大閘蟹下腳料加工水解蛋白粉研究

吳潔茹，任俊龍，何斌國，林俊宇，俞泠音，唐雪，徐鋼春，陸乃彥*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無錫，214081)

中華絨螯蟹，又稱河蟹、大閘蟹或螃蟹，肉味鮮美，含有蟹紅素、蟹黃素和多種維生素[1]，經(jīng)濟(jì)價值高，是我國特色的淡水名優(yōu)品種和出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品。大閘蟹加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展較為緩慢，大都活體銷售，食用方法限于蒸煮或者腌制。而且大閘蟹的銷售主要集中在沿海地區(qū)及大中城市，銷售區(qū)域性較為明顯，食蟹人群狹窄。在大閘蟹的養(yǎng)殖過程中，往往會出現(xiàn)性早熟的一齡河蟹以及小規(guī)格的二齡河蟹[2]，通常被剝離蟹肉脫水炒制肉松[3]、挑出蟹黃制作蟹黃包、蟹黃面，或是以肝胰腺為原料提取蟹油[4]等，在這過程中會產(chǎn)生大量蟹腿、蟹殼等下腳料[5]，其大部分以廢料的方式被排放到環(huán)境中，浪費(fèi)的同時引起一些環(huán)境問題，亟需相關(guān)研究來幫助推進(jìn)大閘蟹下腳料的加工與利用[6]。

大閘蟹下腳料氨基酸種類齊全，組成比例和評分能滿足人體營養(yǎng)需求。吳浩然等[7]發(fā)現(xiàn)大閘蟹碎肉、碎骨等中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到30%，含有17種氨基酸，其中必需氨基酸/氨基酸總量值為34.58%，鮮味氨基酸/氨基酸總量值為41.68%。另外，大閘蟹憑借其獨(dú)特的口感風(fēng)味，可以開發(fā)出具有地方特色的休閑即食食品，具有良好的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益[8]。

從水產(chǎn)品中提取蛋白質(zhì)是深加工的重要方面，蛋白水解產(chǎn)物可被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、保健品、方便食品、調(diào)味品加工等領(lǐng)域。目前，提取方法大體有酸水解法、堿水解法和蛋白酶水解法。與酸法或堿法相比，蛋白酶水解效率高，反應(yīng)條件溫和，容易控制，不破壞氨基酸構(gòu)型等優(yōu)勢[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)將利用大閘蟹下腳料，探究蛋白酶水解大閘蟹下腳料的影響因素，同時確定其最佳工藝條件，并對水解產(chǎn)物的品質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大閘蟹下腳料(蟹腳)，江蘇常州諾亞方舟有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酪蛋白溶液、L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液、木瓜蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，上海滬試化工有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、石油醚、硫酸銅、硫酸、硼酸、乙酸鎂、乙醇、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲基紅指示劑，上海泰坦科技股份有限公司；溴甲酚綠指示劑，北京伊諾凱科技有限公司；鹽酸滴定使用標(biāo)準(zhǔn)溶液，東莞市金智達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9030A熱風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；搗碎機(jī)，上海申略儀器設(shè)備有限公司；80目曬網(wǎng)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ME204E分析天平，梅特勒-托利多有限公司；HH-3A恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司，SER158-3/6全自動脂肪測定儀，意大利VELP公司；電陶爐，艾詩凱奇電器有限公司；馬弗爐，天津市泰斯特儀器有限公司；H1650-W離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)有限公司；SKD-200凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；真空濃縮干燥儀，Eppendorf Concentrator。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大閘蟹下腳料基本成分測定

大閘蟹下腳料水分采用直接干燥法測量[10]，灰分采用高溫灼燒法測量[11]，脂肪采用索氏提取法測量[12]，蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測量[13]。氨基酸組成測定采用酸水解蛋白質(zhì)法，參考GB5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》。

