四極桿-軌道阱液質(zhì)聯(lián)用法同時檢測玉米中四種真菌毒素

吳紅濤，李萌萌，關(guān)二旗，劉遠(yuǎn)曉，王瑞虎，卞科

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州，450000)

受新冠疫情與暴雨等極端天氣的影響，國際糧價指數(shù)飆升，糧食安全問題受到了人們格外的關(guān)注。糧食中真菌毒素的檢測是食品安全的一大防線，近年來，玉米中真菌毒素污染嚴(yán)重，GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中尚未限量的伏馬毒素污染率與污染水平不容樂觀[1]。但玉米中多種毒素分析的研究報道[2-3]中鮮有包含伏馬毒素的多種毒素同時分析方法，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 6133—2018《糧油檢驗 主要谷物中16種真菌毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》給出了黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)、赭曲霉毒素A(ochratoxins A，OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、伏馬菌素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)的同位素內(nèi)標(biāo)液質(zhì)聯(lián)用同時檢測方法。確定一種包含伏馬毒素的經(jīng)濟(jì)、簡單的多種毒素同時分析方法對糧食監(jiān)管和食品安全意義重大。

真菌毒素是一種耐熱的低分子質(zhì)量次生代謝物(300～700 Da)，主要由鏈格孢霉(Alternaria)、曲霉(Aspergillus)、棒曲霉(Clavatus)、鐮刀菌(Fusarium)和青霉(Penicillium)等真菌產(chǎn)生，是其防御機(jī)制的一部分[4-5]。真菌毒素是最重要的慢性飲食危險因素，高于食品添加劑和農(nóng)藥殘留[6]，世界衛(wèi)生組織估計全世界每年受真菌毒素污染的糧食作物約占25%，但最新統(tǒng)計顯示，這一比率高達(dá)60%～80%[7-8]。真菌毒素分子質(zhì)量低并且具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，這制約了分析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的開發(fā)[9]。傳統(tǒng)的真菌毒素檢測包括薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜-熒光檢測(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等方法，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度，是多種毒素同時分析的最佳方案[10-11]。多種毒素同時分析的主要障礙是基質(zhì)干擾和分析物的化學(xué)多樣性以及可能存在的分析物之間的交叉干擾。液質(zhì)分析中，共提取的樣品基質(zhì)會降低或提高分析物的電離效率，對響應(yīng)值造成信號抑制或增強(qiáng)，這是由于電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)過程中液滴表面張力的變化，或是由于化合物之間競爭液相中的電荷[12]。目前去除基質(zhì)干擾的方法主要有基質(zhì)匹配校準(zhǔn)、內(nèi)標(biāo)法以及對提取液進(jìn)行稀釋或者凈化。內(nèi)標(biāo)物一般使用同位素標(biāo)記的分析物或者與分析物結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物質(zhì)，但都難以商業(yè)化，并且合成標(biāo)記真菌毒素需要熟練的操作人員以維持合成過程穩(wěn)定的同位素比率。真菌毒素檢測中常用的凈化方法有免疫磁珠，免疫親和柱法和QuEChERS[13-14]，但可能存在操作復(fù)雜、成本高、準(zhǔn)確性低的問題。本文將玉米粉粗提液稀釋后進(jìn)行低溫高速離心，以去除色素、脂質(zhì)、蛋白等基質(zhì)的干擾，然后進(jìn)入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測分析，并與QuEChERS方法進(jìn)行比較，確定一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效的多種毒素分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品購買自2020年收獲河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)家玉米，攪拌器混勻后取2 kg，分樣器縮分至500 g，萬能粉碎機(jī)研磨至40目篩網(wǎng)篩上物<5%，混合篩上物篩下物，-20 ℃保存待測。

從網(wǎng)上和收糧點購買河南和東北不同地區(qū)2021年收獲的玉米樣品各50 kg，按上述進(jìn)行處理，-20 ℃保存，用于自然發(fā)病玉米樣品中真菌毒素的檢測。

