豆豉中產(chǎn)蛋白酶菌株的酶學(xué)性質(zhì)及風(fēng)味酶基因挖掘

周婉婷，侯宏偉，賀瑞琦，吳佳輝，郭麗丹，賈爽，張曉妍，汪立平,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海海洋大學(xué),食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

豆豉是一種起源于我國幾千年前的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，豆豉豉香濃郁，口感軟硬適中，生產(chǎn)工藝分為前發(fā)酵和后發(fā)酵兩個(gè)過程[1]，豆豉類型主要分為4種：毛霉型、曲霉型、根霉型和細(xì)菌型[2]。利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶分解豆類谷物中的蛋白，再經(jīng)過酵母菌、乳酸菌等后期發(fā)酵，使豆豉具有豐富的營養(yǎng)和特殊的香味，從而使這種產(chǎn)品可作為高營養(yǎng)直接食用的食品[3-5]。目前，要實(shí)現(xiàn)中國的豆豉工業(yè)化生產(chǎn)仍存在許多問題，例如發(fā)酵豆豉的方式仍以自然發(fā)酵為主，由于微生物種類繁多可變導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，自然發(fā)酵豆豉中微生物發(fā)酵能力差異大、蛋白酶活性低。為解決此類問題，使豆豉進(jìn)入規(guī)范化生產(chǎn)，提高質(zhì)量，純種發(fā)酵成為提升豆豉行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的熱點(diǎn)。李小永等[6]從臨沂細(xì)菌型豆豉中篩選出一株適于豆豉生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌種, 成品豆豉的理化指標(biāo)和感官評(píng)定表明該菌種發(fā)酵的豆豉風(fēng)味好且滋味鮮美；彭昀等[7]從慶陽豆豉中篩選主要作用微生物，獲得優(yōu)勢發(fā)酵菌株，其蛋白酶和纖維素酶活性最高，分別達(dá)到了25.37 U/mL和6.015 U/mL；葉慧蘭等[8]從廣東陽江豆豉的曲醅中篩選出兩株前發(fā)酵優(yōu)勢菌，以氨基態(tài)氮、還原糖、總酸含量與風(fēng)味評(píng)定為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)以米曲霉與米根霉混合制曲，在36 ℃條件下發(fā)酵56 h，生產(chǎn)出的豆豉品質(zhì)最好。目前工業(yè)上豆豉純種發(fā)酵主要集中在霉菌發(fā)酵劑[9-11]，有關(guān)工業(yè)細(xì)菌發(fā)酵劑未見詳細(xì)報(bào)道，篩選蛋白酶活性高的細(xì)菌發(fā)酵劑是提高工業(yè)化豆豉發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)之一。

風(fēng)味酶也是改良調(diào)味品質(zhì)量的途徑之一，能夠增加鮮味以及脫去苦味。風(fēng)味酶包含了內(nèi)切蛋白酶與外切肽酶兩種，可以用來去除低水解度產(chǎn)物的苦肽鏈，使產(chǎn)品鮮香味濃。如諾維信公司的風(fēng)味酶被廣泛應(yīng)用于食品添加劑行業(yè)。風(fēng)味酶的主要來源之一是各種發(fā)酵調(diào)味品的微生物菌株，通過基因重組技術(shù)對(duì)編碼風(fēng)味酶的基因進(jìn)行高效表達(dá)，可以大量生產(chǎn)工業(yè)級(jí)別的風(fēng)味酶、蛋白酶，從而用于提高調(diào)味品的質(zhì)量。因此，含有編碼風(fēng)味酶基因的菌株將會(huì)拓寬優(yōu)良發(fā)酵劑的研究、應(yīng)用范圍，也是篩選優(yōu)良發(fā)酵劑關(guān)注的重點(diǎn)。

