拉曼光譜在肉品質(zhì)預測與控制中的應用

王新怡，董鵬程，羅欣,2，毛衍偉*，張一敏*

1(山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018) 2(江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210095)

肉的食用品質(zhì)通常包括嫩度、風味、多汁性、肉色和保水性等，安全性包括微生物、獸藥殘留控制等[1]。隨著消費者對食品品質(zhì)和安全性要求的提高，食品品質(zhì)和安全檢測日益重要[2]。傳統(tǒng)的肉品食用品質(zhì)分析多采用感官分析和儀器分析，微生物檢測多采用平板菌落計數(shù)[1]。上述傳統(tǒng)分析方法通常費時、費力，因此開發(fā)快速的品質(zhì)、安全檢測方法至關重要。

拉曼散射效應是印度物理學家C.V.RAMAN于1928年首次發(fā)現(xiàn)的。在克服了散射信號弱、熒光干擾強、檢測效率低、數(shù)據(jù)處理慢等問題后[2]，拉曼光譜(Raman spectroscopy)技術由于具有快速、原位、無損傷檢測等特點，在食品領域的應用研究受到廣泛關注。在肉的品質(zhì)和安全分析中，色散型拉曼光譜[3-4](dispersive Raman，DIS-Raman)和傅立葉變換拉曼光譜[5-6](Fourier transform Raman，F(xiàn)T-Raman)技術均有應用；為了提高在食品致病菌、獸藥殘留等分析中的檢測效率，還有研究使用了表面增強拉曼光譜[7-8](surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)、空間偏移拉曼光譜[9](spatially offset Raman spectroscopy，SORS)等技術。拉曼光譜技術的應用研究日新月異，及時總結、分析最新研究成果，對拉曼光譜技術的發(fā)展及其在我國肉類產(chǎn)業(yè)中的應用具有重要意義。

因此，本文總結了拉曼光譜在肉與肉制品研究中常用的拉曼位移、信號來源及其與肉品品質(zhì)、安全的關系，并從拉曼光譜技術預測、分析肉的食用品質(zhì)、營養(yǎng)成分、食品安全控制和肉的摻假等方面詳細論述了拉曼光譜在肉的品質(zhì)、安全控制中的應用，以及拉曼光譜在肉品研究中常用的光譜處理和數(shù)據(jù)分析方法，同時分析了影響拉曼光譜預測準確性的因素和解決措施，以期為拉曼光譜在肉的品質(zhì)控制中的研究提供新思路，并推進拉曼光譜技術在肉類產(chǎn)業(yè)中的應用。

1 拉曼光譜的技術原理及其在肉品研究中應用的理論基礎

處于基態(tài)的樣品分子受到外來光子的激發(fā)后，其能量狀態(tài)變成不穩(wěn)定的中間狀態(tài)，樣品分子在離開中間能量狀態(tài)時隨機輻射光子。激發(fā)光的光子與物質(zhì)分子相碰撞，可產(chǎn)生彈性碰撞和非彈性碰撞。在彈性碰撞過程中，二者沒有發(fā)生能量交換，光子頻率保持恒定，這種散射現(xiàn)象稱為瑞利散射(Rayleigh scattering)[10]。在非彈性碰撞過程中，光子與分子有能量交換，光子轉移一部分能量給散射分子，或者從散射分子中吸收一部分能量，從而使其頻率改變，由于不同的化學鍵或基團有不同的能量改變，并產(chǎn)生相應的光子頻率變化，因此根據(jù)光子頻率變化就可以判斷出分子中所含有的化學鍵或基團。這種分子對光子的非彈性散射效應即是拉曼光譜技術的原理[11]。散射光頻率與入射光頻率差值稱為拉曼位移。