AFB1、ZEA、OTA、FB1標(biāo)準(zhǔn)品(規(guī)格1 mg，純度≥99%)，百靈威科技有限公司；色譜級甲醇、甲酸、乙腈、乙酸銨，美國賽默飛世爾科技有限公司；分析純乙腈，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DC-12氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；HJ-6A恒溫磁力攪拌器，金壇市華峰儀器有限公司;5810R高速離心機(jī)，德國Eppendorf儀器有限公司;Ultimate 3000-Q Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技有限公司;A10超純水系統(tǒng)，Millipore生命科學(xué)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

AFB1、ZEA、OTA、FB1標(biāo)準(zhǔn)品1 mg分別使用10 mL色譜級乙腈溶解，配制100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，貯存于-20 ℃冰箱中。制備混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并系列稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，貯藏于4 ℃冰箱，每周更新，其中，AFB1、ZEA、OTA、FB1系列梯度分別為0.2、0.5、1、2、3、4、5 μg/L，1、2.5、5、10、15、20、25 μg/L，0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 μg/L，100、250、500、1 000、1 500、2 000、2 500 μg/L。

1.3.2 玉米中真菌毒素提取

取50 g玉米粉加入200 mL提取液，室溫提取，4 000 r/min離心20 min，取0.5 mL上清液加入0.5 mL超純水渦旋混勻，低溫高速離心15 min脫脂(12 000 r/min，3 ℃)，取澄清部分于進(jìn)樣瓶中待測。每個提取樣設(shè)置6個平行。

1.3.3 色譜條件

C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm, Thermo Scientific Syncronis)，柱溫35 ℃，流動相A：含5 mmol/L乙酸銨和0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水，流動相B：甲醇，流速0.3 mL/min, 進(jìn)樣量10 μL，流動相梯度如表1所示。

表1 流動相梯度Table 1 Mobile phase gradient

1.3.4 質(zhì)譜條件

ESI離子源，軌道阱質(zhì)譜，掃描模式一級全掃，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如表2所示。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters

1.3.5 基質(zhì)干擾評估

使用空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)品與乙腈溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，評估蛋白、脂質(zhì)、色素等對毒素檢測的干擾效果。用玉米陰性樣品的基質(zhì)提取液配制4種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中AFB1、ZEA、OTA、FB1的質(zhì)量濃度梯度分別為0.2、0.5、1、2、3、4、5 μg/L，1、2.5、5、10、15、20、25 μg/L，0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 μg/L，100、250、500、1 000、1 500、2 000、2 500 μg/L，基質(zhì)的信號抑制或增強(qiáng)作用按公式(1)計算，>1表示信號增強(qiáng)，<1表示信號抑制。

(1)

式中：k基質(zhì)提取液表示系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品在玉米基質(zhì)提取溶液中的斜率；k有機(jī)溶劑表示系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品在有機(jī)溶劑中的斜率。

1.3.6 方法驗證

對方法進(jìn)行驗證，測定方法的檢測限、定量限、線性范圍、重現(xiàn)性、重復(fù)性以及加標(biāo)回收率。檢測限和定量限通過逐級稀釋獲得，同一天內(nèi)測定多次和不同天內(nèi)多次測定評價方法的重現(xiàn)性和重復(fù)性。添加低濃度和高濃度的4種標(biāo)準(zhǔn)品測定方法的加標(biāo)回收率，并與QuEChERS方法進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有樣品均測試6次，實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，使用Microsoft Office Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Origin 2021繪圖。使用單因素ANOVA檢驗進(jìn)行多組間比較，鄧肯分析進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異，P<0.01表示在統(tǒng)計學(xué)上具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的優(yōu)化

不同提取方式的提取效率決定了檢測方法的準(zhǔn)確度。常見的谷物中真菌毒素提取方式有振蕩、攪拌、超聲、渦旋等，也有部分使用溫度、微波、磁場等輔助提取。本文研究了室溫條件下回旋振蕩(調(diào)速中等)和磁力攪拌(最大轉(zhuǎn)速300 r/min)2種提取方式的差異，使用含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的79%(體積分?jǐn)?shù))乙腈作為提取劑，2種方法分別提取陰性加標(biāo)樣品20 min，經(jīng)同樣處理后進(jìn)樣檢測。如圖1所示，回旋振蕩對ZEA和OTA提取效果較差，可能是由于振蕩時間不充分導(dǎo)致[15-16]，或是由于振蕩提取過程中玉米粉部分沉積于溶劑底部，與提取溶液接觸不充分。而磁力攪拌過程中由于磁力轉(zhuǎn)子的作用，樣品與提取劑始終處于渦旋狀態(tài)，對4種真菌毒素能達(dá)到很好的萃取效果[16]，回收率為90%～110%。

