靈芝雙向發(fā)酵液對于HaCaT細胞中波紫外線損傷的修復研究

張影，孟憲瑤，楊云麗，郭苗苗，周衛(wèi)強，李麗*

1(北京工商大學 化學與材料工程學院，北京，100048)2(北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京，100048) 3(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京，102209)

靈芝(Ganoderma)又名神芝、瑞草，是多孔菌科真菌赤芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.]或紫芝(GanodermasinenseZhao, Xu et Zhang)的干燥子實體，作為我國藥食兩用傳統(tǒng)名貴中藥，是我國最知名的藥用真菌物種之一[1-2]?！侗静菥V目》中記載“靈芝性平，味苦，無毒，主胸中結(jié)，益心氣，補中，增智慧，不忘，久服輕身不老，延年神仙”?，F(xiàn)代藥理學研究證實靈芝含有靈芝多糖、靈芝三萜類化合物、氨基酸等多種生物活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、保肝護肝等藥理作用[3-5]，還可以減輕氧化應激，阻止紫外線對皮膚細胞造成光損傷[6-7]。

子實體的靈芝原料成本普遍較高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，將靈芝的菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中，以一定轉(zhuǎn)速和溫度進行培養(yǎng)，菌絲體在培養(yǎng)基中獲得合成代謝產(chǎn)物或生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式稱為靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)。液體深層發(fā)酵技術因其生產(chǎn)周期短、效率高、產(chǎn)量大、品質(zhì)穩(wěn)定，已經(jīng)成為開發(fā)利用靈芝資源的重要途徑[6,8-9]。添加玉竹、樺樹茸、人參等藥材既可以為菌絲體提供大量營養(yǎng)活性成分，同時其藥效成分又可被菌絲體產(chǎn)生的酶催化產(chǎn)生大量新的活性物質(zhì)[10]。

中波紫外線(ultraviolet radiation b，UVB)，波長290～320 nm，是誘發(fā)皮膚損傷的主要因素之一，UVB能夠作用于皮膚表面的角質(zhì)形成細胞，引起皮膚的光損傷，激活細胞產(chǎn)生白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎癥因子，造成日曬紅斑、水皰等皮膚損傷[11-13]。IL-1α是一個典型的炎癥促進分子，屬于白細胞介素-1(IL-1)的成員范圍，可以誘導炎癥基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的炎癥信號可誘導白細胞介素-1β(IL-1β)的釋放和活化，激發(fā)和維持炎癥特性，在炎癥和免疫反應的發(fā)生中起重要作用[14-15]。PGE2是前列腺素(prostaglandin，PG)中作用最強的一種，廣泛存在于動物和人體中，手術的應激和損傷刺激均可使PGE2水平上升[16]。PGE2可以直接激活傷害性感受器，提高痛覺感受器對緩激肽和其他致痛因子的敏感性，從而引起或放大疼痛[17-18]。人角質(zhì)形成細胞(human immortalized keratinocytes，HaCaT)是一種來自成年人類的永生化角質(zhì)形成細胞，具有與正常人角質(zhì)形成細胞相似的特征，在研究中常作為細胞炎癥模型[19-20]。

因此，本研究利用液體深層發(fā)酵技術對靈芝進行培養(yǎng)，通過添加玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.) Druc]、樺樹茸(Inonotusobliquus)、人參(PanaxginsengC.A.Mey.)及三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]藥材粉末，發(fā)酵制備靈芝(S1)、靈芝-玉竹(S2)、靈芝-樺樹茸(S3)、靈芝-人參(S4)以及靈芝-三七(S5)發(fā)酵液凍干粉，利用UVB照射HaCaT細胞產(chǎn)生光損傷模擬皮膚表皮組織中角質(zhì)形成細胞的光損傷，建立UVB誘導的HaCaT細胞光損傷模型，通過檢測樣品S1～S5對HaCaT細胞炎癥因子IL-1α及PGE2分泌的抑制作用，探究S1～S5修復UVB光損傷的能力，進而篩選出最優(yōu)的靈芝發(fā)酵組合方式，為靈芝組合發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供前提和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本次實驗所用菌種為靈芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Kars，CICC14024]，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)；玉竹(P.odoratum)，購自中國北京同仁堂有限責任公司；樺樹茸(I.obliquus)、人參(P.ginseng)、三七(P.notoginseng)，購自河北安國東方藥城。

本次實驗所用細胞為角質(zhì)形成細胞(批次：EP200708；代次：P7)，由廣東博溪生物科技有限公司通過細胞原代、傳代培養(yǎng)獲得。

PBS，博士德生物工程有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、地塞米松，默克化工技術(上海)有限公司；人IL-1α ELISA試劑盒、人PGE2 ELISA試劑盒，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設備

Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；MH-1微量振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Epoch酶標儀，美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液凍干粉制備工藝