本課題組擬從風(fēng)味良好的傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中篩選出豆豉發(fā)酵劑，并通過全基因組測序及生物信息學(xué)分析驗(yàn)證其中存在的與風(fēng)味相關(guān)的功能基因，為后續(xù)采用純種發(fā)酵技術(shù)制備高品質(zhì)豆豉，以及風(fēng)味酶的克隆表達(dá)應(yīng)用提供理論支持。試驗(yàn)首先主要以細(xì)菌型的各地豆豉為原料，以透明圈大小以及蛋白酶活力為判定指標(biāo)，最終確定出高蛋白酶活性菌株，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定以及酶學(xué)性質(zhì)研究。在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測序分析其風(fēng)味酶基因及其編碼蛋白酶，進(jìn)一步在基因水平上揭示風(fēng)味產(chǎn)生的可能原因，旨在篩選出適宜豆豉工業(yè)化生產(chǎn)的潛力優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售風(fēng)味豆豉以及家庭自制豆豉采自肇慶、臨沂、遵義、賀州、六安、南昌、蘇州、武漢、北海、長壽、瀘州、漢中、永川、潼川、太和、眉山16個(gè)地區(qū)，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。細(xì)菌DNA提取試劑盒、通用引物27F、1492R、DNA Maker、Taq MasterMix、ddH2O，生工生物工程(上海)股份有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：干酪素10，牛肉膏3，磷酸氫二鈉2，氯化鈉5，瓊脂18，加熱溶解，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酪素發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：干酪素5，葡萄糖1，酵母粉1，K2HPO44，KH2PO40.5，MgSO40.1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；A300型梯度PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；7200型可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；GHP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.4 高蛋白酶活菌株的篩選

1.4.1 初篩

將豆豉樣品分別稱取25 g，碾碎后加入裝有225 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩，得到10倍稀釋的菌懸液，再依次用無菌生理鹽水稀釋得到10-2～10-6不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，選取10-2、10-4、10-63個(gè)梯度，進(jìn)行3次平行重復(fù)涂布，待平板完全干透，將酪蛋白平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h[12]。

1.4.2 復(fù)篩

從初篩所獲得的細(xì)菌菌株甘油管中吸取100 μL的菌液接入10 mL的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床，150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好的菌液按照2%的接種量接種到已滅菌的酪素發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，在離心機(jī)轉(zhuǎn)速10 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑 蛋白酶活力的測定 福林法》測定該菌株蛋白酶活力[13]。

1.5 菌株形態(tài)觀察及鑒定

對(duì)高蛋白酶活力菌株進(jìn)行分離，挑取單菌落制作顯微鏡涂片。經(jīng)革蘭氏染色后，利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特征[14-15]。對(duì)已確定的高蛋白酶活力菌株進(jìn)行基因組DNA抽提。PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系25 μL，包括正向和反向引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物需要經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的檢測，獲取成功擴(kuò)增片段再送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。用所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中做相似性比對(duì)分析，進(jìn)一步于軟件MEGA中構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 生長曲線及產(chǎn)酶曲線的測定

將已活化菌液按照2%的接種量接入已滅菌的酪素發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，在37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)期間每隔4 h取樣，測定其600 nm的吸光度(OD600)值，同時(shí)將菌液離心取上清液，測定蛋白酶活力。

1.7 蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 蛋白酶最適溫度測定

根據(jù)生長曲線和產(chǎn)酶曲線的繪制，菌株培養(yǎng)適宜發(fā)酵時(shí)間，設(shè)定不同溫度條件與1%酪蛋白底物反應(yīng)，試驗(yàn)設(shè)置20、30、40、50、60、70、80 ℃溫度梯度，分別測定酶活力，確定反應(yīng)最適溫度。最高酶活力定義為100%[16]。

1.7.2 蛋白酶最適pH測定

在最適發(fā)酵時(shí)間和溫度下，設(shè)定不同pH條件與1%酪蛋白底物反應(yīng)，試驗(yàn)設(shè)置4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 pH梯度，分別測定酶活力，確定反應(yīng)最適pH。最高酶活力定義為100%[16]。