1.3.2 酶法水解工藝流程

大閘蟹下腳料先在烘箱75 ℃下烘干約5 h至恒重。冷卻后取出用破壁機(jī)粉碎，過80目篩制成原料粉末，加入緩沖液，再在一定溫度和pH下加入一定量的蛋白酶進(jìn)行水解。水解完成后100 ℃滅酶10 min，待冷卻至室溫后置于離心機(jī)中1 200 r/min離心10 min，過濾取上清液即獲得蛋白水解液。水解液先在真空濃縮干燥儀中60 ℃濃縮4.5 h，最后在冷凍干燥機(jī)中-60 ℃干燥8～10 h得到水解蛋白粉。

1.3.3 蛋白酶活測定及篩選

1.3.3.1 酶活力測定

采用紫外分光光度法[14]，蛋白酶在一定的溫度與pH下，水解酪素底物，加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并沉淀未水解的酪蛋白，在275 nm下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出稀釋液的酶活力。酶活計算如公式(1)所示：

(1)

式中：X，樣品的酶活力，U/g；X′，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品最終稀釋液的酶活力，U/mL；V，溶解樣品所使用的容量瓶的體積，mL；n，稀釋倍數(shù)；m，樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3.2 蛋白酶篩選

綜合考慮選用了5種常見的酶：中性蛋白酶，堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶，木瓜蛋白酶。在每種酶相對適合的條件下對底物進(jìn)行水解，每隔0.5 h檢測水解度。5種酶的水解條件見表1。

表1 單酶篩選水解條件Table 1 Hydrolysis conditions for single enzyme screening

酶的水解度測定采取電位甲醛法[15]，取樣品處理液2.0 mL置于燒杯中，加20 mL水，開動磁力攪拌器，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.2，加入5.0 mL中性甲醛溶液，搖勻，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH 9.2，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；另取22 mL水先用NaOH溶液調(diào)至pH 8.2，再加入5.0 mL中性甲醛溶液，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 9.2，作為試劑空白試驗(yàn)。氨基態(tài)氮按公式(2)進(jìn)行計算：

(2)

式中：Y，氨基態(tài)氮，g/100mL；V1，測定樣品稀釋液加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0，測定空白加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c，NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量濃度，mol/L；m，樣品質(zhì)量或體積，g或mL。

水解度計算如公式(3)所示：

(3)

式中：DH，蛋白水解度，%；Y0，水解前溶液中的氨基態(tài)氮，g/100mL；Ym，原料中的總氮，g/100mL；Y1，水解液中氨基態(tài)氮，g/100mL。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

采用不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)，pH(7、8、9、10、11)，料液比(6∶100、12∶100、18∶100、24∶100、30∶100,g∶mL)，加酶量(1 000、1 250、1 500、1 750、2 000 U/g)，研究這4種單因素對河蟹下腳料水解效果的影響。每0.5 h利用0.1 mol/L的鹽酸以及氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，3 h后測取水解度。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高水解度以及蛋白質(zhì)回收率，以溫度、pH、加酶量、時間等條件設(shè)計正交試驗(yàn)，以水解度為評價指標(biāo)，篩選出最適合水解的條件組合。各因素水平見表2。

表2 正交設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design

1.3.6 水解液氨基酸組成分析

將2 mL河蟹下腳料水解液過濾后放入水解管，然后加入1 mL 6 mol/L的HCl，并充氮3 min，擰緊水解管蓋，放入120 ℃的烘箱中，水解22 h。將水解管樣品全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加4.8 mL 10 mol/L的NaOH中和，用蒸餾水定容至25 mL，隨后用雙層濾紙過濾。取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管，在10 000 r/min下離心10 min。將濾液加入樣品瓶，在全自動氨基酸檢測儀中進(jìn)行氨基酸檢測[16]。

1.3.7 水解蛋白粉肽分布測定

參考GB/T 22492—2008 《大豆肽粉》對蛋白水解液進(jìn)行肽分布測定。取10 mL水解液，加入少許流動相并超聲10 min，用孔徑0.45 μm有機(jī)相膜過濾，然后進(jìn)行高效液相色譜檢測。色譜柱：ACE 5 C18-300寬孔柱，4.6 mm×150 mm。流動相：4%～70%乙腈-0.1% 三氯乙酸體系，混合梯度洗脫120 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個平行樣品，結(jié)合SPSS Statistics 17.0軟件對得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)DUNCAN檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 下腳料營養(yǎng)成分和氨基酸組成

