代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)肌苷

朱彥凱，劉鐵重，伍法清，吳鶴云，謝希賢*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300457)

肌苷是一種嘌呤核苷，參與機體物質(zhì)代謝和能量代謝，具有重要的應用價值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，肌苷常用于肝病、心臟病等疾病治療藥物的生產(chǎn)，也用于異丙肌苷和利巴韋林等抗病毒藥物的合成。在食品領(lǐng)域，肌苷是復合鮮味劑“I+G”的重要原料。此外，肌苷還被廣泛應用在農(nóng)業(yè)、化工和營養(yǎng)保健等諸多領(lǐng)域。目前，主流的肌苷生產(chǎn)方式為微生物發(fā)酵法，該方法利用廉價的原材料，通過生物反應器的擴大培養(yǎng)得到發(fā)酵液，再經(jīng)過分離純化得到肌苷產(chǎn)品，具有高效、穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點。除此之外，酶解法與化學分解法也曾用來生產(chǎn)肌苷，但因其存在較多弊端而被淘汰。

肌苷生物合成途徑包含3個部分(圖1)：首先，葡萄糖磷酸化后形成6-磷酸葡萄糖，后者經(jīng)磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)生成5-磷酸核糖，在5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)合酶(PRPP synthetase，Prs)的催化下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為PRPP。接著，以PRPP、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)和一碳單位等為前體物，經(jīng)10步酶促反應生成肌苷酸(inosine monophosphate，IMP)。最后，IMP在5′-核苷酸酶的催化下生成肌苷。合成途徑冗長復雜，還受到嚴格的反饋調(diào)控，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷的限制因素之一。另外，肌苷的直接前體物IMP存在另外兩條分支途徑，與肌苷支路競爭碳代謝流，是限制肌苷合成的另一關(guān)鍵因素。常見的肌苷工程菌株也是主要針對以上兩個方面進行構(gòu)建。首先是增強肌苷合成途徑及解除限速酶所受反饋調(diào)控。ASAHARA等[1]通過敲除枯草芽孢桿菌KMBS436的purR基因和嘌呤操縱子核糖開關(guān)，解除了嘌呤合成中的反饋阻遏和轉(zhuǎn)錄衰減；又通過優(yōu)化嘌呤操縱子的啟動子序列，增強了嘌呤基因的表達，肌苷產(chǎn)量從1.8 g/L提升至6 g/L。SHIMAOKA等[2]在大腸桿菌I-9m中過表達了purFK326Q,P410W和prsD128A突變基因，解除了限速酶反饋抑制，使肌苷產(chǎn)量提高了3.6倍。另外是阻斷肌苷合成過程的競爭代謝途徑。LI等[3]通過敲除枯草芽胞桿菌BS017中的purA基因來阻斷腺苷支路，肌苷產(chǎn)量從150 mg/L提升至7.6 g/L。PEIFER等[4]通過敲除谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的purA和guaB基因，同時阻斷了腺苷和鳥苷支路，使IMP產(chǎn)量增加了45倍。然而直接阻斷腺苷或鳥苷支路均會導致菌株營養(yǎng)缺陷[5]，菌株生長緩慢，不利于產(chǎn)物生產(chǎn)。因此，適當調(diào)節(jié)腺苷和鳥苷合成支路通量，平衡菌株生長和產(chǎn)物合成，是肌苷工程菌株構(gòu)建的重點和難點。

在早期研究中，主要通過誘變枯草芽孢桿菌的方式來選育肌苷工程菌株，但誘變后的菌株普遍生產(chǎn)穩(wěn)定性偏低，且易發(fā)生負向突變，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[6]。隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展，運用代謝工程理論和基因編輯技術(shù)對野生型菌株進行從頭遺傳改造成為肌苷工程菌株構(gòu)建的主要方法。相比芽孢桿菌，大腸桿菌遺傳背景清晰，基因操作簡便，發(fā)酵周期較短，是發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷另一個優(yōu)良的宿主。然而，目前已有肌苷生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)效率仍然偏低，且普遍存在攜帶質(zhì)粒、營養(yǎng)缺陷等問題，增加了生產(chǎn)的成本，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。此外，現(xiàn)有菌株的構(gòu)建策略多局限在對限速反應、分支途徑等關(guān)鍵節(jié)點進行改造，少有對肌苷代謝網(wǎng)絡的系統(tǒng)優(yōu)化。針對這些問題，本研究選擇大腸桿菌標準株作為出發(fā)菌株，采用代謝工程技術(shù)，通過阻斷肌苷降解途徑、強化肌苷合成途徑、弱化腺苷合成支路、增強前體物供應及修飾肌苷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，獲得了一株無質(zhì)粒、非缺陷型且可穩(wěn)定生產(chǎn)的肌苷工程菌株。

圖1 肌苷生物合成途徑和本研究的改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of inosine and the strategies used in this study注：*表示突變體

