刺梨多糖、刺梨黃酮對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的緩解作用

袁夢(mèng)，譚書明,2*，任廷遠(yuǎn),2，徐青，譚蕓蕓，陳珍，陶蕓，浦賢

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)2(貴州省刺梨研究院，貴州 貴陽(yáng)，550025)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種癥狀為體重下降、血便和腹瀉，出現(xiàn)腸黏膜受損、結(jié)腸組織潰爛、炎癥嚴(yán)重的腸道疾病[1-2]。其發(fā)病機(jī)制由多種因素共同引起，涉及不健康飲食習(xí)慣、遺傳因素、上皮屏障受損、免疫反應(yīng)失調(diào)、腸道微生物失調(diào)等[3]。特別是UC早期引起炎癥細(xì)胞因子過度表達(dá)，而促炎因子可通過NF-κB上調(diào)，加重結(jié)腸組織受損。通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活以減少炎癥因子的釋放是緩解UC的一種有效方法[4]。UC具有反復(fù)發(fā)作、難治愈、病程漫長(zhǎng)的特點(diǎn)，對(duì)患者的正常生活有很大影響[5]。UC患者的常規(guī)藥物主要有抗生素、免疫抑制藥物，以及生物制品等[6]。其藥物短期療效好，但價(jià)格昂貴且長(zhǎng)期使用副作用大、復(fù)發(fā)率高。因此，選用膳食中的天然活性成分對(duì)防治結(jié)腸炎具有重要意義。

刺梨(RoseroxburghiiTratt)一種廣泛分布于西南地區(qū)的薔薇科野生植物，刺梨具有優(yōu)良的食療效果，已被用于降血糖[7]、降血脂[8]、解酒護(hù)肝[9-10]、抗氧化[11]和緩解便秘[12]等方面。刺梨中含有豐富的多糖和黃酮成分[13-15]。研究表明，多糖、黃酮具有抗氧化、抗炎等功能。張潘等[16]研究刺梨多糖能降低非酒精性脂肪肝誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥因子和氧化應(yīng)激水平，改善脂質(zhì)代謝紊亂狀況；詹繼紅等[17]研究刺梨黃酮能增加丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量并降低超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量，保護(hù)受損腎小管上皮細(xì)胞。目前，針對(duì)刺梨總多糖(RosaroxburghiiTratt total polysaccharide, RP)和總黃酮(RosaroxburghiiTratt total flavonoids, RF)對(duì)結(jié)腸炎小鼠的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)采用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)溶液構(gòu)建UC小鼠模型，研究刺梨多糖和黃酮對(duì)DSS誘導(dǎo)UC小鼠的緩解效果及其相關(guān)機(jī)理，為進(jìn)一步篩選有效緩解結(jié)腸炎的飲食干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)，及為開發(fā)相關(guān)刺梨功能性食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨多糖，刺梨黃酮由本實(shí)驗(yàn)室自制[18]，其中多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.074 3x+0.071 6(R2=0.991 1),經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算刺梨中多糖相對(duì)含量為71%，黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=17.56x-0.036 7(R2=0.999 2)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得刺梨中黃酮相對(duì)含量為51%。

葡聚糖硫酸鈉，MP biomedical公司；糞便隱血試劑盒，北京雷根生物有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、SOD、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、MDA、BCA試劑盒，泉州市睿信生物科技有限公司；RNA分離試劑盒，F(xiàn)oregene；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EvaGreen Express 2×qPCR、MasterMix-NoDye，abm；BCA蛋白濃度試劑盒，biosharp；MyD88、NF-κB p50、IκBα、NF-κB p65抗體，四川賽因斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003C型電子天平，上海越平科學(xué)儀器(蘇州)制造有限公司；H1-16KR型離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；Pannormic SCAN Ⅱ型病理切片掃描儀，3DHISTECH Kft；酶標(biāo)儀、HM325切片機(jī)，賽默飛；超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司；IKA 研磨儀，德國(guó)Janke&Kunkel公司；恒流泵，蘇州辰傲電子科技有限公；UV9000S紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；熒光定量PCR儀，ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J雄性小鼠，8周齡，體重(22±2) g，SPF 級(jí)，購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證 SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)在溫度 22～24 ℃，濕度 60%～80%,12 h/12 h明暗交替的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：EAE-GZU-2020-P003)，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠模型建立

