RIPK3介導的程序性壞死在心血管疾病中的研究進展

周剛 吳輝 劉滴 李云曌 張棟

(三峽大學心血管病研究所 宜昌市中心人民醫(yī)院心血管內科，湖北 宜昌 443003)

心血管疾病(CVD)是導致死亡的最主要原因，具有發(fā)病率高且預后不良的特點〔1〕。來自歐洲的一項流行病調查顯示，CVD的發(fā)病率逐年升高〔2〕。中國心血管健康與疾病報告2019概要中指出我國CVD死亡率也呈現(xiàn)上升趨勢，并且位居各種疾病死亡原因首位〔3〕。CVD的發(fā)生發(fā)展涉及多種細胞死亡形式，包括凋亡、自噬及壞死等。既往研究認為，細胞自噬和凋亡是主動的可調節(jié)的細胞死亡方式，而細胞壞死是被動的不受調節(jié)的細胞死亡方式。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)至少有一部分壞死受信號調節(jié)，這種壞死細胞死亡形式同時具有壞死和凋亡的特點，被稱為程序性壞死〔4〕。在程序性壞死的發(fā)生過程中，受體相互作用激酶(RIPK)1、RIPK3及其底物混合譜系激酶樣蛋白(MLKL)是參與細胞程序性壞死的關鍵分子。許多研究發(fā)現(xiàn)RIPK3介導的程序性壞死參與CVD的多個病理生理過程，具有潛在的治療價值〔5〕。現(xiàn)針對RIPK3分子及其介導的程序性壞死信號通路在CVD中的研究進展進行綜述，以進一步了解RIPK3介導的程序性壞死在CVD中的作用，旨在為CVD的防治提供新的靶點及思路。

1 RIPK3及其介導的程序性壞死概述

RIPK3是絲氨酸/蘇氨酸受體相互作用蛋白激酶家族的成員，其結構成分包括N端激酶結構域和不同于其他家族成員的C端同型相互作用模序結構域，而不含死亡結構域。激酶結構域是活性區(qū)，其中N端激酶結構域在程序性壞死過程中具有重要作用，C端同型相互作用模序結構域可介導RIPK3與RIPK1的相互作用形成RIPK1-RIPK3壞死復合體，隨后分別在T357和S358位點磷酸化MLKL，導致MLKL通過N末端結構域易位至細胞質膜和發(fā)生寡聚化，最終直接或間接破壞細胞質膜從而導致細胞內炎癥因子和免疫復合物直接釋放至細胞外，最終招募中性粒細胞、巨噬細胞等聚集激活無菌性炎癥反應〔6,7〕。2005年，Degterev等〔4〕發(fā)現(xiàn)RIPK1特異性抑制劑壞死抑制素(Nec)-1對細胞的壞死過程具有調控作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)其細胞壞死過程為一種新的非依賴天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的程序性細胞死亡，這種細胞死亡形式兼具有壞死的形態(tài)學特征和凋亡的程序性，其突出的形態(tài)和功能改變?yōu)榧毎[脹，細胞質逐漸透明，結構喪失，線粒體廣泛破壞，質膜不可逆破裂等，最終導致細胞內容物流出，從而引起顯著的炎癥反應和鄰近細胞損傷〔8〕。與常規(guī)細胞壞死的區(qū)別在于常規(guī)細胞壞死是不可調節(jié)的，而這種細胞死亡形式是可被精密的分子機制調節(jié)的，遂將其命名為necroptosis，中文譯為程序性壞死或壞死性凋亡。目前研究最為廣泛的一種細胞壞死類型即為由RIPK3介導的細胞程序性壞死，在調控程序性壞死的過程中RIPK3與多種蛋白激酶分子相互作用形成不同的信號轉導通路。除了當前研究較為清楚的RIPK1-RIPK3-MLKL信號傳導通路在程序性壞死中發(fā)揮重要作用外，Zhang等〔9〕在小鼠動物模型研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的調控心肌細胞程序性壞死模式，RIPK3通過磷酸化或氧化鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的激活，進一步觸發(fā)線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)的開放不僅介導心肌細胞程序性壞死的發(fā)生，還同時激活了線粒體途徑凋亡發(fā)生，即RIPK3-CaMKⅡ-mPTP途徑。此外，Zhu等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)在小鼠缺血再灌注(I/R)模型中I/R損傷可通過RIPK3誘導內質網(wǎng)應激通路介導程序性壞死的發(fā)生，進一步研究證實了RIPK3-內質網(wǎng)應激-鈣超載-黃嘌呤氧化酶-活性氧簇-mPTP開放信號通路為介導程序性壞死發(fā)生的另一條途徑。由此可見，RIPK3介導的程序性壞死信號通路復雜多樣，其上下游信號通路及靶點尚未完全了解，仍需進一步研究。

