金華1號枇杷果實不同發(fā)育階段揮發(fā)性成分的變化

孫海艷，李澤冉，翁婷婷，宋艷娟，黨江波，向素瓊，何橋，郭啟高，梁國魯*

1(西南大學 園藝園林學院，重慶，400716)2(南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶，400716)

枇杷為薔薇科常綠喬木，原產我國西南(四川雅安境內大渡河流域)，已有2100多年的栽培歷史[1]。枇杷種植在全球30多個國家的南緯25度和北緯38度之間。據估計，世界年產量接近20萬t，主要集中在中國、日本、巴基斯坦、地中海國家(西班牙、阿爾及利亞、土耳其、塞浦路斯、埃及、希臘、突尼斯、以色列和意大利)等，葡萄牙、印度、巴西、智利和美國的產量較小[2]。枇杷秋萌冬花，春實夏熟，在百果中獨具先天四時之氣，被譽為獨冠時新的嘉果珍味[3]。

香氣是水果的重要品質參數，它與許多揮發(fā)性物質有關，如酯、醇、萜烯、酮、醛等[4]。水果中的許多揮發(fā)物會影響果實的香氣和風味，從而影響食品質量和消費者的偏好[5]。袁婷等[6]對7個白肉品種、15個紅肉品種枇杷成熟果肉的揮發(fā)性成分研究發(fā)現，醛類物質是枇杷果肉的主要揮發(fā)性化合物，正己醛是相對含量最高的揮發(fā)性物質。壬醛是對果肉風味貢獻率最高的揮發(fā)性物質。SUN等[7]的研究表明，D-檸檬烯、己醛、反-2-己烯醛、辛醛和壬醛是成熟枇杷果肉中含量最豐富的揮發(fā)性化合物。

鮮果的品質以及深加工產品的風味均與果實成熟度存在一定的關聯[8]。果實成熟是一個復雜的過程，果實的不同發(fā)育階段會對果實的香氣組成和含量有影響?？傮w上，前人對枇杷果實香氣物質的研究主要集中在果實的成熟階段，而有關果實發(fā)育進程中的香氣組成及變化規(guī)律的研究鮮有報道。本研究以紅肉枇杷‘金華1號’的果肉和果皮為材料，通過比較不同發(fā)育階段枇杷果實揮發(fā)性物質的差異,揭示果實發(fā)育成熟過程中香氣成分動態(tài)變化規(guī)律，為枇杷品質調控和加工利用提供參考信息和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘金華1號’枇杷品種的果實采自重慶市枇杷工程技術研究中心歇馬種質資源圃。根據花后果實生長時間和果皮顏色，初步將果實分為6個不同的發(fā)育階段，分別在：青果期(S1)，花后118～124 d；綠熟期(S2)，花后128～134 d；轉色期(S3)，花后140～144 d；褪綠期(S4)，花后146～151 d；半熟期(S5)，花后154～158 d；完熟期(S6)，花后160～166 d的果實作為試驗材料。每個發(fā)育階段，選取大小均勻、無病蟲害的30個果實，當天運至試驗室，將果皮和果肉分離，果肉去核后切成小塊，用液氮快速冷凍，在-80 ℃的條件下保存?zhèn)溆谩Ｋ袠悠肪O3個重復。

氯化鈉、壬酸乙酯和正構烷烴(C7～C30)，均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

QP2010氣相色譜-質聯用儀，日本島津公司(配有AOC-5000自動進樣萃取裝置)；G200高通量組織研磨儀，卡尤迪生物科技(北京)有限公司；20mL頂空進樣瓶，日本島津公司；1～5mL移液槍，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司。

1.3 實驗方法

揮發(fā)性物質測定：稱取5 g果皮或果肉冷凍樣品，加液氮用高通量組織研磨儀磨成粉末，放入20 mL頂空萃取瓶中，加入5 mL飽和NaCl溶液和壬酸乙酯(內標)，封口后混勻，置于AOC-5000自動進樣萃取裝置的萃取盤，頂空萃取 30 min后，自動進樣到GC-MS系統(tǒng)檢測。萃取針采用65 μm PDMS/DVB(Sigma 公司，美國)，色譜條件：Rtx-5MS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)標準色譜柱；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持 2 min，以3 ℃/min 升溫至 150 ℃保持1 min，再以 10 ℃/min的升溫至 220 ℃，保持 1 min， 最后以5 ℃/min 升溫至240 ℃保持 2 min；載氣為氦氣，流速1 mL/min，不分流進樣。質譜條件：離子源為電子電離(electron ionization，EI)源，離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃，電子能量 70 eV，掃描范圍 35～350m/z。含量以 μg/kg FW(Fresh weight)來表示，并取平均值。