圖1 不同提取方式的回收率Fig.1 Recovery of different extraction methods注：每種毒素類別的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.2 提取時間的優(yōu)化

基于2.1研究結(jié)果，選擇磁力攪拌作為提取方式。為確定最佳的提取時間，分析比較了提取10、20、30 min時的提取效果。如圖2所示，過長的提取時間對提取效率并沒有顯著提高，甚至?xí)档蛯δ繕?biāo)分析物的提取效果，這可能是由于提取時間過長時會大量溶出基質(zhì)中的雜質(zhì)，干擾了分析物的檢測[3,17]。提取時間10 min對ZEA和OTA的提取率較低，僅能達(dá)到70%左右的回收率；提取時間20 min時，4種毒素均有很好的提取效果，回收率均為80%～100%，提取時間30 min時，AFB1和OTA的回收率出現(xiàn)降低，OTA的回收率僅為60%。綜合以上研究結(jié)果，提取20 min時，4種真菌毒素回收率均能達(dá)到80%～120%，因此，后續(xù)實驗選擇磁力攪拌的提取時間為20 min。

圖2 不同提取時間的回收率Fig.2 Recovery at different extraction times

2.3 提取劑的優(yōu)化

真菌毒素常見的提取劑為酸化水與有機(jī)溶劑的混合溶液，本文比較了50%乙腈、75%乙腈、含1%乙酸的74%乙腈和含1%乙酸的79%乙腈4種溶劑對玉米中4種真菌毒素提取效果的差異。如圖3所示，50%乙腈對AFB1、ZEA和OTA的提取效果較差，回收率為60%～80%，增加有機(jī)溶劑的比例時，回收率有顯著提高。這可能是由于AFB1、ZEA和OTA都是弱極性化合物，增加有機(jī)相比例可以顯著提升萃取效果，而水溶性的FB1由于極性較強(qiáng)，表現(xiàn)出相反的結(jié)果[18-19]。pH變化對AFB1、ZEA和OTA的回收率沒有顯著影響，加入冰乙酸后FB1的回收率有顯著提升，這可能與FB1具有多個羧基，有一定酸性有關(guān)[20]。含1%乙酸的74%乙腈和含1% 乙酸的79%乙酸對4種毒素均能達(dá)到很好的提取效果，回收率在80%以上，但后者更高的有機(jī)相比例對AFB1和ZEA有更好的萃取效果，因此，選擇含1%乙酸的79%乙腈作為提取溶劑。

圖3 不同提取劑的回收率Fig.3 Recovery of different extractants

2.4 分析方法的驗證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)在“IUPAC Recommendations 2002”中提出了表觀回收率(apparent recovery，RA)與回收率(recovery，RE)的概念，表觀回收率即常見的方法回收率，用來表征方法的可行性，表觀回收率受兩因素影響——基質(zhì)干擾和提取效率，表觀回收率去除基質(zhì)的干擾效果后即為回收率，其中表觀回收率計算過程如公式(2)所示：

(2)

式中：k加標(biāo)樣品表示系列濃度梯度加標(biāo)樣品的斜率；k有機(jī)溶劑表示系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品在有機(jī)溶劑中的斜率。

實驗結(jié)果表明，AFB1的定量檢測有很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，表現(xiàn)出明顯的信號抑制(圖4)，OTA存在較弱的信號抑制，但低溫高速離心凈化后取得了很好的回收率，說明低溫高速離心能取得很好的基質(zhì)凈化作用。在添加低濃度和高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品時(表3)，方法的回收率均>90%，相對誤差為0.7%～2.2%，說明本方法可行。

a-AFB1；b-FB1；c-ZEA；d-OTA圖4 四種毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溶劑環(huán)境下的色譜峰面積Fig.4 Chromatographic peak areas of four toxin standard solutions in different solvent environments

表3 添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品時方法的回收率Table 3 Recovery of the method when different concentrations of standards are added