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

表1列舉了本研究所用到的菌株及質(zhì)粒。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

引物，GENEWIZ公司；Primer STAR HS DNA、ExtaqDNA Polymerase，TaKaRa公司；2×RapidTaqMix、ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，Vazyme公司；Plasmid Mini Kit I D6943、Gel & PCR Clean Up Kit D2000、Cycle Pure Kit D6492，Omega Bio-Tek公司。

1.2 引物

具體內(nèi)容見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220509.1719.012.html)。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，NaCl 5，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，KH2PO4·3H2O 1.2，蛋白胨3，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各0.001。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉4，蛋白胨5，檸檬酸鈉2，KH2PO4·3H2O 2，MgSO4·7H2O 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各0.002。

在INO2-4基礎上改造的菌株，培養(yǎng)基中均增添0.3 g/L腺嘌呤。

1.4 基因編輯方法

本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯方法[7]對大腸桿菌進行基因改造。該方法由pGRB質(zhì)粒、pREDCas9質(zhì)粒和DNA重組片段3個元件共同介導，即pGRB質(zhì)粒和DNA重組片段以電轉(zhuǎn)化的方式導入到含pREDCas9質(zhì)粒的感受態(tài)細胞中，pGRB質(zhì)粒表達出特異性gRNA來識別目的基因靶位點，pREDCas9質(zhì)粒表達出Cas9蛋白對該位點進行切割，DNA重組片段通過同源重組的方式對切割位點進行修復，最終實現(xiàn)基因的準確敲除與整合。具體步驟以整合pbuE基因為例：

使用Primer 5軟件設計上同源臂引物yjiT-UP-S和yjiT-UP-A、插入片段引物pbuE-S和pbuE-A、下同源臂引物yjiT-DN-S和yjiT-DN-A。通過PCR擴增獲得上同源臂yjiT-UP、插入片段Ptrc-pbuE、下同源臂yjiT-DN，純化回收后再經(jīng)PCR重疊獲得DNA重組片段yjiT∶∶Ptrc-pbuE。使用Cas-Designer工具設計yjiT假基因位點切割靶序列，獲得gRNA-yjiT-S和gRNA-yjiT-A兩條單鏈。將上述單鏈退火所得雙鏈片段與線性化載體進行同源重組，再化轉(zhuǎn)至DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子以獲得pGRB-yjiT質(zhì)粒。將重組片段yjiT∶∶Ptrc-pbuE和pGRB-yjiT質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)化至含pREDCas9質(zhì)粒的INO3-2感受態(tài)細胞中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并消除pGRB質(zhì)粒和pREDCas9質(zhì)粒，獲得重組菌株INO4-2。

1.5 發(fā)酵方法

1.5.1 搖瓶發(fā)酵

發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵周期為24 h，發(fā)酵過程中通過補加氨水維持pH值為7.0～7.2，初始葡萄糖耗盡后，補加600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行。具體操作可參考文獻[8]。

1.5.2 發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

發(fā)酵溫度為37 ℃,pH為7.0,溶氧(dissolved oxygen，DO)為25%～35%，接種量為20%，發(fā)酵周期為48 h。具體操作可參考文獻[8]。

1.6 檢測方法

采用高效液相色譜法方法[Thermo U3000，C18色譜柱，V(乙腈)∶V(0.5%三氟乙酸水溶液)=2∶98]對肌苷濃度進行檢測，設置柱溫30 ℃，流速1 mL/min，紫外檢測波長260，進樣量20 μL。

殘?zhí)菨舛群蜕锪?OD600)測定參考文獻[8]進行。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

參考文獻[8]進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌苷合成途徑的強化

強化合成途徑是促進產(chǎn)物積累的常用策略之一。在之前的研究中，本實驗室通過誘變篩選獲得了一株產(chǎn)鳥苷的解淀粉芽孢桿菌突變株TA208。測序結(jié)果表明[9]，該菌株的嘌呤操縱子已發(fā)生突變，推測有助于解除反饋調(diào)控，提升嘌呤從頭合成酶系的表達水平。本研究首先敲除了野生型大腸桿菌MG1655的rihA、rihB、rihC、deoD、ppnP基因，以阻斷肌苷的降解，構(gòu)建了底盤菌株INO1-1。為強化肌苷合成途徑，本研究將突變株TA208的嘌呤操縱子(purEKBCSQLGMNHD)整合在底盤菌株INO1-1的yghE假基因位點，由Ptrc啟動子控制，構(gòu)建了菌株INO1-2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，INO1-2的肌苷產(chǎn)量達到155.2 mg/L。