肉與肉制品的物質(zhì)組成、含量及其在加工過程中蛋白質(zhì)二級結構的變化能通過拉曼位移反映出來，這成為拉曼光譜在肉與肉制品加工和品質(zhì)、安全控制中應用的基礎。圖1是典型的生鮮牛肉拉曼光譜，其中的酰胺Ⅰ帶(1 645～1 685 cm-1)、酰胺Ⅲ帶(1 200～1 235 cm-1)與肉的品質(zhì)相關性最大。酰胺I帶主要包括α-螺旋(1 650～1 658 cm-1),β-折疊(1 665～1 680 cm-1)、β-轉角(1 680 cm-1)和無規(guī)則卷曲(1 660～1 665 cm-1)結構[12]。

表1概括了肉品研究中常用的拉曼位移、信號來源及其與肉品質(zhì)的關系。肉品研究中常用的拉曼位移主要處于500～1 800 cm-1，涉及到的信號來源有色氨酸等多種氨基酸；C—CN等基團的拉伸、彎曲、剪振以及α螺旋、β-折疊β-轉角等，主要用于肉的品質(zhì)(嫩度、pH值、保水性、肉色)預測、異質(zhì)肉[PSE(pale, soft, exudative)肉、DFD(dark, firm, dry)肉]判定、貨架期預測和摻假肉的鑒別。

圖1 宰后1 d牛肉的拉曼光譜Fig.1 Raman Spectroscopy of beef 1 day post-mortem

表1 肉品研究中常用的拉曼位移及與肉品質(zhì)的關系Table 1 Overview of Raman shift used in meat science and its relationship with meat quality

續(xù)表1

2 拉曼光譜技術在肉與肉制品品質(zhì)控制中的應用

2.1 拉曼光譜在肉制品品質(zhì)預測與分析中的應用

2.1.1 pH值

pH值是肉的關鍵品質(zhì)指標，pH值過高或過低的肉，品質(zhì)較差，均為異質(zhì)肉[1]。肉的極限pH值大于6.1時，為DFD肉，該類肉表面干燥、貨架期短且有輕微的肥皂味；極限pH值低于5.4時，為PSE肉，該類肉汁液滲出嚴重、貨架期短[1]。因此，實現(xiàn)pH值的快速預測和異質(zhì)肉的快速判定，對于保證肉品質(zhì)的一致性有重要意義。

如表2所示，拉曼光譜能夠快速預測宰后初期豬肉、羊肉的pH值。SCHEIER等[38]較早得將拉曼光譜應用于宰后早期預測豬肉品質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)磷酸基團(980 cm-1和1 080 cm-1)拉曼信號可以用于預測宰后早期的pH值(R2=0.71)，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)宰后初期磷酸化代謝物質(zhì)與無機磷酸拉曼信號的變化與pH值的降低有關；可以利用磷酸肌酸、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷和α-螺旋區(qū)分正常和異質(zhì)肉[18]。之后該研究小組首次將便攜式拉曼光譜應用于生豬屠宰線，實現(xiàn)利用糖原、乳酸、肌酸、磷酸肌酸、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷的拉曼信號快速預測宰后35 min和24 h肉的pH值[25, 35]。但是相比實驗室條件下的預測準確性，在生產(chǎn)條件下pH值預測模型的R2值僅為0.58，預測能力顯著下降。隨后NACHE等[36-37]利用偏最小二乘回歸等多種數(shù)據(jù)處理方法進一步提高了豬肉pH值在線預測的準確性。FOWLER等[19]將拉曼光譜應用于完整的半膜肌pH值的在線預測，結果發(fā)現(xiàn)預測模型的R2為0.35，這一數(shù)值與豬肉pH值的預測準確性相比略低。其原因可能與羊肉中含有較少的Ⅱ B型肌纖維有關，也可能與其未合理處理拉曼光譜數(shù)據(jù)有關。

表2 拉曼光譜技術在預測肉的pH值中的應用Table 2 Application of Raman spectroscopy in prediction of pH of meat

2.1.2 嫩度

嫩度是肉的重要食用品質(zhì)指標，分析肉的嫩度通常采用感官評定或測定剪切力的方法[1]，但測定肉的剪切力費時、費力。因此，開發(fā)快速無損預測肉嫩度的方法對于控制肉的品質(zhì)具有重要意義。