二級種子液培養(yǎng)，首先配制發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(g/L):在S1～S5發(fā)酵罐中加入葡萄糖35、蛋白胨5、酵母粉2.5、KH2PO41、七水硫酸鎂0.5,維生素B10.05，然后在S2、S3、S4、S5發(fā)酵罐中分別加入玉竹、樺樹茸、人參及三七藥材粉末10，121 ℃，滅菌20 min，按照10%的接種量接種，在28 ℃，150 r/min的搖床中發(fā)酵7 d后，超聲30 min后滅菌處理，4 ℃冰箱中靜置1～2 d，抽濾，收集濾液，制備凍干粉。

1.3.2 HaCaT細胞模型建立

1.3.2.1 細胞毒性實驗

細胞接種：按1×104個/孔的接種密度接種細胞至96孔板，培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中孵育過夜。

實驗分組：實驗設置調(diào)零組、溶劑對照組、陽性對照組與樣品組。樣品組中，每個樣品設置8個濃度梯度，每個濃度梯度下設置3個重復孔。

配液：按照設定的測試濃度，使用樣品S1～S5凍干粉配制不同濃度的受試物工作液(表1)。

表1 MTT細胞毒性實驗樣品測試質(zhì)量濃度 單位：mg/mL

給藥：待96孔板中細胞鋪板率達到40%～60%時進行給藥。調(diào)零組無細胞接種，僅加入200 μL的細胞培養(yǎng)液；溶劑對照組每孔加入200 μL的培養(yǎng)液；陽性對照組每孔加入200 μL含10%(體積分數(shù))DMSO的培養(yǎng)液；樣品組每孔加入200 μL含有相應濃度受樣品的培養(yǎng)液。給藥完成后將96孔板放置在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。

檢測：細胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄掉上清液，加入MTT工作液(0.5 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用)，37 ℃避光孵育4 h，孵育結(jié)束后，棄掉上清液，每孔加150 μL DMSO，在490 nm處讀取OD值。根據(jù)公式(1)計算細胞相對活力。

(1)

1.3.2.2 細胞形態(tài)學檢測

細胞接種：按4.5×104個/孔的密度接種細胞至24孔板中，培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中孵育過夜。

配液：根據(jù)MTT檢測結(jié)果，選取細胞活力拐點附近濃度，進行形態(tài)學觀察，確定檢測樣品的形態(tài)學觀察濃度。

給藥：待24孔板細胞鋪板率達到40%～60%時，進行給藥。樣品組加入含相應濃度樣品的細胞培養(yǎng)液，溶劑對照組加入細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中孵育培養(yǎng)24 h。

形態(tài)觀察：孵育結(jié)束后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照(20×)。

1.3.2.3 UVB輻射建模

接種：按2.5×105個/孔的接種密度接種細胞至6孔板，培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中孵育過夜。

實驗分組：實驗設置空白對照組(BC)、陰性對照組(NC)、陽性對照組[PC，0.01%(質(zhì)量分數(shù))的地塞米松]與樣品組。按照MTT及細胞形態(tài)學測試結(jié)果，使用樣品S1～S5凍干粉配制受試物工作液，S1～S3樣品質(zhì)量濃度為0.0313 mg/mL，S4及S5樣品質(zhì)量濃度為0.156 3 mg/mL。

給藥：待6孔板中細胞鋪板率達到30%～40%時，進行分組給藥，每孔給藥量為2 mL，每組設3個復孔。BC組及NC組加入培養(yǎng)液，PC組加入0.01%的地塞米松，樣品組加入相應的受試工作液。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

UVB輻照：給藥24 h后，棄掉培養(yǎng)液，并在每孔加入1 mL PBS溶液，清洗細胞，重復清洗3次。按測試分組對樣品組、NC組和PC組分別進行UVB輻照(輻照劑量為300 mJ/cm2)。

后孵育及收集上清液：UVB輻照結(jié)束后，每孔加入1 mL PBS溶液清洗，重復3次，清洗結(jié)束后，每孔加入2 mL細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液于EP管中，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，待用。

1.3.3 炎癥因子檢測

根據(jù)人IL-1α、PGE2 ELISA試劑盒的操作說明書進行ELISA檢測。

1.4 分析方法

細胞毒性檢測、IL-1α含量檢測及PGE2含量檢測結(jié)果采用GraphPad Prism Program軟件作圖，樣品組與陰性對照組比較，采用t-test統(tǒng)計分析，樣品組間采用單因素ANOVA分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞毒性實驗結(jié)果

以S1、S2、S3、S4、S5所選8個濃度為橫坐標，細胞相對活力值為縱坐標，繪制細胞相對活力曲線(圖1)?；贛TT測試結(jié)果，選擇5個濃度進行形態(tài)學檢測。

a-S1～S3；b-S4～S5圖1 S1～S5不同濃度細胞相對活力曲線Fig.1 Cell relative viability curve at different concentration of S1-S5