將40只8周齡C57BL/6J雄鼠小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成4組(n=10)，即空白組、模型組、RP組(200 mg/kg BW)、RF組(200 mg/kg BW)[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。除空白組自由飲用水外，其余各組飲用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DSS溶液建立UC小鼠(7 d)，于建模后第4天，進(jìn)行給藥干預(yù)，其中空白組和模型組按照小鼠體重灌胃生理鹽水，連續(xù)干預(yù)10 d[1]。飼養(yǎng)期間每天觀察小鼠糞便情況，記錄疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分，定時(shí)稱重，并根據(jù)體重(10 mL/kg)調(diào)整灌胃劑量。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，各組小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血后脫頸處死，迅速取出小鼠結(jié)腸，量取結(jié)腸長(zhǎng)度。隨后將其分成3段，2段置于離心管放在-80 ℃冰箱保存，1段結(jié)腸組織浸泡于4%中性甲醛溶液。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig.1 Design of animal experiment

1.4.2 小鼠體重變化、結(jié)腸長(zhǎng)度及DAI評(píng)分

實(shí)驗(yàn)期間，每日灌胃前稱量小鼠體重，小鼠處死后，測(cè)量各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度。小鼠體重變化如公式(1)所示。每日收集小鼠糞便，采用糞便隱血試劑盒測(cè)定糞便隱血評(píng)分，根據(jù)表1計(jì)算DAI。

(1)

表1 DAI評(píng)分Table 1 DAI score

1.4.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

取固定于4%中性甲醛溶液中的結(jié)腸組織，經(jīng)脫水、包埋、切片、染色、封片制作切片，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，分析結(jié)腸的病理?yè)p傷。

1.4.4 血清指標(biāo)測(cè)定

解剖后的小鼠血液在室溫下放置30 min，以3 500 r/min，離心10 min，取上清液按照試劑盒方法測(cè)定血清內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS)和D-乳酸(D-lactic acid,D-lac)的含量。

1.4.5 結(jié)腸組織炎癥因子的測(cè)定

稱取適量結(jié)腸樣本，向其中加入預(yù)冷PBS，勻漿離心獲得結(jié)腸上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的含量變化。

1.4.6 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平的測(cè)定

稱取適量結(jié)腸樣本，向其中加入預(yù)冷PBS，勻漿離心獲得結(jié)腸上清液，按照生化試劑盒說明書檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中MDA、SOD、MPO活力。

1.4.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)緊密連接蛋白的表達(dá)

將結(jié)腸組織進(jìn)行切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，切片放入3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min，置于PBS中脫色搖床洗滌3次；血清封閉，加一抗4 ℃孵育過夜；復(fù)溫10 min，置于PBS中脫色搖床洗滌3次，加二抗37 ℃孵育30 min；3,3-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride,DAB)顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.4.8 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)

按照試劑盒說明書提取小鼠結(jié)腸組織的總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度。按照試劑盒方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物如表2所示，以GAPDH作為對(duì)照，進(jìn)行相對(duì)定量。引物序列由四川賽因斯特生物科技有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)。

表2 熒光PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for fluorescence qPCR

1.4.9 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

將結(jié)腸組織切成小塊，加入適量磷酸化蛋白酶抑制劑勻漿，離心后收集上清液，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。將等量蛋白于適宜濃度的凝膠上電泳分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。加入5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉1 h，稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌。二抗用TBST稀釋，將膜和二抗一起室溫孵育30 min后，用TBST將其在搖床上洗滌3次。將膜和化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)溶液充分接觸，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下采集圖像。以β-actin作為對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 RP、RF對(duì)UC小鼠體重及體重變化率的影響

體重減輕、精神不濟(jì)、血便是UC小鼠建模成功的典型性狀之一。如圖2所示，空白組小鼠體重基本保持不變。模型組小鼠自由飲用3%DSS溶液7 d，從第4天開始，體重發(fā)生明顯減輕，逐漸有血便。第14天，與空白組相比，模型組小鼠的體重顯著降低(30.13%)(P<0.01)。在實(shí)驗(yàn)期間，模型組小鼠死亡3只，原因可能是小鼠個(gè)體差異，過多飲用DSS水溶液，小鼠結(jié)腸損傷過重，體重顯著下降，拉血便等導(dǎo)致死亡。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組、RF組小鼠體重均分別顯著增加25.11% 和20.48%(P<0.01)。結(jié)果表明，RP、RF均能夠抑制UC小鼠的體重下降，效果為RP>RF。