1.7.3 金屬離子、表面活性劑和金屬離子螯合劑對(duì)酶活力的影響

在最適時(shí)間、溫度和pH值條件下，將Mn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+金屬離子及EDTA和Triton X-100按照2 μmol/mL的濃度分別加入反應(yīng)體系中，分別測定酶活力，檢測金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)蛋白酶活性的影響。未添加金屬離子、EDTA及Triton X-100的酶活力定義為100%[16]。

1.8 高蛋白酶活力菌株B3的全基因組測序

全基因組測序流程如下：首先收集純化的DNA基因組，利用Covaris破碎機(jī)對(duì)純化的DNA基因組進(jìn)行破碎片段化，以便構(gòu)建基因組文庫。然后A、B接頭連接DNA片段，去除接頭自連片段，后經(jīng)過氫氧化鈉變性處理，產(chǎn)生單鏈DNA片段。將篩選的DNA片段的兩端固定在芯片上，兩端與引物互補(bǔ)，后經(jīng)過PCR擴(kuò)增過程。DNA單鏈在每次循環(huán)過程中加入帶有熒光的4種dNTP之一，經(jīng)過激光掃描識(shí)別以及切割基團(tuán)后，恢復(fù)黏性末端，繼續(xù)聚合，依據(jù)每次得到的熒光信號(hào)結(jié)果，即可得到模板DNA片段的序列。文庫檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行Illumina Hiseq×10平臺(tái)測序，測序結(jié)果經(jīng)過GC_depth分布分析和K-mer頻率分布分析的基因組評(píng)估后，對(duì)二代測序后的優(yōu)化序列采用組裝軟件SOAPdenovo2進(jìn)行拼接，組裝結(jié)果進(jìn)一步的局部優(yōu)化后，形成scaffolds開放閱讀框。

生信分析過程如下：采用相應(yīng)軟件NR、Swissprot、KEGG、COG、GO、Ex PASy數(shù)據(jù)庫以及PredictProtein(https://www.predictProtein.org/)網(wǎng)站、Clustal Omega、Jalview在線分析工具等分析預(yù)測風(fēng)味酶基因及其編碼蛋白酶的氨基酸序列組成、理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行多序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 菌株初篩結(jié)果

對(duì)平板涂布得到的特征菌落進(jìn)行多次劃線分離純化，共獲得51株細(xì)菌菌株，對(duì)其進(jìn)行透明圈與菌落直徑大小的比值比較，篩選出10株透明圈與菌落直徑比值>3.0的菌株(表1)，并進(jìn)行下一步復(fù)篩。

2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

經(jīng)過48 h的發(fā)酵培養(yǎng)之后，對(duì)上述10株初篩菌株進(jìn)行蛋白酶活力的測定，結(jié)果如圖1所示。菌株在前發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量不同的蛋白酶酶系，快速分解底物中的蛋白質(zhì)。張芹等[17]以貴州三穗水豆豉為原料，分離出5株優(yōu)勢菌株，其中菌株F復(fù)篩蛋白酶活力達(dá)到60 U/mL左右。該研究以初篩菌株為基礎(chǔ)，進(jìn)行蛋白酶活力復(fù)篩。結(jié)果由圖1可知，B3菌株在所有初篩菌株中蛋白酶活力最高，達(dá)到185.6 U/mL，因此選擇該菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 初篩菌株蛋白酶活力對(duì)比Fig.1 Comparison of protease activity of primary strains

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株菌落形態(tài)

復(fù)篩優(yōu)勢菌株B3的菌落形態(tài)如圖2-a所示，平板上生長的菌落呈不規(guī)則狀，顏色呈乳白色，表面呈凸面，邊緣也呈現(xiàn)不規(guī)則狀，水解透明圈明顯，經(jīng)過革蘭氏染色后鑒定為革蘭氏陽性菌，如圖2-b所示，菌株呈短桿狀，成簇或成鏈排列。

a-單菌落形態(tài)圖；b-革蘭氏染色圖圖2 B3菌株形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain B3