2.4.2 線性范圍和檢測限

梯度稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液至本儀器能檢測到的最低濃度，采用逐級稀釋的方法測定本方法的檢出限和定量限(表4)，定量限為0.42～314 μg/kg，均在限量值之內(nèi)，可以滿足檢測需求。

2.4.3 方法的重現(xiàn)性和重復(fù)性

AFB1、FB1、ZEA和OTA 4種真菌毒素的質(zhì)量濃度分別為1、250、2.5、0.25 μg/L，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計算5次峰面積平均值，測定重現(xiàn)性；3 d連續(xù)進(jìn)樣，計算峰面積平均值，測定重復(fù)性。相對誤差為0.4%～6.7%(表5)，方法精密度良好。

表4 方法的線性范圍和檢測限、定量限Table 4 Linear range, detection limit and quantitation limit of the method

表5 方法的重現(xiàn)性和重復(fù)性Table 5 reproducibility and repeatability of the method

2.4.4 方法與QuEChERS比較

QuEChERS作為一種經(jīng)濟(jì)、簡單、適應(yīng)性強(qiáng)的前處理方法，不僅廣泛應(yīng)用于果蔬的農(nóng)殘檢測，在真菌毒素檢測領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。將此方法與QuEChERS前處理方法相比較[21]，發(fā)現(xiàn)兩者對AFB1、ZEA和OTA均能達(dá)到很好的萃取效果，回收率均能達(dá)到80%以上(圖5)。但對于包含F(xiàn)B1的多種毒素檢測，本方法具有優(yōu)勢，因為QuEChERS的鹽析過程可能會導(dǎo)致親水性FB1的萃取較差，并且常用的吸附凈化劑PSA也會通過離子交換作用吸附FB1，對FB1的定量分析造成干擾[17]。范志辰等[17]在不使用吸附凈化劑的條件下，飼料玉米中FB1回收率可以達(dá)到(104.8±10.7)%；胡文彥等[22]不使用凈化劑檢測嬰幼兒谷基輔助食品中9種真菌毒素，F(xiàn)B1回收率可以達(dá)到(88.9±6.3)%，說明此方法可以達(dá)到與QuEChERS一致的多種毒素同時檢測效果。

圖5 與QuEChERS方法的回收率比較Fig.5 Comparison of recovery between QuEChERS method and QuEChERS method

2.4.5 自然感染毒素玉米樣品檢測

采用上述優(yōu)化后的方法檢測2021年新收獲河南、東北不同產(chǎn)地的自然感染真菌毒素玉米樣品，結(jié)果如表6所示。分析結(jié)果可知，自然發(fā)病玉米中，F(xiàn)B1和AFB1污染較為普遍，部分樣品檢測出ZEA，但OTA均未檢出。采集自河南省的玉米樣品，AFB1和FB1污染嚴(yán)重，這可能與河南地區(qū)2021年7月長期暴雨天氣有關(guān)；由于東北地區(qū)氣溫較低，玉米中真菌毒素污染并不嚴(yán)重。本研究所優(yōu)化的提取檢測技術(shù)可以很好的對自然發(fā)病玉米樣品中多種真菌毒素進(jìn)行定性定量測定，檢測方法簡單，所需耗材少，經(jīng)濟(jì)成本低，可以滿足糧食收儲及加工企業(yè)的需求。

表6 玉米樣品真菌毒素污染情況Table 6 Mycotoxin contamination of corn samples

3 結(jié)論

本研究通過對提取方式、提取劑和提取時間進(jìn)行優(yōu)化，確定了一種經(jīng)濟(jì)、高效、簡單的液質(zhì)聯(lián)用多種毒素分析方法，能同步檢測玉米中的AFB1、ZEA、OTA和FB1含量。該方法使用酸化水與有機(jī)溶劑的混合溶液提取玉米樣品，通過稀釋和低溫高速離心去除玉米基質(zhì)的干擾，使用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量分析，對4種真菌毒素的回收率為90%～105%，定量限為0.42～314 μg/kg。該方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，穩(wěn)定性好，并且不需要使用免疫親和柱、凈化劑等材料，大大降低了多種真菌毒素同時分析的經(jīng)濟(jì)成本。