由表3和表4可知，新鮮蟹腳蛋白質(zhì)含量為5.54%(按干物質(zhì)記占11.71%)、灰分為36.83%、脂肪僅為0.71%，蛋白質(zhì)含量較高，而脂肪含量較低。共檢測出17種氨基酸，其中包含7種必需氨基酸(占總量的34.58%)和4種鮮味氨基酸(占總量的41.68%)[17]，且天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量均大于1 g/100g(表3)。蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的評價一般是以氨基酸的組成和含量為依據(jù)，特別是8種必需氨基酸(色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸)含量的高低和構(gòu)成比，而水產(chǎn)品的鮮度在一定程度上則取決于鮮味氨基酸的含量[18]。綜上所述，蟹腳蛋白質(zhì)氨基酸組成豐富，具有較高的營養(yǎng)價值，且味道鮮美，有極大的深加工利用價值。

表3 大閘蟹下腳料基本營養(yǎng)成分Table 3 Basic nutrients in hairy crabs byproduct

表4 大閘蟹下腳料水解氨基酸的組成和含量Table 4 Composition and content of hydrolyzed amino acids in hairy crab byproduct

2.2 蛋白酶活測定及篩選結(jié)果

5種酶活力測定結(jié)果如表5所示。

表5 酶活力測定結(jié)果Table 5 Enzyme activity determination

由圖1可知，5種酶的水解能力依次為：堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶。堿性蛋白酶和中性蛋白酶對本實(shí)驗(yàn)大閘蟹下腳料粉末具有較強(qiáng)水解能力。由于特定的酶擁有特定的酶切位點(diǎn)，對同一種底物來說，酶切位點(diǎn)越多，其表現(xiàn)的水解效果就越好。堿性蛋白酶，由于活性中心含有絲氨酸，故又稱絲氨酸蛋白酶，是一種最適pH為堿性的蛋白酶，其水解時，要求在水解點(diǎn)羧基側(cè)具有芳香族或疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等),而特定的金屬離子如Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等可以顯著提高堿性蛋白酶的活性。堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物疏水氨基酸大多位于肽鏈末端，因此可以緩解由疏水氨基酸產(chǎn)生的苦味，改善蛋白粉風(fēng)味[19]。

此外，酶催化反應(yīng)速率在1 h時最大，而后逐漸減緩，在第3 h后達(dá)到穩(wěn)定。這主要是由于隨著反應(yīng)時間的延長，蛋白酶底物濃度逐漸降低，中間和最終產(chǎn)物逐漸增加，從而抑制蛋白酶的活性。而反應(yīng)過程中環(huán)境條件如pH和金屬離子的變化亦可以改變蛋白酶的酶解速率。

圖1 不同蛋白酶水解能力Fig.1 Hydrolytic capacity of different proteases

2.3 酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，隨著pH值的升高，樣品水解度先逐漸升高，在pH=8時水解度達(dá)到最大，隨后逐漸下降，最終在pH=10和pH=11時趨于穩(wěn)定。這是由于在不同環(huán)境下，蛋白酶及其底物的解離程度不同。pH值過高或過低均會導(dǎo)致蛋白酶構(gòu)象發(fā)生改變，從而抑制蛋白酶的活性，降低水解度。隨著溫度的升高，樣品水解度同樣逐漸升高，在50 ℃達(dá)到最高值，隨后急劇下降。這是因?yàn)樘岣邷囟瓤梢栽黾铀夥磻?yīng)的速率，提高蛋白酶的活性[20]，但由于蛋白酶本身也是蛋白質(zhì)，過高的溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使蛋白酶構(gòu)象發(fā)生不可逆改變，進(jìn)而使其永久性失活。隨著料液比的增大，樣品水解度先逐漸升高，而后逐漸減小。這是因?yàn)樵诩用噶恳欢ǖ那闆r下，過高的料液比會導(dǎo)致底物無法全部溶于溶劑中，造成底物分布不均勻，而過低的料液比雖然可以將底物充分均勻地分布于液相體系中，但底物濃度低，不能占據(jù)蛋白酶全部活性中心，導(dǎo)致反應(yīng)效率下降。同時，在加酶量不超過1 500 U/g時，隨著加酶量的增加，樣品水解度逐步上升，但當(dāng)加酶量超過1 500 U/g時，水解度逐漸趨于平緩，不再隨加酶量的升高而升高。這主要是因?yàn)楫?dāng)加酶量較少時，過量的底物能夠占據(jù)酶的全部活性中心[21]，水解速率主要由酶的數(shù)量控制，因此水解度隨加酶量增加而升高，而當(dāng)加酶量超過一定限制時，底物不再過量，不能占據(jù)所有酶的活性中心，水解速率主要由底物的濃度控制，因此水解度不隨加酶量的變化而變化。因此，pH=8，酶解溫度50 ℃，料液比18∶100(g∶mL)，加酶量1 500 U/g是堿性蛋白酶最佳水解條件。