根據(jù)MTT和細胞形態(tài)學結(jié)果，認為S1、S2、S3在0.031 3 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)對角質(zhì)形成細胞未表現(xiàn)出細胞毒性；S4、S5在0.156 3 mg/mL的質(zhì)量濃度內(nèi)無細胞毒性(圖2)。

2.2 IL-1α檢測結(jié)果

依據(jù)ELISA試劑盒說明書，使用樣品S1、S2、S3(0.031 3 mg/mL)及S4、S5(0.156 3 mg/mL)開展IL-1α含量的檢測，檢測結(jié)果表明，與空白對照組(BC)相比，NC組的IL-1α含量極顯著升高(P<0.01)，說明本次實驗UVB刺激條件有效。與NC組相比，PC組IL-1α分泌水平極顯著降低(P<0.01)，表明本次陽性對照檢測有效(表2、圖3)。

與NC組相比，樣品S1、S3在0.031 3 mg/mL、S5在0.156 3 mg/mL時有顯著的抑制作用(P<0.05)，并且S3、S5在其相應濃度對IL-1α分泌的抑制作用強于S1，但沒有顯著差異(表2、圖3)。

a-S1；b-S2；c-S3；d-S4；e-S5圖2 S1～S5不同濃度細胞形態(tài)觀察結(jié)果Fig.2 Cell morphology observation results at different concentration of S1-S5

表2 IL-1α含量檢測結(jié)果Table 2 Results of IL-1α content test

圖3 S1～S5對IL-1α分泌含量的影響Fig.3 Effects of S1-S5 on IL-1α secretion注：用t-test方法進行統(tǒng)計分析時，#表示與BC對比，P<0.05；##表示與BC對比，P<0.01；*表示與NC對比，P<0.05；**表示與NC對比，P<0.01；樣品S1～S5間采用單因素ANOVA分析，◆◆表示P<0.01(下同)

2.3 PGE2檢測結(jié)果

依據(jù)ELISA試劑盒說明書，使用樣品S1、S2、S3(0.031 3 mg/mL)及S4、S5(0.156 3 mg/mL)開展PGE2含量的檢測，檢測結(jié)果表明：與空白對照組(BC)相比，NC組的PGE2分泌水平極顯著升高(P<0.01)，說明本次實驗UVB刺激條件有效。與NC組相比，PC組PGE2分泌水平極顯著降低(P<0.01)，表明本次陽性對照檢測有效(表3、圖4)。

表3 PGE2檢測結(jié)果Table 3 Results of PGE2 content test

圖4 S1～S5對PGE2分泌含量的影響Fig.4 Effects of S1-S5 on PGE2 secretion

與NC組相比，樣品S1在0.031 3 mg/mL時對UVB輻照引起PGE2的分泌沒有抑制作用，樣品S3在0.031 3 mg/mL、S4在0.156 3 mg/mL時對UVB輻照引起PGE2的分泌有顯著抑制作用(P<0.05)，且相比于S1，S3在相應濃度對PGE2分泌的抑制作用顯著增強(P<0.01)(表3、圖4)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過液體深層發(fā)酵技術對靈芝進行培養(yǎng)，通過添加玉竹、樺樹茸、人參及三七藥材粉末，發(fā)酵制備靈芝、靈芝-玉竹、靈芝-樺樹茸、靈芝-人參以及靈芝-三七發(fā)酵液凍干粉，利用UVB照射HaCaT細胞產(chǎn)生光損傷模擬皮膚表皮組織中角質(zhì)形成細胞的光損傷，建立UVB誘導的HaCaT細胞光損傷模型。通過檢測樣品對HaCaT細胞炎癥因子IL-1α及PGE2分泌的抑制作用發(fā)現(xiàn)，靈芝-樺樹茸發(fā)酵液凍干粉在其相應濃度對IL-1α及PGE2的分泌有顯著抑制作用(P<0.01)，且相較于靈芝發(fā)酵液凍干粉，靈芝-樺樹茸發(fā)酵液凍干粉在相應濃度對PGE2分泌的抑制作用顯著增強(P<0.01)。因此添加了樺樹茸的靈芝發(fā)酵組合具有較強的修復HaCaT細胞UVB光損傷的能力，是最優(yōu)的發(fā)酵組合方式。

綜上所述，通過本研究篩選出了抗UVB損傷能力最強的靈芝發(fā)酵組合方式——靈芝-樺樹茸發(fā)酵，這為后續(xù)靈芝-樺樹茸發(fā)酵的進一步研究奠定了基礎，也為研究抗UVB光損傷的原料提供了新的思路，為靈芝組合發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供了前提和基礎。