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)B3菌株進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，PCR后系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。B3菌株通過凝膠電泳后在電泳圖中出現(xiàn)明顯的DNA分子條帶，條帶處于1 500 bp左右，屬于大部分細(xì)菌分子質(zhì)量的范圍。利用NCBI網(wǎng)站的Blast功能對(duì)送測后獲得的菌株序列進(jìn)行序列比對(duì)，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹了解該菌株的種屬關(guān)系。建樹結(jié)果表明該高產(chǎn)蛋白酶活力菌株與Bacillusamyloliquefaciensstrain NBRC 15535的相似度高達(dá)92%。最終，B3菌株確定為芽孢桿菌屬(Genbank 序列號(hào) MZ723401.1)解淀粉芽孢桿菌種。

2.3 生長曲線與產(chǎn)酶曲線的繪制

由圖4可知，酶活力與生長曲線的變化趨勢相似，從0～8 h增長緩慢，從12～36 h逐漸增長，之后酶活趨于平穩(wěn)，在48 h達(dá)到最大值。從培養(yǎng)過程來看，B3菌株在36 h后菌體濃度已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，由于一些產(chǎn)物積累反饋，蛋白酶活也呈現(xiàn)不再增長的狀態(tài)，所以在48 h的時(shí)候，是發(fā)酵的最佳時(shí)期。

圖4 B3菌株生長曲線及產(chǎn)酶曲線Fig.4 Growth curve and enzyme production curve of strain B3

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度

不同溫度對(duì)蛋白酶的影響結(jié)果如圖5所示，20～50 ℃時(shí)，酶活力隨溫度的升高逐步上升，溫度高于50 ℃后，酶活力迅速降低，50 ℃時(shí)達(dá)到最高酶活力。高溫下，酶活力迅速降低，極可能是破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而低溫下也有20%以上的酶活力存在，表明該菌株具有耐低溫的潛在特性。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)B3蛋白酶活力的影響Fig.5 The effect of reaction temperature on the activity of B3 protease

2.4.2 最適pH

探究不同pH值對(duì)蛋白酶的影響，如圖6所示，pH值在4.0～7.0時(shí)，酶活力隨pH值的升高迅速上升，pH值在7.0～10.0，酶活力逐步降低，在7.0時(shí)達(dá)到最高酶活力。說明酶最適反應(yīng)pH為7.0，而pH 7.0以上蛋白酶仍表現(xiàn)出61%以上活力。

圖6 pH對(duì)B3蛋白酶活力的影響Fig.6 The effect of pH on the activity of B3 protease

2.4.3 金屬離子、表面活性劑和金屬離子螯合劑對(duì)蛋白酶活性的影響

不同金屬離子、EDTA、Triton X-100對(duì)蛋白酶的影響結(jié)果如圖7所示，各種金屬離子對(duì)酶活力的影響存在差異，僅有Mn2+對(duì)酶活力有極其明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)，相對(duì)酶活力可達(dá)116%，而Fe2+和EDTA對(duì)酶活力有極其明顯的抑制作用(P<0.01)，相對(duì)酶活力分別低至17%和23%。其余的Ca2+、Cu2+、Zn2+及Triton X-100對(duì)酶活力也具有抑制作用(P<0.05)。說明蛋白酶活力性受Fe2+和EDTA的影響最大，容易失去活性，其余因素影響下，蛋白酶活力也仍然在60%以上。

2.5 高蛋白酶活力菌株B3全基因組測序結(jié)果

通過高通量測序平臺(tái)對(duì)B3基因組的測序發(fā)現(xiàn)，該優(yōu)勢菌株基因組全長為3 578 880 bp，獲得注釋基因3 851個(gè)，占基因組全長的89.44%，GC含量為46.16%。通過蛋白編碼基因數(shù)據(jù)庫GO、KEGG以及COG注釋發(fā)現(xiàn)，該菌株參與碳水化合物運(yùn)輸和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、膜運(yùn)輸以及能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化的基因數(shù)目較多，這就能夠解釋該菌株高產(chǎn)蛋白酶能力的原因。