a-pH-水解度關(guān)系曲線；b-溫度-水解度關(guān)系曲線；c-料液比-水解度關(guān)系曲線；d-加酶量-水解度關(guān)系曲線圖2 單酶水解條件對水解度影響Fig.2 Effect of single enzyme hydrolysis conditions on hydrolysis degree

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以水解度為評價指標(biāo)，采用L16(44)進(jìn)行正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，最適合酶解的條件為9號實(shí)驗(yàn)條件，即溫度50 ℃，pH為7，加酶量1 500 U/g，時間3.5 h。對于酶解條件來說，溫度是首要影響因素，50 ℃的環(huán)境非常適合酶進(jìn)行水解。同時，pH為7的中性環(huán)境液更適合酶進(jìn)行水解，若pH過于高，酶會因此而失活。在加酶量為1 500 U/g時，反應(yīng)3.5 h，底物能與酶活性中心充分接觸，水解反應(yīng)達(dá)到最佳。所以，本實(shí)驗(yàn)確定的最適合酶反應(yīng)的條件為：溫度50 ℃，pH=7，料液比18∶100(g∶mL)，加酶量1 500 U/g，時間3.5 h，此時的水解度為33%。

表6 酶解正交實(shí)驗(yàn)表Table 6 Orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis

2.5 水解氨基酸組成

酶解液中共檢測出17種氨基酸(表7)，其中脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸是大閘蟹下腳料酶解液主要的氨基酸成分。必需氨基酸占氨基酸總量的58.85%，谷氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸占39.12%，賦予蛋白粉濃郁的河蟹香味。

表7 氨基酸組成Table 7 Amino acid composition

2.6 水解蛋白粉肽分布

由表8可知，在利用堿性蛋白酶在適宜酶解條件下酶解后，樣品中分子質(zhì)量<1 000 Da的肽段占89.61%，即酶解液中富含大量短肽分子。相比與大分子蛋白質(zhì)，短肽分子具有溶解性高、黏度低、熱穩(wěn)定性好、吸收快、吸收利用率高等特點(diǎn)[22]，對高血壓、高血脂以及血栓的形成具有一定預(yù)防作用，同時還具有改善脂質(zhì)代謝，提高免疫力等功能[23]，對于營養(yǎng)吸收困難者或在短時間內(nèi)急需大量氮源的運(yùn)動人群具有重要意義[24]。

表8 肽分子質(zhì)量分布Table 8 Molecular weight distribution of peptides

3 結(jié)論

大閘蟹蛋白粉末的最佳水解酶為堿性蛋白酶，最適水解條件為pH 7，水解溫度50 ℃，料液比18∶100(g∶mL)，加酶量為1 500 U/g。水解得到的蛋白粉鮮味足、苦味低，完美保留大閘蟹特有的風(fēng)味。同時蛋白粉氨基酸組成豐富，含量高達(dá)66.85 g/100g，分子質(zhì)量小于1 000 Da的肽段占89.61%，8種必需氨基酸種類齊全，富含谷氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸，總量為26.15 g/100g，占氨基酸總量的39.12%。這賦予了水解蛋白粉河蟹香味和較高的營養(yǎng)價值，并且能夠加強(qiáng)對大閘蟹下腳料資源的回收利用，避免對環(huán)境的污染和浪費(fèi)。