A-小鼠體重變化；B-小鼠體重變化率圖2 RP、RF對(duì)小鼠體重及體重變化率的影響Fig.2 Effects of RP and RF on body weight and body weight change rate of mice

2.2 RP、RF對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響

DAI升高是判斷UC小鼠患病嚴(yán)重程度的一個(gè)重要指標(biāo)之一。如圖3所示，空白組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，DAI為0。第14天，與模型組相比，經(jīng)RP和RF干預(yù)后的UC小鼠DAI下降，RP組和RF組小鼠DAI評(píng)分顯著降低(51.9% 和41.67%)(P<0.01)。結(jié)果表明，RP和RF均能降低UC小鼠的DAI，效果為RP>RF。

圖3 RP、RF對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響Fig.3 Effects of RP and RF on DAI score of UC mice

2.3 RP、RF對(duì)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及病理學(xué)的影響

UC小鼠會(huì)發(fā)生結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，腸壁充血，大便黏稠不成形出血甚至稀便的情況[1]。如圖4-A所示，正常小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度約為 5.93 cm，腸壁光滑均勻，大便正常。與空白組相比，模型組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度為4.50 cm，顯著減少24.1%(P<0.01)，腸壁明顯萎縮。經(jīng)RP、RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組結(jié)腸長(zhǎng)度上升22.22%,RP組結(jié)腸長(zhǎng)度上升9.56%(P<0.01)。結(jié)果表明，RP和RF均能改善UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度減少的現(xiàn)象，效果為RP>RF。

為評(píng)價(jià)RP和RF對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色。如圖4-C所示，空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層腸腺豐富，排列規(guī)則均勻；黏膜下層結(jié)構(gòu)緊密，未出現(xiàn)病理?yè)p傷。模型組小鼠結(jié)腸黏膜層大面積壞死，出現(xiàn)大量的炎癥，損傷嚴(yán)重。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，RP組結(jié)腸局部可見小灶性壞死，少量上皮細(xì)胞壞死以及腸腺壞死消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。RF組效果不明顯，結(jié)腸黏膜層仍大面積壞死，腸上皮脫落，腸腺壞死消失，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與RF組相比，RP組能明顯減少DSS引起的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)腸的程度，改善黏膜層壞死的結(jié)果，效果為RP>RF。

A～B-小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度；C～F-小鼠結(jié)腸HE染色(依次為空白組、模型組、RP組、RE組) 圖4 RP、RF對(duì)UC小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸HE染色的影響Fig.4 Effects of RP and RF on colonic length and colonic HE staining in UC mice注：與空白組相比，*P<0.05，** P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##(P<0.01)(下同)

2.4 RP、RF對(duì)UC小鼠腸黏膜屏障損傷的影響

腸黏膜是影響UC的一個(gè)關(guān)鍵因素，腸黏膜屏障受損時(shí)，細(xì)菌及其代謝物侵入腸道和血液，LPS和D-lac水平上升[19]。如圖5所示，與空白組相比，模型組LPS和D-lac分別極顯著升高64%、43.48%(P<0.01)，表明UC小鼠腸黏膜屏障受損。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組和RF組的LPS含量分別下降24.24%、13.88%(P<0.01)；RP組和RF組的D-lac含量分別下降36.36%、21.23%(P<0.01)。效果為RP>RF。

2.5 RP、RF對(duì)UC小鼠炎癥因子的影響

促炎因子與抗炎因子之間的失衡是UC發(fā)病的重要原因。巨噬細(xì)胞過量釋放TNF-α 引發(fā)UC，隨后IL-1β、IL-6濃度升高及IL-10濃度降低[20]。如圖6所示，與空白組相比，模型組中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平極顯著升高(P<0.01)，含量分別升高77.21%、66.06%、59.93%，抑炎因子IL-10分泌水平極顯著降低51.10%(P<0.01)。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組和RF組的TNF-α含量分別極顯著下降38.86%、30.61%(P<0.01)；RP組和RF組的 IL-1β 含量分別極顯著下降46.54%、16.58%(P<0.01)；RP組和RF組的IL-6 含量分別下降28.66%(P<0.01)、9.00%,但是RF未能顯著下降UC小鼠的IL-6含量，與模型組相比無顯著差異。RP組和RF組的 IL-10含量分別極顯著升高35.69%、21.88 %(P<0.01)。結(jié)果表明，RP組和RF組均能降低促炎因子 TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平，提高抗炎因子IL-10分泌水平，說明RP和RF均降低UC小鼠的炎癥反應(yīng)，保護(hù)結(jié)腸組織。促炎因子和抗炎因子的效果都是RP>RF。

