改善口臭的乳桿菌篩選及口腔益生特性評價

蔣震濤，單寶坤，張秋香，唐鑫，毛丙永，崔樹茂，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

口臭是指在呼吸時會出現(xiàn)臭味氣體的癥狀?？诔糇鳛榈谌罂谇唤】祮栴}，嚴(yán)重影響人們的身心健康以及生活質(zhì)量[1]。流行病學(xué)研究顯示中國人群口臭的患病率約為27.5%[2]。80%～90%的口臭與口腔因素相關(guān)，主要成因是口腔內(nèi)的微生物分解含硫氨基酸或血清從而產(chǎn)生了以揮發(fā)性硫化物(volatile sulfur compounds, VSCs)為主的代謝產(chǎn)物，其中90%的VSCs是H2S和甲硫醇，還有二甲基硫醚等[3]。

具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum, Fn)在口腔中的豐度高，可以產(chǎn)生半胱氨酸脫氫酶以降解L-半胱氨酸從而產(chǎn)生H2S。此外它還可以利用谷胱甘肽等生成H2S[4]，并降解蛋氨酸生產(chǎn)甲硫醇[5]。H2S是主要的VSCs，在多達90%的患病牙周袋中發(fā)現(xiàn)，濃度高達2 mmol/L，而Fn產(chǎn)H2S的濃度可達3 mmol/L，是產(chǎn)H2S的主力軍[6]。此外，F(xiàn)n作為口腔的中間“橋梁”菌，在口腔中主要以生物膜形式存在，它在口腔中形成生物膜是口臭不易治療的主要原因之一。

目前治療口臭的方法主要有物理方式如刮舌、洗牙或化學(xué)療法如使用洗必泰、精油等漱口水產(chǎn)品，但沒有從本質(zhì)上降低VSCs的濃度，效果不佳[7-8]。對于由微生物引起的口源性口臭，應(yīng)“對癥下藥”，用微生物的方法解決。因此益生菌憑借其可以減少致病菌的定植、與病原菌共聚、維持口腔微生態(tài)的平衡等優(yōu)勢，逐步應(yīng)用于口腔領(lǐng)域[9]。已有研究報道唾液鏈球菌、嗜熱鏈球菌、唾液乳桿菌等能抑制病原菌或VSCs的產(chǎn)生[10-12]，但上清液用量大時才起效果，且沒有綜合評價抑制生長、生物膜形成和VSCs產(chǎn)生的能力。

本研究通過H2S、VSCs、產(chǎn)氣基因、生物膜等評價指標(biāo)，綜合篩選到2株乳桿菌，植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215。這2株乳桿菌能夠顯著抑制Fn產(chǎn)VSCs、抑制其生物膜的形成，且有良好的口腔益生特性。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)ATCC25586購于廣東省菌種保藏中心。唾液鏈球菌K12分離自產(chǎn)品BLIS K12TM。150株乳桿菌均來自江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心菌種保藏中心。

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑

Sorfa進口無菌tc處理96孔平底細胞培養(yǎng)板，無錫恒康醫(yī)療科技有限公司；甲醇、結(jié)晶紫、冰醋酸、氯化血紅素，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；辣根過氧化物酶、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)，生工生物工程(上海)股份有限公司；亞碲酸鉀溶液，青島博生物技術(shù)有限公司；維生素K1，阿拉??；無菌脫纖維羊血，杭州新銳生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Bacteria RNA Extraction Kit，諾唯贊生物科技有限公司。

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨10，牛肉浸膏10，酵母提取物5，三水合磷酸氫二鉀2.6，檸檬酸氫二銨2，乙酸鈉2，七水合硫酸鎂0.1，一水合硫酸錳0.05，吐溫80 1 mL，pH 6.2～6.4，115 ℃高壓滅菌20 min；用于乳桿菌的分離和培養(yǎng)。

(2)BHI培養(yǎng)基：購自青島海博，液體培養(yǎng)基另外添加0.05%(體積分?jǐn)?shù))的氯化血紅素和0.1%的維生素K1，固體培養(yǎng)基添加5%(體積分?jǐn)?shù))的無菌脫纖維羊血，pH 7.2～7.4；用于Fn的培養(yǎng)。

(3)MSA培養(yǎng)基：購自青島海博，另每100 mL添加過濾除菌1%(體積分?jǐn)?shù))亞碲酸鉀溶液0.28 mL；用于唾液鏈球菌的分離和培養(yǎng)。

1.3 儀器與設(shè)備

臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；高溫高壓滅菌鍋，日本三洋電機株式會社；Multiscan Go全波長酶標(biāo)儀，賽默飛士爾科技有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；DG250厭氧培養(yǎng)箱，華粵行儀器；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、電泳裝置、凝膠成像儀、實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；生物安全柜、超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Infinite?F50，德國Tecan公司；Model 4170BLU Halimeter口臭儀，美國Interscan公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌懸液與上清液的制備