在使用拉曼光譜預測牛米龍[14]、牛背最長肌、半腱肌、臀中肌[39]、羊背最長肌[40]的剪切力時具有較高的準確性，且可以實現(xiàn)對肉感官品質(zhì)的預測[14, 41](表3)。然而，在FOWLER的研究中，預測羊半膜肌[27]、羊背最長肌[40]、牛背最長肌[42]剪切力時的準確性較差，且在預測模型中增加肌原纖維斷裂、粒子直徑、肌節(jié)長度和pH值均不能提高預測準確性[27, 40]。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OWLER傾向于不處理或少處理光譜數(shù)據(jù)，這可能是其預測準確性低的原因，也突出了數(shù)據(jù)分析方法在拉曼光譜技術中的重要性。

表3 拉曼光譜在預測和分析肉的嫩度中的應用Table 3 Application of Raman spectroscopy in prediction and analysis of meat tenderness

此外，不同物種、不同部位間肌肉的類型不同，以及肌肉內(nèi)糖原含量、Z線寬度等不同，會導致拉曼光譜的預測準確性不同[19]。顏色較深的肉會增加光吸收導致拉曼信號降低[19]，而較韌的肉拉曼信號強于嫩的肉，其原因可能是韌度高的肉蛋白質(zhì)密度高，增加了散射分子并最終增強了拉曼信號[17]。因此，肌肉僵直期間拉曼光譜信號強，而肌肉成熟后肌纖維結構的降解則降低了拉曼信號[27]，導致牛肉宰后1 d拉曼光譜的預測準確性高于其宰后5 d拉曼光譜的預測準確性[40]。

拉曼光譜還可用于分析肉嫩度差異的原因。FOWLER等[24]發(fā)現(xiàn)嫩度高和嫩度低的牛肉之間α-螺旋(930 cm-1)和酪氨酸雙帶(826 cm-1和853 cm-1)的拉曼光譜顯著不同。在嫩度差的肉中，α-螺旋的量降低，β-折疊或無規(guī)則卷曲含量高[27]，而嫩度高的肉酪氨酸雙帶強，嫩度差的肉酪氨酸雙帶弱[27-28]。酪氨酸存在于多種蛋白質(zhì)中，酪氨酸的拉曼位移強度直接反映了肉在成熟過程中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的自由酪氨酸的量[44]。拉曼位移830 cm-1信號強度的降低代表酪氨酸酚羥基與氧結合，降低了肌原纖維的降解能力，使肉的嫩度變差[44]。

2.1.3 肉色和保水能力

拉曼光譜可以通過1 296、1 356、1 358、1 370、1 377 cm-1等與肌紅蛋白相關的拉曼位移，以及1 367、1 600～1 700 cm-1等與保水性相關的拉曼位移預測肉的顏色和保水性(表1)。從表4可以看出，拉曼光譜可以用于預測肉的顏色、汁液損失和烹制損失。肉色是肉的重要商品屬性，肉色影響消費者的購買意愿[1]，SCHEIER等[35]發(fā)現(xiàn)拉曼光譜與豬肉的L*和b*值具有較高的相關性，而FOWLER等[19]發(fā)現(xiàn)拉曼光譜與羊肉的L*值相關性較差。由于利用色差計能夠實現(xiàn)對肉色的快速測量，拉曼光譜用于預測肉色的實用性較小，因此拉曼光譜在肉色判定領域的研究相對較少。

肉的保水性與產(chǎn)品出品率相關，且肉的保水性測定較為費時，因此研究利用拉曼光譜快速預測肉的保水性具有重要意義。已有的研究發(fā)現(xiàn)拉曼光譜能夠較好地實現(xiàn)雞肉、豬肉和牛肉的保水性的快速預測，拉曼光譜與保水性的擬合效果較好(表4)。但是在雞肉和牛肉的模型中，仍存在樣本量較少的問題，因此增加樣本量進一步提高擬合效果，是拉曼光譜用于實際生產(chǎn)中進行保水性預測的關鍵。

