能，影響斑塊易損性。miR-21、miR-126-3p、miR-24、miR-221、miR-222及miR-17-92簇的成員是內(nèi)皮細胞中表達較豐富的miRNAs。miR-21在多種生理和病理過程中起重要作用，通過直接靶向WW結(jié)構(gòu)域蛋白1、激活TGF-β信號通路，抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移〔4〕。在內(nèi)皮細胞中，miR-126表達上調(diào)通過靶向基質(zhì)細胞衍生因子(SDF)-1(也稱為CXCL12)〔25〕、Dlk1〔神經(jīng)源位點缺口同源蛋白(Notch)1抑制劑，負性細胞周期調(diào)節(jié)因子〕〔4〕，促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，以抵抗血流紊亂和高脂血癥的促動脈粥樣硬化作用，降低斑塊易損性。

內(nèi)皮細胞凋亡通過表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞功能障礙、破壞內(nèi)皮的完整性、促進脂質(zhì)沉積加速動脈粥樣硬化〔26〕，可能增加斑塊易損性。miRNAs參與了動脈粥樣硬化的病理過程，可調(diào)控內(nèi)皮細胞凋亡。let-7g過表達通過靶向抑制半胱氨酸蛋白酶(CASP)3(細胞凋亡的執(zhí)行者)降低ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡〔10〕。miR-495通過抑制趨化因子(CCL)2促進單核細胞進入動脈粥樣硬化斑塊并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡促進動脈粥樣硬化，增加斑塊易損性。PTEN是腫瘤抑制基因，通過負性介導(dǎo)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路、負性介導(dǎo)中性粒細胞趨化和減少組織損傷發(fā)揮抗炎作用，而miRNA-26a-5p通過靶向PTEN激活PI3K/Akt通路，抑制內(nèi)皮細胞凋亡〔27〕和炎癥反應(yīng)。

在生物化學(xué)和生物力學(xué)刺激的共同作用下，動脈粥樣硬化疾病的早期特征是內(nèi)皮細胞激活，表達一組黏附分子，如血管細胞黏附分子(VCAM)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1和E-選擇素〔11〕，促進炎癥反應(yīng)及動脈粥樣硬化斑塊形成，增加斑塊易損性〔28〕。miRNAs可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)。如在動脈粥樣硬化的早期階段，miR-21通過激活VCAM-1增加黏附分子及促炎細胞因子表達，增加內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)〔16〕。miR-92a通過靶向G蛋白信號調(diào)節(jié)因子(RGS)3、Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)2、KLF4分別抑制TGF-β/母親信號蛋白同源物(Smad)信號傳導(dǎo)、NF-κB途徑、IL-1β，抑制內(nèi)皮細胞增殖和炎癥反應(yīng)，減緩動脈粥樣硬化進展〔9〕，降低斑塊易損性。miR-155 和miR-221/miR-222通過靶向轉(zhuǎn)錄因子Ets-1及其下游基因(包括VCAM-1和單核細胞趨化蛋白-1)抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)〔11〕，有可能降低斑塊易損性。

目前研究結(jié)果只能表明miRNAs與內(nèi)皮細胞功能、斑塊易損性有一定相關(guān)性，但調(diào)控功能的主要miRNAs尚未說明，其具體類別及影響機制還需更多實驗闡明。

4 miRNAs與脂質(zhì)代謝

血液循環(huán)中過量的LDL及膽固醇在血管內(nèi)皮下積聚，誘導(dǎo)局部氧化和酶修飾引起免疫應(yīng)答，形成斑塊進展的慢性炎癥環(huán)境〔11〕。膽固醇流出能力(維持膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài))是動脈粥樣硬化的預(yù)測因子之一。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ABC)A1是調(diào)節(jié)膽固醇代謝的關(guān)鍵分子，通過向載脂蛋白受體輸出膽固醇和磷脂調(diào)節(jié)HDL生成〔29〕。miR-33家族在膽固醇流出和HDL代謝(ABCA1和ABCG1)、脂肪酸氧化、膽汁酸合成和分泌等相關(guān)基因的調(diào)控中具有重要作用〔24〕。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-33可降低血漿極低密度脂蛋白(VLDL)含量，而增加血漿HDL含量〔30〕。Nishino等〔23〕用miR-33b敲入人化小鼠模型證明膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBF)1-miR-33b軸促進動脈粥樣硬化、斑塊核心壞死區(qū)域和巨噬細胞浸潤增加、纖維化成分減少，表明miR-33b通過調(diào)節(jié)膽固醇量增加斑塊易損性。miR-126-5P通過抑制Dlk1、Notch1使細胞通透性增加，導(dǎo)致LDL大量進入血管壁促進動脈粥樣硬化斑塊進展〔31〕，增加斑塊易損性。miR-494表達上調(diào)通過HDL將膽固醇從血管壁轉(zhuǎn)移到肝臟，減少動脈粥樣硬化斑塊中壞死核心的大小〔30〕。miR-27、miR-144、miR-145、miR-223 和 miR-758在轉(zhuǎn)錄后通過抑制ABCA1表達調(diào)節(jié)細胞膽固醇流出至載脂蛋白〔11〕，影響斑塊易損性。由此可見，通過抑制或激活相應(yīng)的miRNAs，可在一定程度下減輕血管壁的脂質(zhì)沉積，降低循環(huán)血脂水平，從而降低臨床心血管事件的風險。

5 miRNAs與斑塊內(nèi)新生血管

新生血管是動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展早期的一個顯著特征，因新生血管脆弱且易塌陷，導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血、血栓形成、釋放化學(xué)介質(zhì)、產(chǎn)生炎癥細胞，增加斑塊易損性〔31，32〕。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，不同的miRNAs可能與血管生成有關(guān)。let-7、miR-126、miR-143/145、miR-155、miR-17-92簇和miR-221/ miR-222可以調(diào)節(jié)斑塊內(nèi)新生血管生成。let-7通過敲除小鼠體內(nèi)的內(nèi)切核糖核酸酶(Dicer)和核糖核酸酶Ⅲ(Drosha)，使let-7a、let-7b、let-7c、let-7f和let-7g降低30%以上，影響血管生成。let-7a、let-7b和let-7f的減少有助于新生微血管的形成〔10〕。miR-126可通過維持血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達水平、下調(diào)表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGFL)-7(與VEGF協(xié)同促血管生成)，促進新生血管生成〔25〕。因此，通過檢測循環(huán)中miRNAs表達水平，有可能評價新生血管密度，成為評估斑塊內(nèi)新生血管的方法之一。

綜上，頸動脈粥樣硬化易損斑塊破裂可導(dǎo)致腦卒中。miRNAs在動脈粥樣硬化斑塊進展過程中起重要作用，通過檢測血液循環(huán)和斑塊內(nèi)miRNAs表達水平為參考依據(jù)，有可能預(yù)測斑塊易損性及腦卒中風險，對頸動脈易損斑塊提供診療策略，從而尋找頸動脈易損斑塊miRNAs治療的新靶點。