圖7 金屬離子、表面活性劑、和金屬離子螯合劑對(duì)B3蛋白酶酶活力的影響Fig.7 The effects of metal ions, surfactants, and metal ion chelating agents on the enzyme activity of B3 protease

2.5.1 COG功能注釋

解淀粉芽孢桿菌B3基因組中有3 120個(gè)基因成功獲得COG功能注釋。占比較大的有：氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)(amino acid transport and metabolism)，287個(gè)基因，占總比例的9.2%；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(carbohydrate transport and metabolism)，223個(gè)基因，占總比例的7.1%；轉(zhuǎn)錄(transcription)，244個(gè)基因，占總比例的7.8%。相應(yīng)結(jié)果見附圖1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220509.1434.004.html，下同)。

2.5.2 GO功能注釋

解淀粉芽孢桿菌B3基因組中有2 666個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋，由基因功能可分3大亞類：生物學(xué)過程(biological process)，14個(gè)分支，其中基因數(shù)量最多的是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA模板(regulation of transcription, DNA-templated)；細(xì)胞組分(cellular component)，14個(gè)分支，其中基因數(shù)量最多的是膜的組成部分(integral component of membrane)；分子功能(molecular function)，14個(gè)分支，其中基因數(shù)量最多的是結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)。相應(yīng)結(jié)果見附圖2。

2.5.3 KEGG功能注釋

對(duì)B3基因組進(jìn)行KEGG注釋，共成功獲得2 530個(gè)基因注釋。共分為6大部分代謝途徑：細(xì)胞過程 (cellular processes，155個(gè)基因)、代謝(metabolism，1 759個(gè)基因)、人類疾病(human diseases，95個(gè)基因)、基因信息處理(genetic informantion processing，189個(gè)基因)、有機(jī)體系(organismal system，44個(gè)基因)、環(huán)境信息處理(environmental informantion processing，288個(gè)基因)。其中大量的基因參與了代謝中的全局組成部分。相應(yīng)結(jié)果見附圖3。

2.6 高蛋白酶活力菌株B3風(fēng)味酶基因及其編碼蛋白酶的預(yù)測分析

堿性蛋白酶具有很強(qiáng)的水解能力，并且豆豉中的植物蛋白堿溶性較好，所以堿性蛋白酶有較高的水解效率。堿性蛋白酶多應(yīng)用于動(dòng)植物蛋白的加工，以改善蛋白食品的品質(zhì)和風(fēng)味，主要是以芽孢桿菌屬的堿性蛋白酶為主，通常是絲氨酸蛋白酶[18]。但是在豆豉發(fā)酵的過程中，蛋白質(zhì)被水解，會(huì)產(chǎn)生較多的苦味肽，從而刺激味蕾，產(chǎn)生苦味，導(dǎo)致食品口感及品質(zhì)下降。因此如何在提高豆豉風(fēng)味的同時(shí)脫去苦味，使得豆豉風(fēng)味更進(jìn)一步，這個(gè)問題顯得尤為重要[19]。

氨肽酶是一種外肽酶，這種酶催化肽和蛋白質(zhì)N端氨基酸殘基的水解。在食品工業(yè)中使用的氨肽酶也稱為風(fēng)味酶(novo nordisk)。不同來源的微生物氨肽酶結(jié)構(gòu)均不相同且酶學(xué)性質(zhì)也因底物的特異性而不同，絕大多數(shù)微生物氨肽酶的最適反應(yīng)pH一般在堿性范圍內(nèi)(pH 6.0～9.0)。氨肽酶在食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用于改善食品風(fēng)味和口感，且在蛋白水解液脫苦中發(fā)揮重要作用。在食品中添加氨肽酶可以降解具有苦味的疏水性肽，并且釋放其他具有良好風(fēng)味特征的肽和游離氨基酸[20]。因此氨肽酶經(jīng)常作為調(diào)味品的添加劑，如醬油，調(diào)味料混合物等。