2 RIPK3在CVD中的主要作用

心血管系統(tǒng)動態(tài)平衡的維持依賴于細胞的死亡和更新。近年來，越來越多的研究表明RIPK3通過介導細胞程序性壞死的發(fā)生導致細胞過度丟失與許多CVD的發(fā)生發(fā)展有關，例如缺血性心臟病(IHD)、動脈粥樣硬化(AS)、心力衰竭(HF)等〔11～13〕。因此深入研究RIPK3介導的程序性壞死與CVD的關系，可能會為預防和治療CVD提供新的理論依據(jù)。

2.1RIPK3與IHD 全球每年死于IHD的人數(shù)高達900萬，是全球范圍內高發(fā)病率和死亡率的主要原因〔14〕。由于經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術等冠狀動脈血運重建治療技術飛速發(fā)展，極大改善了IHD患者的預后，導致短期致死率呈下降趨勢，然而由于心肌細胞損傷的不可逆性，大量IHD患者發(fā)生心肌梗死(MI)后，會逐漸發(fā)展為HF，最終導致長期致死率居高不下〔15〕。因此尋找新的治療方案以減少MI面積，對維持心室功能及預防HF發(fā)生具有重要作用。有研究表明在離體大鼠心臟模型中，使用RIPK1特異性抑制劑(NEC-1或NEC-5)和一些天然產物蒜氨酸，可以產生心臟保護作用減少MI面積，進一步研究發(fā)現(xiàn)其部分機制是通過抑制RIPK1-RIPK3-MLKL信號轉導通路來減輕缺血誘導的MI面積〔16,17〕。與之一致的是，Luedde等〔18〕探索了RIPK3是否參與MI中的調控，通過建立基因敲除小鼠模型進行實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠在MI后30 d的左室射血分數(shù)更高，心肌細胞肥大程度較小，同時炎癥反應減弱，活性氧的生成減少。此外RIPK3基因敲除小鼠與野生型小鼠相比MI面積顯著降低。揭示了RIPK3在MI中具有極其重要的調控作用，并證實RIPK3介導的程序性壞死加重了小鼠缺血誘導MI后的氧化應激和心臟不良重構。Ghardashi Afousi等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)高強度間歇訓練通過靶向RIPK1-RIPK3-MLKL信號通路，對小鼠MI后的心臟不良重構起到心臟保護作用，進一步驗證了RIPK3介導的程序性壞死在MI中的重要調控作用。