1.4 數據分析

利用GC-MS聯用儀工作站所關聯的質譜庫NIST08結合保留指數RI(retention index)及 NIST Chemistry WebBook網站信息對揮發(fā)物進行鑒定。按內標法算出樣品各個組分的含量。方差分析軟件采用SPSS18.0，主成分分析(principal component analysis，PCA)和層次聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)采用MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca)進行分析，圖表繪制采用Excel 2019。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)育階段的枇杷單果重

由圖1可知，不同發(fā)育階段的枇杷平均單果重，青果期至轉色期單果重顯著增加，轉色期到褪綠期果實則生長緩慢。褪綠期開始果實生長較快，果重顯著增加，半熟期至成熟期果實增重放緩。

圖1 不同發(fā)育階段平均單果重Fig.1 Fruit weight at different development stages注：S1：青果期;S2：綠熟期;S3：轉色期;S4：褪綠期;S5：半熟期;S6：完熟期不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 不同發(fā)育階段揮發(fā)性成分類別

發(fā)育期內檢測到 61 種揮發(fā)物，果肉中檢測到59種，果皮52種，果皮和果肉共有50個物質，揮發(fā)性物質包括酮類(果肉8種，果皮6種)、酯類(果肉10種，果皮11種)、萜烯類(果肉9種，果皮5種)、醇類(果肉14種，果皮11種)、酸類(果肉1種，果皮1種)和醛類(果肉17種，果皮18種)，其中醛類物質的數量最多，為18種，醇類次之，酸類僅檢測到1種(附表1https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220922.1933.016.html)。從不同發(fā)育時期不同揮發(fā)性成分的總含量圖(圖2)可知，果皮和果肉中醛類物質含量最為豐富，果皮中半熟期和完熟期含量顯著增加，果肉中醛類物質在轉色期和綠熟期顯著降低。果皮中醇類和酯類的含量在青果期和綠熟期顯著高于其他時期，果肉中青果期醇類的含量顯著高于綠熟期及其他時期。除酮類和酯類外，不同發(fā)育階段果皮中醛、醇、萜烯和酸類物質含量顯著高于果肉。

2.3 不同發(fā)育階段揮發(fā)性成分組成與含量變化

由附表1可知，醛類物質中順-3-己烯醛、己醛、反-2-己烯醛和壬醛含量最為豐富，且在相同的發(fā)育時期，果皮中相同揮發(fā)性物質的含量高于果肉中的。順-3-己烯醛僅在青果期和綠熟期的果肉中檢測到，平均含量分別為30.09、48.27 μg/kg，在果皮中則是在青果期至褪綠期四個時期檢測到，綠熟期的含量最高，為66.23 μg/kg；己醛、反-2-己烯醛和壬醛在果肉的半熟期含量最高，己醛、反-2-己烯醛在果皮成熟期的含量最高，分別比青果期的含量增加了8.0倍和1.5倍，達到了172.63、679.27 μg/kg，壬醛在綠熟期的含量最高，為91.93 μg/kg。醛類中順-3-己烯醛、己醛、反-2-己烯醛和反-2-壬烯醛及反，順-2，6-壬二烯醛是不飽和脂肪酸通過脂氧合酶途徑生成的C6/C9短鏈脂肪醛，具有新鮮割草的獨特氣味，屬于‘青香型’香氣物質[9-10]，也被稱為綠葉氣味組分(green leaf volatiles，GLVs)。醇類中在成熟過程中果肉和果皮中含量豐富的為反-2-己烯醇、己醇，且果皮的含量顯著高于果肉，完熟期時果皮中的含量分別為31.92、31.53 μg/kg。順-3-己烯醇在果皮綠熟期的含量顯著高于其他時期，為148.59 μg/kg，是成熟期含量的3.3倍，在果肉中僅在青果期和綠熟期檢測到，含量分別為16.05、2.42 μg/kg。反-2-己烯醇、己醇、順-3-己烯醇及果皮和果肉中都含有的反-2-壬烯醇等C6/C9醇是對應的反-2-己烯醛、己醛、順-3-己烯醛和反-2-壬烯醛等C6/C9醛依次在相應的醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase，ADH)的催化作用下進一步生成的[11]。