表4 拉曼光譜在預測和分析肉色和保水性中的應用Table 4 Application of Raman spectroscopy in prediction of meat colour and water holding capability

2.2 拉曼光譜在肉制品營養(yǎng)品質(zhì)分析中的應用

由表5知，拉曼光譜技術在分析肉中水分含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量以及脂肪酸組成上得到應用并取得了較好的結果，較早期的研究首先將拉曼光譜應用于脂肪組織中碘值和脂肪酸含量的測定，且均得到較理想的擬合效果[13,41-42]。近年來，學者們進一步將拉曼光譜應用于肌肉組織中肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸含量的測定，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜對多不飽和脂肪酸的預測效果較好，R2達0.93[18]，但是對于肌內(nèi)脂肪含量的預測效果，不同的研究團隊所得的研究結果有所差異。WANG等[41]在不同時間、使用不同設備檢測拉曼光譜技術預測脂肪含量的有效性和準確性證明了拉曼光譜建立的模型在經(jīng)過多元散射校正后具有良好的預測能力。脂肪含量和脂肪酸組成是影響肉質(zhì)量的重要因素[1]，建立快速檢測原料肉和肉制品中脂肪含量、脂肪酸譜的方法不但對產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義，還能為產(chǎn)品的快速分級奠定基礎。但是，目前利用拉曼光譜對脂肪含量和脂肪酸含量進行預測的研究較少，尤其是對肌肉中脂肪酸組成的預測更是少之又少。

2.3 拉曼光譜在肉制品安全控制中的應用

微生物腐敗和致病菌污染是影響食品安全的重要因素。由于傳統(tǒng)的微生物分析方法費時費力，肉類工業(yè)亟需能夠快速、無損的肉品腐敗和致病菌檢測技術。如表6所示，拉曼光譜可以實現(xiàn)對生鮮肉和肉糜貨架期的預測，并實現(xiàn)一些重要食源性致病菌的快速檢測。

使用拉曼光譜可以準確預測不同包裝下肉的細菌總數(shù)、乳酸菌、腸桿科菌、假單胞菌、熱殺索絲菌及酵母菌和霉菌[3, 47]，且其預測準確度較高，或者對不同腐敗狀態(tài)的肉進行分類判斷[15, 48]，可以實現(xiàn)肉品貨架期的預測或快速判定。在致病菌方面，研究發(fā)現(xiàn)拉曼光譜可以對單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森氏茵在屬、種和株3個層次上進行鑒定，樣品處理加拉曼光譜分析總時間少于2 h，屬于快速分析方法[49]。此外，研究發(fā)現(xiàn)拉曼光譜中拉曼位移1 520、1 330、1 030、875 cm-1僅存在于生物膜中，可以作為沙門氏菌生物膜的特征光譜[50]。獸藥殘留也是消費者關注的重要食品安全問題。翟晨等[7]和班晶晶等[8]使用表面增強拉曼光譜分析了肉中的獸藥殘留，結果表明拉曼光譜在獸藥殘留分析中具有較高的準確性。由此可見拉曼光譜不但可以對不同微生物進行快速、準確的判定，還能分析微生物的成膜特性進而為開發(fā)合理的抑菌殺菌措施奠定基礎。需要注意的是，獸藥的殘留量數(shù)量級較小，因此通常采用表面增強拉曼光譜技術進行分析。

表5 拉曼光譜在肉品營養(yǎng)成分中的應用Table 5 Application of Raman spectroscopy in prediction of nutrient content of meat

表6 拉曼光譜在肉與肉制品食品安全控制和摻假判定中的應用Table 6 Application of Raman spectroscopy in safety control and adulteration judgment of meat and meat products