凍存甘油管中的Fn、唾液鏈球菌K12、以及150株乳桿菌分別用BHI、MSA、MRS固體培養(yǎng)基活化，挑取單菌落于BHI、MRS、MRS液體培養(yǎng)基活化2代，其中Fn于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，唾液鏈球菌K12和乳桿菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集菌體制備菌懸液，調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL。

乳桿菌和唾液鏈球菌K12于37 ℃培養(yǎng)24 h后，于12 000 r/min、4 ℃、離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后存于-20 ℃，備用。

1.4.2 基于抑制具核梭桿菌產(chǎn)H2S的定性篩選

通過H2S與FeSO4反應(yīng)產(chǎn)生黑色的FeS沉淀初步判斷乳桿菌抑制Fn產(chǎn)生H2S的能力[6]。具體做法為配制母液，使培養(yǎng)基中含0.02%(體積分?jǐn)?shù))的硫酸亞鐵和0.03%(體積分?jǐn)?shù))的硫代硫酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用，經(jīng)0.22 μm的無菌濾膜過濾后加入BHI培養(yǎng)基中，隨后加入2%的109CFU/mL Fn菌懸液，再加入5%的上清液或MRS培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，根據(jù)沉淀情況判斷：“-”表示無沉淀，“+”有一點沉淀，“++”有較多沉淀，“+++”有大量沉淀。

1.4.3 揮發(fā)性硫化物的測定

參考王小玉[13]的方法并進行了改動：將107CFU/mL的Fn菌懸液與15%(體積分?jǐn)?shù))的乳桿菌上清液共2 mL加至亨蓋特試管中，共培養(yǎng)9 h，用2個50 mL注射器針頭插入試管中，一頭連接Halimeter口臭儀，一頭用來平衡氣壓，邊用振蕩器振蕩，邊測量。由于對照組超出Halimeter的檢出上限2 000，故對照組氣體需稀釋后進行測量。具體操作為振蕩混勻后，用1 mL注射器吸取1 mL氣體，立即加入一管空的亨蓋特試管中，邊振蕩邊測量，數(shù)值穩(wěn)定后并開始下降時，讀取最高值，再代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到數(shù)值，重復(fù)3次。

1.4.4 RNA提取，cDNA合成及實時熒光定量PCR

將107CFU/mL的Fn菌懸液與15%的乳桿菌上清液共2 mL加至亨蓋特試管中，培養(yǎng)9 h。以諾唯贊Bacteria RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA，并根據(jù)諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將合成的cDNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用?中設(shè)計獲得的引物進行熒光定量PCR，并以16S rRNA基因作內(nèi)參基因。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.5 生物膜形成的測定

利用BHI液體培養(yǎng)基將活化好的Fn菌液濃度調(diào)整到107CFU/mL，靜置培養(yǎng)9 h。在96孔板中每孔加入菌懸液190 μL，隨后加入10 μL過濾后的乳桿菌上清液，每種上清液設(shè)置6個平行孔。陰性對照組以添加的上清液的同體積的MRS代替乳桿菌上清液。

37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，去掉上清液，以PBS清洗2遍，接著用99%的甲醇固定15 min。棄上清液，室溫干燥完全后，每孔加入100 μL的0.1%(體積分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫溶液，染色5 min，染色結(jié)束后以無菌水清洗2次，然后于室溫下放置至完全干燥。最后加入33%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸溶液200 μL進行溶解，用槍吹打混勻后，每孔移取175 μL至一個新的96孔板中，于酶標(biāo)儀570 nm處讀取吸光值。生物膜減少量的計算如公式(1)所示：

(1)

1.4.6 益生菌對具核梭桿菌生長的影響

在96孔板每孔中加入107CFU/mL Fn菌懸液190 μL，隨后加入過濾后的乳桿菌上清液10 μL，用Tecan infinite F50儀器37 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔30 min在600 nm處測定吸光值，繪制生長曲線。

1.4.7 自聚、共聚能力的測定

參考KOS等[14]的方法，將乳桿菌菌懸液與Fn菌懸液等體積混合，分別培養(yǎng)2、4、8 h，在600 nm 下測定混合菌懸液吸光度，記錄此時的吸光值為Ax。共聚率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1，乳桿菌的初始OD600值；A2，F(xiàn)n的初始OD600值；Ax，靜止孵育xh后細菌懸液上清液的吸光值。

自聚率的計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，初始的吸光值；Ax，靜止孵育xh后細菌懸液上清液的吸光值。