酯類物質中2-甲基丁酸甲酯在成熟期的果肉中含量最為豐富，為10.06 μg/kg，比青果期的含量增加了250倍，果實發(fā)育過程中，果皮中含量雖不斷提高，但顯著低于果肉中的。而含量最高的順-3-己烯基乙酸酯僅在青果期和綠熟期檢測到，果皮中含量高于果肉，分別為43.41、59.07 μg/kg。C6酯類中乙酸己酯和反-2-己烯基乙酸酯也僅在青果期和綠熟期檢測到，且果皮含量顯著高于果肉。順-3-己烯基乙酸酯、乙酸己酯和反-2-己烯基乙酸酯是順-3-己烯醇、己醇和反-2-己烯醇在醇-?；D移酶(alcohol acyltransferases，AAT)的作用下進一步生成的相應C6酯[11]。

萜烯類物質中僅在成熟期果肉中檢測到的α-松油烯含量最高，為1.71 μg/kg，另外順式-β-羅勒烯、莰酮和異松油烯也僅在果肉中檢測到。果皮成熟期D-檸檬烯的含量最為豐富，為0.75 μg/kg,比綠熟期的最高含量降低了41.8%，果肉成熟期D-檸檬烯的含量僅低于α-松油烯，為0.21 μg/kg。

僅在果皮和果肉檢測到1種酸類物質(2-甲基丁酸)，在果肉中褪綠期時含量最高，之后不斷降低，在果皮中的含量顯著高于果肉。

酮類物質中β-紫羅蘭酮和6-甲基-5-庚烯-2-酮的含量最豐富。與青果期含量相比，完熟期果肉中β-紫羅蘭酮含量增加了22.4倍，達到1.21 μg/kg，完熟期時果皮中的平均含量增加了3.8倍，達到2.66 μg/kg。果實發(fā)育過程中，完熟期果皮中6-甲基-5-庚烯-2 -酮的平均含量顯著低于綠熟期的，在果肉中半熟期的含量達到最高，為4.21 μg/kg。大馬士酮僅在果肉的綠熟期檢測到，而二氫獼猴桃內酯僅在果肉的半熟期檢測到。

2.4 不同發(fā)育階段果皮和果肉中特征香氣的香氣活力值與香氣特征比較

果實的風味不僅僅由各香氣組分其相對濃度或者絕對濃度決定，該組分的香氣活力值也發(fā)揮著重要作用。香氣活力值(odour activity value,OAV)指的是該組分的檢測濃度與其閾值濃度的比值[12]，當OAV≥1時對樣品香氣組成有貢獻，并且OAV越大，該組分對該品種的貢獻也越大[13]。

由表1可知，成熟過程中，果皮和果肉中共檢測到21種OAV≥1的香氣成分，包括酯類3種，酮類3種，最多的香氣成分為醛類，共13種，醇類2種(表2)，其中包含10種C6/C9醛、醇和酯類。在鑒定出的香氣成分中，果實成熟過程果皮中(反,反)-2,4-庚二烯醛、β-紫羅蘭酮和1-辛烯-3-酮的OAV較高，在23.53～858.18，果皮中反-2-己烯醛、己醛、(反,反)-2,4-壬二烯醛在各發(fā)育階段的OAV也較高，在7.99～71.93；順-3-己烯醛在青果期至褪綠期的香氣活力值在129.47～264.93，順-3-己烯基乙酸酯的OAV在10以上，但僅在青果期和綠熟期檢測到，分別為11.13和15.15；具有青香味的反-2-壬烯醛、(反,順)-2,6-壬二烯醛和辛醛在果皮中的OAV也較高。果肉中OAV較高的為β-紫羅蘭酮、2-甲基丁酸甲酯和1-辛烯-3-酮，盡管順-3-己烯醛的香氣值在100以上，但只在青果期和綠熟期檢測到，大馬士酮的OAV雖為104.38，僅出現在綠熟期的果肉中。具有青香味的己醛和反-2-壬烯醛在發(fā)育階段的果肉中OAV也較高，在2.80～10.77。順-3-己烯醇、庚醛、1-辛烯-3-醇、乙酸己酯、壬醛、反-2-辛烯醛、癸醛和β-環(huán)檸檬醛的OAV均小于4.0。