2.6 RP、RF對(duì)UC小鼠氧化應(yīng)激的影響

通過檢測(cè)抗氧化指標(biāo)(MPO和SOD)和脂質(zhì)過氧化物標(biāo)志物(MDA)來評(píng)估樣品對(duì)UC小鼠氧化應(yīng)激的影響[21]。如圖7所示，與空白組相比，模型組的MPO活性極顯著升高72%(P<0.01),MDA含量極顯著升高147.92%(P<0.01)，SOD活性極顯著下降54.12%(P<0.01)。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組和RF組的MPO活性分別極顯著下降30.3%、22.86%(P<0.01)，RP組和RF組的MDA含量分別極顯著下降53.31%、16.12%(P<0.01)，RP組和RF組的SOD活性分別極顯著增加76.60%、58.46%(P<0.01)。結(jié)果表明，RP組和RF組均能抗氧化應(yīng)激，在一定程度上有效改善UC，3個(gè)指標(biāo)的效果都是RP>RF。

A-LPS水平；B-D-lac水平圖5 RP、RF對(duì)UC小鼠腸黏膜屏障損傷的影響Fig.5 Effects of RP and RF on intestinal mucosal barrier injury in UC mice

A-TNF-α含量；B-IL-1β含量；C-IL-6含量；D-IL-10含量圖6 RP、RF對(duì)UC小鼠炎癥因子的影響Fig.6 Effects of RP and RF on inflammatory factors in UC mice

2.7 RP、RF對(duì)UC小鼠緊密連接蛋白的影響

DSS誘導(dǎo)的UC小鼠會(huì)誘導(dǎo)腸道上皮功能障礙，導(dǎo)致腸道通透性增加和腸內(nèi)細(xì)菌易位，進(jìn)而引發(fā)腸道炎癥[22]。因此采用免疫組化染色檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin在結(jié)腸中的分布。如圖8所示，空白組中細(xì)胞間的棕黃色區(qū)域較多，表示ZO-1和Occludin表達(dá)較高，均勻分布在隱窩之間。與空白組相比，模型組中的陽(yáng)性細(xì)胞減少，分布紊亂，部分隱窩缺失，ZO-1和Occludin表達(dá)明顯減少。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組和RF組的ZO-1和Occludin表達(dá)明顯增加，棕黃色區(qū)域占比顯著提升。結(jié)果表明，RP和RF均能增加UC小鼠的緊密連接蛋白表達(dá)量，結(jié)果表明，RP和RF能有效改善UC小鼠結(jié)腸黏膜屏障受損，從而緩解UC癥狀，效果RP>RF。

A-MPO活性;B-MDA含量;C-SOD活性圖7 RP、RF對(duì)UC小鼠氧化應(yīng)激的影響Fig.7 Effects of RP and RF on oxidative stress in UC mice

A-ZO-1蛋白;B-Occludin蛋白圖8 RP、RF對(duì)UC小鼠緊密連接蛋白的影響Fig.8 Effects of RP and RF on tight junction protein in UC mice

2.8 RP、RF對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

UC小鼠會(huì)造成炎癥細(xì)胞因子過度表達(dá)，NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵開關(guān)，可控制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，通過抑制NF-κB信號(hào)通路激活能防止UC[23]。RP、RF對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響如圖9所示。

如圖9所示，與空白組相比，模型組MyD88mRNA和NF-κBp50mRNA表達(dá)量分別升高 2.93、15.23倍(P<0.01)。經(jīng)RP和RF干預(yù)后，與模型組相比，RP組和RF組MyD88的mRNA表達(dá)量分別降低47.04%(P<0.01)、29.74 %(P<0.01)。RP組和RF組NF-κBp50的mRNA表達(dá)量分別降低3.66倍(P<0.01)、0.81倍(P<0.01)。

與空白組相比，模型組小鼠體內(nèi)的MyD88、NF-κB p50、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白水平表達(dá)均極顯著升高(P<0.01)，說明DSS激活小鼠體內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路。經(jīng)RP組和RF干預(yù)后，與模型組相比,RP組極顯著下調(diào)MyD88、NF-κB p50、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)量，分別為66.27%、30.43%、63.86%、23.16%(P<0.01)。RF組極顯著下調(diào)MyD88、NF-κB p50、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)量分別是18.97%、9.1%、19.30%、5.41%(P<0.01)。結(jié)果表明，RF組更能下調(diào)NF-κB信號(hào)通路中各蛋白的表達(dá)量。提示RP和RF可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路有效拮抗炎癥細(xì)胞因子引起的損傷，減輕UC癥狀。