MI患者接受開通罪犯血管的再灌注治療后會引起由快速血流恢復所導致的心肌I/R損傷，研究發(fā)現(xiàn)，MI患者接受及時的再灌注治療后，有50%的心梗面積是由心肌細胞I/R損傷所致〔20〕。因此，積極探索新的干預手段來減輕心肌I/R對于改善MI患者預后具有重要臨床意義。一項通過構建衰老小鼠I/R動物模型研究發(fā)現(xiàn)，一種具有多種生物學功能的蛋白P62與RIPK1-RIPK3壞死體形成復合物介導程序性壞死的發(fā)生，使衰老小鼠心肌細胞更易受I/R損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療破壞P62-RIPK1-RIPK3復合物的形成，從而有效抑制了I/R誘導的衰老小鼠心肌細胞程序性壞死的發(fā)生，最終降低了該小鼠模型的致死率〔21〕。Zhou等〔22〕探討了RIPK3在心臟微循環(huán)I/R損傷中的作用及其機制，研究發(fā)現(xiàn)RIPK3主要由I/R損傷激活，從而加劇內皮細胞程序性壞死的發(fā)生，最終導致微血管屏障功能障礙、毛細血管通透性增高和微循環(huán)灌注缺陷。在機制上，得出結論是I/R損傷經(jīng)RIPK3-磷酸甘油酸變位酶(PGAM)5-親環(huán)素(CypD)-mPTP信號通路促進內皮細胞啟動程序性壞死導致I/R介導的微血管損傷。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)褪黑素治療可抑制RIPK3-PGAM5-CypD-mPTP信號通路，從而阻斷內皮細胞程序性壞死的發(fā)生，減輕心臟微血管I/R損傷。以上研究表明抑制RIPK3相關信號傳導途徑介導的程序性壞死的發(fā)生是減輕I/R損傷的有效方法。因此若能在臨床實踐中開發(fā)具有抑制RIPK3介導程序性壞死發(fā)生的臨床藥物，則可能為減輕心肌I/R損傷提供新的防治策略。

2.2RIPK3與AS AS是心血管系統(tǒng)中一種常見的慢性血管炎癥疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的流行病學特點，并以AS斑塊在大中型動脈的血管壁集聚為特征，一旦不穩(wěn)定的AS斑塊破裂，將會導致血栓形成從而閉塞管腔，引起一系列CVD及其并發(fā)癥的發(fā)生，嚴重威脅人類健康。盡管藥物及介入治療的飛速發(fā)展使AS的治療取得了一定進展，但AS所引起的心腦血管疾病仍未減少，因此積極探索新的治療靶點來治療AS尤為重要。目前越來越多的研究表明RIPK3介導的程序性壞死在AS的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。巨噬細胞程序性壞死的發(fā)生被廣泛認為是AS斑塊形成的關鍵因素〔23〕。Lin等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RIPK3基因敲除可以顯著降低易患AS小鼠斑塊中巨噬細胞程序性壞死的發(fā)生，并且RIPK3基因敲除小鼠AS斑塊及壞死中心面積顯著降低。此外，體外研究表明，RIPK3缺失的巨噬細胞對氧化型低密度脂蛋白誘導的程序性壞死具有抵抗力。該研究證明下調RIPK3表達可以抑制巨噬細胞誘導的AS斑塊形成。與之一致的是，Meng等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)在載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的AS斑塊中RIPK3被磷酸化修飾，提示該模型小鼠中存在程序性壞死的激活。進一步研究構建ApoE和RIPK3雙敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該組小鼠AS斑塊中炎癥及程序性壞死水平顯著降低。Tian等〔26〕研究發(fā)現(xiàn)在具有壞死中心的人AS斑塊中，RIPK1和RIPK3的水平顯著升高。另外有一項研究表明，與對照組相比，AS患者的頸動脈斑塊中RIPK3的mRNA表達顯著增加，進一步發(fā)現(xiàn)其在不穩(wěn)定斑塊中表達更加顯著〔12〕。提示RIPK3的表達上調參與了AS的斑塊不穩(wěn)定性，提前干預RIPK3的表達可能是阻斷AS進程的有效策略。肖真真等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，冠狀AS心臟病患者血漿中RIPK1、RIPK3、MLKL水平均顯著升高，并且進一步研究發(fā)現(xiàn)3者水平可能與冠狀動脈狹窄嚴重程度呈正相關。然而，一項研究發(fā)現(xiàn)RIPK3在巨噬細胞和內皮細胞中具有AS保護作用，該研究指出RIPK3在AS中的主要作用不是以往描述的促進程序性壞死發(fā)生，而是可能通過抑制巨噬細胞中單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和內皮細胞中E-選擇素的表達發(fā)揮抗炎作用，從而在AS中發(fā)揮保護作用。并指出造成實驗結果差異的原因可能是不同類型的細胞利用促炎成分的方式不同〔28〕。因此RIPK3在斑塊的各種細胞類型中的具體作用仍存在爭議。