促進(jìn)豆豉發(fā)酵成熟，同時(shí)增強(qiáng)鮮味和脫除苦味是發(fā)酵劑中風(fēng)味酶所起的主要作用。根據(jù)2.4.2中的菌株B3蛋白酶活力測定得知，菌株B3蛋白酶的最適pH值為7.0～9.0，并由此前研究可知，內(nèi)切蛋白酶——堿性絲氨酸蛋白酶對(duì)發(fā)酵豆豉中的蛋白質(zhì)水解有較高效率并可改善其風(fēng)味，提高鮮味；外切肽酶——氨肽酶可以降解具有苦味的疏水性肽，兩種風(fēng)味酶的最適pH也為7.0～9.0，表明它們均能適應(yīng)大部分的外界環(huán)境，維持穩(wěn)定狀態(tài)。本試驗(yàn)通過對(duì)菌株B3進(jìn)行全基因組測序，檢索到編碼堿性絲氨酸蛋白酶的AprX基因和編碼氨肽酶的ampS基因，為該發(fā)酵劑產(chǎn)生良好風(fēng)味從基因?qū)用嫣峁├碚擈?yàn)證。除此之外，利用生物信息學(xué)方法[21-22]預(yù)測分析其編碼的堿性絲氨酸蛋白酶和氨肽酶的氨基酸組成、理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)等特性，也為后續(xù)風(fēng)味酶基因的克隆、表達(dá)、菌株改良提供理論依據(jù)。

2.6.1 風(fēng)味酶基因AprX和ampS檢索及其編碼的氨基酸序列保守域預(yù)測

(1)編碼堿性絲氨酸蛋白酶的AprX基因

由全基因組測序得該基因?yàn)橐粭l全長為1 329 bp的序列，經(jīng)軟件分析，該序列是一個(gè)完整的閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼442個(gè)氨基酸。將該序列進(jìn)行Blastx檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與解淀粉芽孢桿菌組(Bacillusamyloliquefaciensgroup)中所編碼的絲氨酸蛋白酶(序列ID：WP_017417817.1)序列相似性為100%，將此氨基酸序列提交到Conserved Domains檢測保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該序列的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)楹信c胰蛋白酶不同源的Asp/His/Ser催化三聯(lián)體。

(2)編碼氨肽酶的ampS基因

由全基因組測序得到ampS基因核苷酸序列和氨基酸序列。通過NR、Swissprot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫對(duì)ampS基因進(jìn)行基因注釋，得到該基因編碼的氨肽酶2(aminopeptidase 2)。由全基因組測序得該基因?yàn)橐粭l全長為1 233 bp的序列，經(jīng)軟件分析，該序列是一個(gè)完整的閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼410個(gè)氨基酸。將該序列進(jìn)行Blastx檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與解淀粉芽孢桿菌組(Bacillusamyloliquefaciensgroup)中所編碼的氨肽酶(序列ID：WP_033574610.1)序列相似性為99.76%，將此氨基酸序列提交到Conserved Domains檢測保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該序列的保守結(jié)構(gòu)域與嗜熱金屬蛋白酶氨肽酶相似，該酶屬于肽酶M29家族的氨肽酶具有助催化金屬離子，主要是鈷，并顯示出廣泛的底物特異性。

2.6.2 風(fēng)味酶基因AprX和ampS編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測