3 討論與結(jié)論

近年來，天然植物生物活性化合物，如多糖和黃酮，因其強(qiáng)大的抗炎能力和安全性的優(yōu)勢(shì)在緩解UC損傷方面受到越來越多的關(guān)注[24-25]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究RP和RF緩解潰瘍性結(jié)腸炎的效果及可能機(jī)制。

A-MyD88 mRNA表達(dá)量；B-NF-κB p50 mRNA表達(dá)量；C-蛋白印跡圖；D-MyD88、NF-κB p50、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量圖9 RP、RF對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.9 Effects of RP and RF on NF-κB signaling pathway

腸道屏障受損被認(rèn)為是UC的主要特征。當(dāng)緊密連接蛋白(ZO-1和Occludin)的表達(dá)量減少，分布不均勻時(shí)會(huì)導(dǎo)致“腸漏”發(fā)生，大量細(xì)菌及其代謝物(如D-lac和LPS)進(jìn)入腸道和血液，引起各種細(xì)胞炎癥因子的釋放導(dǎo)致腸道炎癥[26]。RP、RF能明顯降低血清中LPS和D-Lac的含量，增加ZO-1和Occludin的表達(dá)并均勻分布。但RP效果更佳，說明RP對(duì)腸道屏障完整性更具有保護(hù)作用進(jìn)而緩解UC。這與CHEN等[27]研究發(fā)現(xiàn)茶多糖能通過上調(diào)UC小鼠中Occludin和Claudin-1表達(dá)，修復(fù)腸道上皮細(xì)胞中黏膜屏障的結(jié)果相同。

UC小鼠的結(jié)腸黏膜會(huì)遭到大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，激發(fā)促炎細(xì)胞因子在結(jié)腸組織中過度表達(dá)，引發(fā)腸道炎癥，促進(jìn)UC的發(fā)生。TNF-α是由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的主要的炎癥內(nèi)源性介質(zhì)，可調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的起始和擴(kuò)散炎癥[28]。IL-1β可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的激活和集聚，增加腸道上皮屏障的通透性。促炎因子IL-6過度表達(dá)可激活NF-κB 信號(hào)通路并加重腸道炎癥。IL-10是能抑制嗜中性粒細(xì)胞、減少促炎因子的表達(dá)、保護(hù)組織和器官不受損傷重要的抗炎細(xì)胞因子[29]。RP和RF均能減少促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，增加抗炎因子IL-10的含量。結(jié)腸病理結(jié)果表明，RP和RF均能改善炎性細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)腸組織，一定程度上保護(hù)結(jié)腸黏膜，RP的效果較佳。

NF-κB 信號(hào)通路的活化是UC發(fā)病的重要特征，能產(chǎn)生更多的促炎因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[30]。抑制NF-κB活化是減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的有效策略?；谝陨辖Y(jié)果表明RP、RF的干預(yù)能使炎癥細(xì)胞因子盡量保持平衡，屬于抗炎物質(zhì)。因此本研究進(jìn)一步關(guān)注RP、RF是否可通過抑制NF-κB 信號(hào)通路減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而緩解UC。模型組中結(jié)腸MyD88、pIkBα和NF-κBp65的蛋白表達(dá)量上調(diào)，說明NF-κB通路激活，經(jīng)RP、RF處理后顯著下調(diào)MyD88、P-IκBα和NF-κBp65的蛋白表達(dá)量，同時(shí)炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6的水平降低，表明RP、RF可抑制NF-κB信號(hào)通路，RP的效果較佳。因此，推斷RP可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路來調(diào)節(jié)UC小鼠的炎癥。

綜上所述，RP和RF均具有緩解DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的作用。與RF相比，相同劑量的RP對(duì)UC小鼠的體重減輕、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短、結(jié)腸組織病理?yè)p傷、炎癥因子表達(dá)、氧化應(yīng)激和抑制NF-kB信號(hào)通路具有更高的抑制作用?；谘芯繑?shù)據(jù)顯示，較RF而言，RP在緩解潰瘍性結(jié)腸炎方面表現(xiàn)出更大的潛力。