以上研究提示依賴RIPK3的程序性壞死是AS斑塊形成的關鍵驅動因素，RIPK3的水平與斑塊的穩(wěn)定性呈負相關，并且與AS進展的嚴重程度有密切關系。這種機制為AS的治療和診斷提供了一種新的思路，提示RIPK3介導的程序性壞死在AS發(fā)生發(fā)展的過程中扮演了非常重要的角色，通過有效手段降低RIPK3介導的程序性壞死的發(fā)生可能是治療AS的有效方案，患者血漿中RIPK3的水平檢測可能對AS的診斷及嚴重程度評估具有一定的預測價值。

2.3RIPK3與HF HF是一種心臟不能泵出足夠的血液來滿足組織、器官需要的綜合征，繼發(fā)于左室收縮和舒張功能障礙。由于人口老齡化和危險因素控制不力，HF發(fā)病率呈上升趨勢〔29〕。雖然當下醫(yī)學治療取得了一些進展，但HF患者的預后仍然很差。因此，有必要探索更有效的治療策略延緩和防止HF的進展。Szobi等〔30〕通過對健康對照組和MI或擴張型心肌病所致終末期HF患者的左心室標本進行研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HF組中RIPK1和RIPK3的表達水平均顯著升高。此外，活化的半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8，一種負性調節(jié)程序性壞死的促凋亡蛋白酶，在HF組中顯著降低。提示在部分HF患者心臟左室中，凋亡的發(fā)生可能被抑制而RIPK3介導的程序性壞死是心肌損傷、炎癥反應及纖維增生的主要原因。Guo等〔31〕研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟特異性腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)2缺失會引發(fā)心肌細胞程序性壞死和HF，進一步研究發(fā)現(xiàn)，RIPK3基因缺失在很大程度上挽救了由TRAF2缺失引發(fā)的心臟表型，證明了RIPK3是TRAF2下游的關鍵靶蛋白，介導了HF中程序性壞死的發(fā)生。既往研究證明了鈣調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ是RIPK3下游靶蛋白，可共同介導mPTP開放。研究發(fā)現(xiàn)，在構建的小鼠模型中，RIPK3基因敲除和CaMKⅡ抑制劑可明顯改善I/R或阿霉素治療所誘導的心肌細胞程序性壞死和HF，進一步實驗表明，其部分機制可能是通過阻斷RIPK3-CaMKⅡ-mPTP信號轉導途徑，從而延緩小鼠HF的進程〔9〕。值得注意的是，與心肌細胞不同，促進肌成纖維細胞程序性壞死的發(fā)生可能對心臟具有保護作用。已有研究表明，可溶性恒定鏈(sCD74)/巨噬細胞抑制因子(MIF)通路可通過觸發(fā)依賴RIPK1-RIPK3的程序性壞死促進肌成纖維細胞死亡，從而發(fā)揮抗纖維化作用，最終延緩心臟重構和HF的進程〔32〕。該研究提示，RIPK3介導的程序性壞死在不同類型細胞中其功能具有差異性，其中一些功能在HF的發(fā)生發(fā)展過程中可能是有益的。因此，探索不同類型細胞間RIPK3介導的程序性壞死的差異作用關系，將有助于闡明以RIPK3為靶點治療HF的潛在風險和獲益。

綜上，RIPK3介導的程序性壞死與CVD的發(fā)生發(fā)展具有密切關系，成為近年來心血管領域的一個新熱點。本文討論了依賴RIPK3的程序性壞死在IHD、AS、HF中的重要作用，因此靶向調控RIPK3可能是治療多種CVD的有效策略。但目前對RIPK3介導的程序性壞死在CVD中的具體作用和調控機制尚未研究透徹，仍需要更多的相關研究，以期為開發(fā)相關分子靶點的藥物提供有價值的線索和手段，最終將基于細胞或動物模型實驗的發(fā)現(xiàn)應用于臨床實踐。