2.4 拉曼光譜在肉與肉制品摻假分析中的應用

拉曼光譜技術在肉品中的應用涵蓋了pH值、嫩度、顏色、保水性、營養(yǎng)成分、貨架期與致病菌、摻假判斷等多個研究領域。除了上述應用外，拉曼光譜技術在肉品中還涉及抗氧化效果鑒定[53]、反復凍融牛肉鑒定[20, 34, 54-55]、判斷不同分割部位[9]等方面的研究。

3 總結與展望

拉曼光譜是一種基于拉曼散射效應的光譜分析技術。該技術具有快速、原位、無損檢測、無需樣品處理等特點，可以在分子水平上提供材料組成和結構變化的信息。目前，拉曼光譜廣泛應用于鮮肉和肉制品的研究。研究對象涵蓋了豬牛羊禽魚等多個物種的分割肉或肉制品，研究內(nèi)容則涵蓋測定或預測肉的pH、嫩度、顏色、保水性等食用品質(zhì)，以及肉的營養(yǎng)成分、貨架期、微生物及獸藥殘留等，且大部分研究得到較準確的分析、預測結果。研究結果明確了拉曼位移與肉品質(zhì)的關系，確立了某些肉的品質(zhì)的特征拉曼光譜，這些拉曼位移可以作為一種肉質(zhì)性狀的標記，也可以解釋肉質(zhì)性狀發(fā)展的內(nèi)在機制。在本文綜述的研究中，應用的激發(fā)波長有7種，應用最多的激發(fā)波長是671 nm和785 nm。光譜的預處理應用最多的是基線校正、平滑、均值中心化和標準化。在數(shù)據(jù)處理上，主成分分析、偏最小二乘回歸、偏最小二乘判別分析和留一法交叉驗證應用較多，且得到良好的分類和預測結果。拉曼光譜在預測肉類pH值、嫩度、顏色、保水性等食用品質(zhì)時具有較高的預測準確度。但拉曼光譜預測肉類嫩度時，不同的研究之間存在很大的差異。該技術還可以預測肉的營養(yǎng)價值，如肌內(nèi)脂肪含量、碘值、飽和、不飽和脂肪酸，但仍需要更多的研究來對預測模型進行改進和優(yōu)化。此外，拉曼光譜在肉類安全領域有著廣泛的應用，如預測肉和肉制品的貨架期，或通過拉曼光譜檢測肉類中的沙門氏菌屬。最后，拉曼光譜還可檢測肉類摻假，區(qū)分肉類來源的種類?？偠灾?，拉曼光譜是預測肉類品質(zhì)性狀、營養(yǎng)、肉類腐敗和病原體污染以及鑒別摻假的有力工具。本文總結了大量研究的樣品數(shù)量、激發(fā)波長、光譜及數(shù)據(jù)處理方法和結果準確性等，為拉曼光譜技術在肉類研究中的應用提供了技術參數(shù)指導和研究思路，并為研究肉制品品質(zhì)形成的機理提供了拉曼光譜這一新方法。

然而拉曼光譜在肉品中的應用還存在以下問題：第一，每個物種的分割肉塊或產(chǎn)品具有獨特的拉曼光譜，還需要大量掃描光譜數(shù)據(jù)并建立其與各品質(zhì)、安全指標間的關系以待應用。第二，目前拉曼光譜在肉品中的應用研究還處于少量樣品的科研階段，如何保證拉曼光譜在原料和環(huán)境復雜多變的生產(chǎn)中保持預測準確性，還需要科研人員努力解決。第三，不同研究在預測生鮮肉嫩度時準確性的差別較大，尚需要大量研究并結合日益發(fā)展的數(shù)理統(tǒng)計方法以提高拉曼光譜預測生鮮肉嫩度的準確性。雖然拉曼光譜在肉與肉制品中的應用還存在諸多問題，但是拉曼光譜快速、無損的檢測能力為工業(yè)化在線應用提供了可能，必將成為一個具有廣大應用前景的朝陽技術。