2.5 不同發(fā)育階段基于特征香氣成分的主成分分析和層次聚類分析

對6個發(fā)育時期21種特征香氣成分進行主成分分析，如圖3所示。第一主成分PC1和第二主成分PC2的貢獻率分別為69.6%和14.0%，總貢獻率達到83.6%。如圖3所示，整體上可聚為四類：果皮和果肉的青果期(S1)和綠熟期(S2)與順-3-己烯醛、順-3-己烯基乙酸酯、乙酸己酯和β-大馬士酮聚集在一類；果肉的轉色期(S3)和褪綠期(S4)、半熟期(S5)和成熟期(S6)與2-甲基丁酸甲酯聚在一類。果皮的轉色期(S3)和褪綠期(S4)與1-辛烯-3-酮、辛醛、反-2-辛烯醛、癸醛、正庚醛、1-辛烯-3-醇、反-2-壬烯醛、(E)-2-己烯醛、正己醛、順-3-己烯醇、壬醛、(反,反)-2,4-庚二烯醛、(反,反)-2,4-壬二烯醛及(反,順)-2,6-壬二烯醛聚在一類；而果皮的半熟期(S5)和成熟期(S6)與β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮聚在一類。

表1 不同發(fā)育階段香氣活力值Table 1 Odour activity values (OAVs) at different development stages

在圖4的HCA模型中，‘金華1號’的果實總體上可以被清楚地分為Ⅰ和Ⅱ兩大類,Ⅰ和Ⅱ類又被區(qū)分為兩個亞類：Ⅰ-1為果肉的S3、S4、S5、S6期, Ⅰ-2為果皮的S5和S6期;Ⅱ-1為果皮和果肉的S1、S2期，Ⅱ-2為果皮的S3和S4期。綜合PCA分析和HCA分析的結果，‘金華1號’枇杷發(fā)育和成熟過程中，果實中的特征香氣成分在成熟前期以青草香和果香型為主，轉色期后果皮以青香味、花香為主，果皮中轉色期(S3)和褪綠期(S4)的香氣物質豐富，果肉則以果香為主。

A-得分圖;B-載荷圖圖3 果皮和果肉中特征香氣成分PCA分析Fig.3 PCA analysis based on the concentration of characteristic aroma compounds in peel and pulp during ripening

圖4 果皮和果肉中特征香氣成分HCA分析Fig.4 HCA analysis based on the concentration of characteristic aroma compounds in peel and pulp during ripening注：S1：青果期;S2：綠熟期 S3：轉色期;S4：褪綠期;S5：半熟期;S6：完熟期;BP：果皮;BR：果肉

2.6 感官評價

感官評價參考陳薇薇[14]的感官評價得分表(表2)，對不同發(fā)育時期的果實進行風味強度和香氣強度評價，第S3時期即轉色期專業(yè)小組成員已明顯感覺到了金華1號典型的枇杷香氣，從第S3到第S6時期的成熟過程中，香氣強度基本不變，并趨于穩(wěn)定。金華1號的風味強度在第S6時期達到了最大值，前5個成熟過程呈現緩慢上升趨勢。