1.4.8 乳桿菌產(chǎn)H2O2的能力測定

參考王江[15]的方法，用100 mmol/L哌嗪-N,N′-二-乙磺酸(piperazine-N,N_-bis 2-ethanesulfonic acid, PIPES)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2稀釋至1 mol/L，再用100 mmol/L PIPES將1 mol/L H2O2分別稀釋成0、20、25、35、40、50 umol/L工作液；然后分別取100 μL 上述H2O2工作液與100 μL 20 mmol/L的TMB混合，最后向混合溶液中加入2 μL 1 mg/mL辣根過氧化物酶并混勻，16 ℃孵育10 min，測量OD600值作出相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后取乳桿菌上清液100 μL代替H2O2工作液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線做法測OD600值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到H2O2的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

本文中的所有圖形均采用GraphPad Prism 8.0進行繪制。所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間的顯著性差異采用單因素方差分析；實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表明數(shù)據(jù)分析結(jié)果呈顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌上清液抑制具核梭桿菌產(chǎn)H2S的能力

根據(jù)沉淀的量進出初步的篩選，150株乳桿菌中有52株有一點沉淀，67株沉淀較多，3株有大量沉淀，有28株乳桿菌無沉淀，無沉淀產(chǎn)生的乳桿菌結(jié)果如表2所示。

表2 抑制具核梭桿菌產(chǎn)H2S的乳桿菌Tab.2 Lactobacillus that inhibits H2S production by Fusobacterium nucleatum

2.2 乳桿菌上清液抑制具核梭桿菌產(chǎn)VSCs的能力

根據(jù)H2S的抑制初步篩選到28株乳桿菌，進一步通過Halimeter儀器對Fn產(chǎn)生的VSCs進行定量。用1 mL的注射器將亨蓋特管中的氣體分別吸出0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL注入新的亨蓋特試管中，進行測量得到對應(yīng)的VSCs值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

VSCs是口臭的主要元兇，不僅反映了口臭的程度，還會破壞牙齦組織，是非常重要的指標(biāo)。根據(jù)圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到28株乳桿菌抑制Fn產(chǎn)VSCs的能力，結(jié)果如表3所示，其中7株乳桿菌的抑制能力高于80%，且高于陽性對照唾液鏈球菌K12的71.16%，其余的乳桿菌都低于80%，甚至低于60%。因此選擇植物乳桿菌CCFM1214、唾液乳桿菌CCFM1215、發(fā)酵乳桿菌HN23、干酪乳桿菌ATCC334、干酪乳桿菌VCQYoY1157M2、干酪乳桿菌VCQYB6170M3和羅伊氏乳桿菌51共7株乳桿菌研究其對產(chǎn)VSCs基因的表達量以及生物膜形成量的影響。

圖1 Halimeter儀標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Halimeter

表3 乳桿菌對具核梭桿菌產(chǎn)VSCs的影響Table 3 Effect of Lactobacillus on VSCs production by Fusobacterium nucleatum

2.3 乳桿菌上清液對Fn1220基因的影響

Fn在口腔中產(chǎn)生大量的H2S，這是由4種酶(Fn0625、Fn1055、Fn1220和Fn1419)介導(dǎo)的，其中Fn1220貢獻87.6%的作用[16-17]。采用熒光定量PCR方法分別考察Fn中與產(chǎn)VSCs相關(guān)的基因Fn1220在有無乳桿菌上清液存在的情況下的表達差異情況。結(jié)果如圖2所示，所有乳桿菌均能顯著降低Fn1220的表達量(P<0.05)，其中植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215的抑制能力最佳，分別是95.32%和90.45%，優(yōu)于陽性對照唾液鏈球菌K12。

圖2 乳桿菌對Fn1220基因的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus on the expression of Fn1220注：***表示P<0.001，與MRS組相比

2.4 乳桿菌上清液抑制具核梭桿菌生物膜的能力

牙周袋和舌苔是口臭的危險因素，因為它們?yōu)楫a(chǎn)生VSCs和其他氣味分子的細菌提供了理想的生長環(huán)境[18-19]。而微生物通常以生物膜的形式存在于牙周袋和舌苔中，F(xiàn)n作為牙菌斑形成的中間橋梁菌，其生物膜的形成是造成口臭的關(guān)鍵，因此抑制其生物膜為緩解口臭提供了可能性[20]。采用結(jié)晶紫染色法測定乳桿菌抑制Fn形成生物膜的能力，結(jié)果如表4所示，僅添加5%的乳桿菌上清液時，植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215的抑制效果最佳，超過了30%，分別是34.6%和39.98%，而大部分文獻都是添加25%～50%[13,20]才有效。綜合抑制Fn1220基因以及抑制生物膜的結(jié)果，植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215的體外效果較好，有一定的潛力。因此這2株菌可作為潛在口腔益生乳桿菌，進一步對其進行益生特性評價分析。