(1)AprX基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測

該基因共有442個(gè)氨基酸，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為54，帶正電荷的殘基總數(shù)為48，氨基酸中所占比重最高的是絲氨酸(Ser)，比重為8.6%；理論分子質(zhì)量為48 176.44 u，理論等電點(diǎn)(PI)為5.98，分子式為C2116H3354N584O666S17；在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為32.45，小于閾值40，穩(wěn)定性較好。脂溶指數(shù)為80.07，且通過Ex PASy的Prot Scale預(yù)測，AprX基因編碼氨基酸序列疏水性最小值約為-3.000，最大值約為2.756，整個(gè)多肽鏈中親水性氨基酸比疏水性氨基酸數(shù)量多，因此推測該蛋白為親水性蛋白。

(2)ampS基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測

該基因共有410個(gè)氨基酸，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為62，帶正電荷的殘基總數(shù)為44，氨基酸中所占比重最高的是谷氨酸(Glu)，比重為10.3%；理論分子質(zhì)量為45 697.14 u，理論等電點(diǎn)為5.29，分子式為C2 038H3 150N548O634S7；在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為37.22，小于閾值40，穩(wěn)定性較好。脂溶指數(shù)為77.73，且通過Ex PASy的Prot Scale預(yù)測，ampS基因編碼氨基酸序列疏水性最小值約為-2.711，最大值約為1.922，整個(gè)多肽鏈中親水性氨基酸比疏水性氨基酸數(shù)量多，因此推測該蛋白為親水性蛋白。

2.6.3 風(fēng)味酶基因AprX和ampS編碼蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

(1)AprX基因編碼蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

運(yùn)用在線分析工具PredictProtein(https://www.predictProtein.org/)網(wǎng)站對(duì)解淀粉芽孢桿菌B3AprX基因編碼的絲氨酸蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，該蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋比例為25.79%，β-折疊比例為20.36%，其他結(jié)構(gòu)比例為53.85%。相應(yīng)結(jié)果見附圖4。

(2)ampS基因編碼蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

運(yùn)用在線分析工具PredictProtein(https://www.predictProtein.org/)網(wǎng)站對(duì)解淀粉芽孢桿菌B3ampS基因編碼的氨肽酶二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，該蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋比例為40.10%，β-折疊比例為23.47%，其他結(jié)構(gòu)比例為36.43%。相應(yīng)結(jié)果見附圖5。

二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊的比例越高，說明該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性越高。由上述的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，這兩種酶的穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.6.4 風(fēng)味酶基因AprX和ampS編碼蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

(1)AprX基因編碼蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

運(yùn)用Swiss Model預(yù)測解淀粉芽孢桿菌AprX基因編碼蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，選取Subtilisin-like serine protease(SMTL ID：3afg.2)作為模板，兩者序列相似度為41.58%，模型顯示，該AprX基因編碼蛋白酶含有大量α-螺旋、β折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。在同源建模中，兩者序列相似度在30%以上，其結(jié)果可信度就較大，拉馬錢德蘭圖可以很直觀的描述同源建模的合理性，幾乎所有位點(diǎn)都位于能量較低的區(qū)域，說明該蛋白結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生變化，說明該同源建模所預(yù)測的三級(jí)結(jié)構(gòu)合理性較高。相應(yīng)結(jié)果見附圖6、附圖7。

(2)ampS基因編碼蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

運(yùn)用Swiss Model預(yù)測解淀粉芽孢桿菌ampS基因編碼蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，選取Aminopeptidase PepS(SMTL ID：4icr.1.A)作為模板，兩者序列相似度為51.3%，模型顯示，該ampS基因編碼蛋白酶含有大量α-螺旋、β折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。絕大多數(shù)位點(diǎn)都分布于能量較低的區(qū)域內(nèi)，說明該三級(jí)結(jié)構(gòu)的合理性較高。相應(yīng)結(jié)果見附圖8、附圖9。

由上述預(yù)測的兩種酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，可以更好的研究這兩種酶對(duì)豆豉風(fēng)味的影響，可以預(yù)測堿性絲氨酸蛋白酶水解大豆蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，從而探究氨肽酶對(duì)大豆蛋白水解后產(chǎn)生的苦味肽的脫苦作用。