表2 感官評價得分表Table 2 Attributes scored by a sensory evaluation panel

3 討論和結論

通過頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜分析從‘金華1號’6個不同發(fā)育時期的果實中共鑒定出61種揮發(fā)性物質，主要類別包括酮類、酯類、萜烯類、醇類、酸類和醛類，其中醛類物質的數量最多，含量也最豐富。梁乘榜[15]對7個時期‘金豐一號’和‘冠玉’果實發(fā)育過程中揮發(fā)性成分的研究表明，‘金豐一號’平均含量最高的是醛類，‘冠玉’中醛類總含量最高，本研究中的結論與梁乘榜[15]的結論相似。順-3-己烯醛、己醛、反-2-己烯醛和壬醛是含量豐富的醛類，在成熟過程中果肉和果皮中含量豐富的醇類為反-2-己烯醇和己醇，果皮中為順-3-己烯醇。本實驗中，C6醛、醇以及相關酯在青果期和綠熟期內都可以被檢測到，且果皮中的含量基本上高于果肉中的，只是各種香氣成分含量變化存在不一致性，而轉色期后，3個C6酯均未在果肉和果皮中被檢測到，表明青果期和綠熟期以亞麻酸和亞油酸為底物的GLVs生物合成途徑中13-氫過氧化物路徑較活躍[16];另外綠熟期中3種酯類的含量都顯著高于青果期，表明青果期至綠熟期不飽和脂肪酸含量逐漸升高，底物充足；進入轉色期后己烯酯與己酯揮發(fā)物未檢測到，推測為底物不飽和脂肪酸含量減少導致的[17]。本研究中檢測到C6酯類在目前枇杷不同發(fā)育階段的文章中[14-15,18]均未見報道，這在‘金華1號’枇杷的香氣品質構成中起關鍵作用。

在果實發(fā)育過程中能夠被檢測到的揮發(fā)性物質很多，但對品種風味有貢獻的香氣物質并不多。在FR?HLICH等[19]的研究中，認為反-2己烯醛、苯甲醛和己醛為枇杷的主要香氣成分；蔣際謀等[20]的研究表明，反-2-已烯醛、正己醛、正辛醛、D-檸檬烯、乙酸蘇合香酯、庚酸烯丙酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯等為枇杷的特征香氣成分；BESADA等[18]研究了2個枇杷品種不同成熟時期的揮發(fā)性成分，研究顯示，欖香素、順-2-己烯-1-醇、2-甲基丁酸甲酯、3,4,5-三甲氧基苯甲酸酯、反-香葉基丙酮、反-甲基肉桂酸、反-2-癸烯醛、1-羥基苯基酮為枇杷的特征香氣成分。OAV是評價香氣化合物重要性的一個指標，能更好的衡量一個香氣物質對香氣的貢獻程度[21]。本研究中，共檢測到21種香氣成分OAV>1，其中β-紫羅蘭酮、(反,反)-2,4-庚二烯醛、2-甲基丁酸甲酯、1-辛烯-3-酮、反-2-己烯醛、己醛、(反,反)-2,4-壬二烯醛、反-2-壬烯醛、辛醛和(反,順)-2,6-壬二烯醛等在整個發(fā)育過程對品種的香氣貢獻最大。在OAV>1的21種香氣成分中，除2-甲基丁酸甲酯果肉中的香氣活力值高于果皮、大馬士酮僅在果肉中檢測出外，其余香氣成分果皮的香氣活力值基本上高于果肉。一般來說，果皮和果肉中的香氣物質的組成無顯著差異，但果皮中香氣物質的含量要高于果肉中[22]。盧娟芳等[23]對新疆杏果皮和果肉特征香氣成分的研究表明萜類、萜烯類、醇類和醛類、內酯類物質在果皮中的含量顯著高于果肉中，但果肉中酮類物質的含量卻顯著高于果皮中。本研究結果中醛類、醇類和C6酯類的結果與其結果相似，但酮類中β-紫羅蘭酮和1-辛烯-3-酮的結果確與其結果不同，這可能是枇杷‘金華1號’獨特的香氣品質特點。本研究結論中鑒定到的對‘金華1號’枇杷香氣有重要貢獻的10種成分，與本研究中含量豐富的揮發(fā)性物質的結果也有不同，原因在于雖然該物質含量豐富，但該香氣成分的閾值也高，如醛類中的壬醛，酮類中的6-甲基-5-庚烯-2-酮的閾值達到50 μg/L，轉換為香氣活力值后，則值較低。本研究中關鍵香氣成分與前人的研究結果不同，除了鑒定方法不同以外，可能也與不同的品種有不同的特征香氣有關。

‘金華1號’枇杷發(fā)育和成熟過程中，果實中的特征香氣成分在成熟前期以青草香和果香型為主，轉色期后果皮以青香味、花香為主，果皮中轉色期(S3)和褪綠期(S4)的香氣物質豐富，果肉則以果香為主。該結果可為枇杷凍干果茶、枇杷膏等深加工產品提供參考依據。