2.5 乳桿菌上清液對具核梭桿菌生長的影響

口腔疾病很多都是由于口腔菌群失調(diào)引起的，一定的抑菌能力有助于乳桿菌調(diào)節(jié)口腔的菌群。結(jié)果如圖3所示，2株乳桿菌都有抑制Fn生長的能力。到達穩(wěn)定期時，唾液乳桿菌CCFM1215對Fn生長的抑制率為23.06%，植物乳桿菌CCFM1214的抑制率為13.32%。

表4 乳桿菌對具核梭桿菌生物膜的抑制作用Table 4 Inhibitory effect of Lactobacillus on the biofilm of Fusobacterium nucleatum

圖3 植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215對具核梭桿菌生長的影響Fig.3 Effects of L.plantarum CCFM1214 and L.salivarius CCFM1215 on the growth of Fusobacterium nucleatum

2.6 乳桿菌與具核梭桿菌的共聚能力

乳桿菌通過自身聚集，利用自身產(chǎn)生的胞外物質(zhì)形成保護膜，保護菌株免受環(huán)境變化的影響，有利于自身的定植[21]。此外，有研究認(rèn)為乳桿菌抑制病原菌生物膜的能力與它們共聚集病原菌的能力有關(guān)[22]。因此，自聚集和共聚集能力也是評價乳桿菌口腔益生特性的一個指標(biāo)。如圖4所示，唾液乳桿菌CCFM1215在2 h時自聚率為9.21%，4 h時突破至33.47%，8 h達到41.79%?？傮w來說，唾液乳桿菌CCFM1215的自聚能力優(yōu)于植物乳桿菌CCFM1214(8 h時27.99%)。植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215都顯示出了與Fn良好的共聚能力，均優(yōu)于陽性對照唾液鏈球菌K12。2株乳桿菌在2 h時與Fn的共聚率就超過了50%，在8 h時，植物乳桿菌CCFM1214與Fn的共聚率為71.44%，唾液乳桿菌CCFM1215為72.95%。

2.7 乳桿菌產(chǎn)H2O2能力

乳桿菌可以產(chǎn)生H2O2，而H2O2則可通過抑制對其敏感的微生物，使得自身獲得競爭優(yōu)勢，從而在生物膜形成過程中發(fā)揮重要的菌群調(diào)節(jié)作用[23-24]。此外H2O2不僅能殺滅口腔內(nèi)產(chǎn)生VSCs的厭氧菌，還能有效降低口腔異味唾液硫醇前體水平，因此有改善口臭的潛力。H2O2濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

a-自聚能力;b-共聚能力圖4 植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215的自聚和共聚能力Fig.4 Self-aggregation and co-aggregation ability of L.plantarum CCFM1214 and L.salivarius CCFM1215

圖5 H2O2濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for determination of hydrogen peroxide concentration

乳桿菌產(chǎn)生的H2O2在辣根過氧化物酶的催化下與TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，通過吸光值反應(yīng)濃度的高低。根據(jù)圖5的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到了植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215產(chǎn)H2O2的濃度，結(jié)果如圖6所示。2株乳桿菌產(chǎn)H2O2的能力都極顯著高于唾液鏈球菌K12(P<0.01)，表明這2株乳桿菌有通過H2O2拮抗其他菌的潛力，有望在調(diào)控口腔微生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。

圖6 植物乳桿菌CCFM1214和唾液乳桿菌CCFM1215產(chǎn)H2O2的能力Fig.6 The ability of CCFM1214 and CCFM1215 to produce H2O2注：**表示P<0.01，***表示P<0.001，與唾液鏈球菌K12比

3 結(jié)論

80%～90%的口臭都是由微生物引起的口腔疾病，近3成的中國人都患有口臭。乳桿菌作為益生菌，近年來在口腔疾病方面的應(yīng)用逐步受到重視。本研究篩選得到1株植物乳桿菌CCFM1214和1株唾液乳桿菌CCFM1215不僅可以抑制具核梭桿菌產(chǎn)生VSCs，而且在僅添加5%的上清液時即可其抑制生物膜的形成，還可以顯著下調(diào)產(chǎn)生VSCs的基因Fn1220，抑制其生長，綜合達到改善口臭的效果。此外這2株乳桿菌產(chǎn)H2O2能力顯著高于唾液鏈球菌K12，且都與具核梭桿菌有良好的共聚能力，抑制病原菌在口腔中的生長和生物膜的形成等，為益生菌在改善口臭方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。