2.6.5 風(fēng)味酶基因AprX和ampS編碼蛋白酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

將AprX基因編碼絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列以及從NCBI的15個(gè)Bacillus屬、Folsomiacandida屬來源的絲氨酸蛋白酶氨基酸序列；ampS基因編碼氨肽酶的氨基酸序列以及在NCBI的15個(gè)Bacillus屬、Listeria屬、Thermococcus屬、Natrarchaeobaculum屬來源的氨肽酶氨基酸序列，輸入到MEGA軟件中，并采用臨位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，默認(rèn)數(shù)值，可以較為精確地確定其進(jìn)化地位。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示基因AprX和ampS編碼氨基酸序列都與Bacillusamyloliquefaciensgroup親緣關(guān)系較近且不同種屬來源的絲氨酸蛋白酶具有一定保守性。相應(yīng)結(jié)果見附圖10、附圖11。

2.6.6 風(fēng)味酶基因AprX和ampS編碼蛋白酶氨基酸序列的多序列比對(duì)

(1)AprX基因編碼蛋白酶氨基酸序列的多序列比對(duì)

運(yùn)用在線分析軟件Clustal Omega對(duì)6種不同源的AprX基因編碼蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，并在Jalview中進(jìn)行可視化處理，6種AprX基因編碼蛋白酶氨基酸序列中芽孢桿菌種間的AprX基因編碼蛋白酶氨基酸序列差異很小，保守域大致相同，氨基酸序列為SGTSMATPICAGIAALIL。本研究得到的解淀粉芽孢桿菌B3的AprX基因編碼蛋白酶氨基酸序列與Bacillusamyloliquefaciensgroup相似性最高。相應(yīng)結(jié)果見附圖12。

(2)ampS基因編碼蛋白酶氨基酸序列的多序列比對(duì)

運(yùn)用相同方法對(duì)6種不同源的ampS基因編碼蛋白酶氨基酸序列多重序列比對(duì), 6種ampS基因編碼蛋白酶氨基酸序列中芽孢桿菌種間的ampS基因編碼蛋白酶氨基酸序列差異很小，保守域大致相同，氨基酸序列為EVFTLP。得到的解淀粉芽孢桿菌B3的ampS基因編碼蛋白酶氨基酸序列與Bacillusamyloliquefaciensgroup相似性最高。相應(yīng)結(jié)果見附圖13。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從各地豆豉樣品中分離純化得到51株細(xì)菌，后通過蛋白酶活力確定了1株B3菌株，并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究和風(fēng)味酶基因檢索以及其編碼的堿性絲氨酸蛋白酶和氨肽酶基酸序列組成、理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)等生信分析。結(jié)果表明，B3菌株最高蛋白酶活力可達(dá)185.6 U/mL，粗酶液在50 ℃、pH 7.0條件下能夠保持最高蛋白酶活性，Mn2+對(duì)酶活力有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)。通過形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，B3屬于解淀粉芽孢桿菌種，同時(shí)利用全基因組學(xué)測序與生物信息學(xué)分析表明，解淀粉芽孢桿菌B3中含有風(fēng)味酶基因AprX和ampS，其中AprX基因全長為1 329 bp，共編碼442個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為48 176.44 u，理論等電點(diǎn)為5.98，ampS基因全長為1 233 bp，共編碼410個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為45 697.14 u，理論等電點(diǎn)為5.29。兩者均編碼位于細(xì)胞質(zhì)中的親水性蛋白，基因編碼氨基酸序列都與Bacillusamyloliquefaciensgroup相似性最高。以上結(jié)果表明B3菌株蛋白酶活力高、酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、含有與風(fēng)味酶密切相關(guān)的兩種功能基因AprX和ampS，是一株具有發(fā)酵潛力的豆豉發(fā)酵劑，也是表達(dá)風(fēng)味酶的基因供體。