PRPP和谷氨酰胺在PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶(amidophosphoribosyltransferase，PurF)催化下生成5-磷酸核糖胺和谷氨酸，是肌苷合成途徑的限速步驟，而PurF的催化活性受腺苷酸(adenosine monophosphate，AMP)和鳥苷酸(guanosine monophosphate，GMP)的協(xié)同反饋抑制[10]。據(jù)報道，大腸桿菌自身的PurF和枯草芽孢桿菌來源的PurF均可通過定點突變解除其所受反饋抑制[2,11]。于是，本研究將這兩種來源的突變基因purFecoK326Q,P410W和purFbsuD293V,K316Q,S400W分別整合至INO1-2的yeeP假基因位點，由Ptrc啟動子控制，構(gòu)建了菌株INO1-3和INO1-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，INO1-4肌苷產(chǎn)量為308.3 mg/L，相比INO1-2提升98.6%；INO1-3肌苷產(chǎn)量為189.5 mg/L，相比INO1-2提升22.1%。結(jié)果表明，兩種PurF突變體的過表達均使肌苷產(chǎn)量得以提升，但突變體PurFbsuD293V,K316Q,S400W的效果更好，可顯著增強肌苷合成途徑通量，提升肌苷的產(chǎn)量。

圖2 增強肌苷合成途徑對肌苷發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of enhancing the expression of inosine synthesis pathway on inosine fermentation注：*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.2 腺苷合成支路的弱化

IMP到肌苷的分支途徑是肌苷合成途徑的重要組成部分，然而，IMP還存在另外兩條分支途徑，分別由腺苷酸合成酶(adenylosuccinate synthetase，PurA)和IMP脫氫酶(IMP dehydrogenase，GuaB)參與催化，向腺苷和鳥苷代謝。研究者對IMP分支代謝通量進行分析，發(fā)現(xiàn)流向腺苷支路的碳代謝流遠超流向肌苷和鳥苷支路的碳代謝流[3]，是限制肌苷合成的重要因素。因此，為提升肌苷支路代謝通量，同時探究阻斷腺苷或鳥苷支路對菌體生長和生產(chǎn)的影響，本研究在INO1-4中分別單敲除與雙敲除了purA和guaB基因，依次構(gòu)建了菌株INO2-1、INO2-2和INO2-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，INO2-1、INO2-2和INO2-3的OD600值均下降至4.0左右，肌苷產(chǎn)量分別下降至75.2、33.7、98.1 mg/L。這表明腺苷和鳥苷支路的阻斷使細胞所需能量或營養(yǎng)物質(zhì)合成受限，進而嚴重影響到菌體生長與生產(chǎn)。在培養(yǎng)基中添加0.3 g/L腺嘌呤和0.3 g/L鳥嘌呤后，3個菌株的OD600值和肌苷產(chǎn)量均顯著提升。其中INO2-1的肌苷產(chǎn)量為1 180.9 mg/L，OD600值為25.1；INO2-2肌苷產(chǎn)量為445.4 mg/L，OD600值為31.2；INO2-3的肌苷產(chǎn)量為778.8 mg/L，OD600值為17.7。這表明阻斷腺苷或鳥苷支路均可促進肌苷積累，但腺苷支路的阻斷對肌苷產(chǎn)量的提升效果更加明顯；同時阻斷兩條支路代謝會使菌體內(nèi)代謝嚴重失衡，即使在添加缺陷物質(zhì)的條件下仍影響菌體生長。另外，腺苷支路的阻斷使AMP從頭合成受阻，減弱了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶所受反饋抑制，是肌苷產(chǎn)量提升的另一原因。

圖3 阻斷競爭代謝途徑對菌體生長和肌苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of blocking competing metabolic pathways on growth and inosine fermentation

阻斷腺苷支路雖可顯著提升肌苷產(chǎn)量，但會嚴重影響菌株生長。為平衡菌株生長和產(chǎn)物合成，適當弱化而非直接阻斷腺苷支路是更加理性的選擇。研究表明，將枯草芽孢桿菌來源的PurA中第242位的脯氨酸替換為天冬酰胺，可降低53.7%的酶活力[5]。于是，本研究將INO1-4的purA基因替換為purAbsuP242N突變基因，構(gòu)建了菌株INO2-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，在無腺嘌呤添加的條件下，INO2-4的肌苷產(chǎn)量為810.2 mg/L，是INO2-1的10.8倍；OD600值為21.4，是INO2-1的5.4倍。在添加腺嘌呤的條件下，INO2-4的肌苷產(chǎn)量達到1 412.5 mg/L，相比INO2-1提升了19.6%；OD600值為30.3，相比INO2-1提升了20.7%。結(jié)果表明，突變體PurAbsuP242N的替換既可維持菌株一定的生長水平，又能保證足夠的肌苷支路通量，進而使肌苷產(chǎn)量和菌體OD600值均顯著提升。另外，添加腺嘌呤可使產(chǎn)量和生長提升至更高的水平。

圖4 弱化腺苷合成支路對菌體生長和肌苷發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of weakening Adenosine synthesis branch on growth and inosine fermentation

2.3 增強前體物PRPP的供應

增強前體物的供應有利于將代謝流持續(xù)導入目標產(chǎn)物合成途徑，促進產(chǎn)物的積累。PRPP是嘌呤合成的重要前體物，其合成酶編碼基因prs的表達受到嘌呤阻遏物(DNA-binding transcriptional repressor，PurR)的反饋阻遏[12]，同時Prs的催化活性受到腺苷二磷酸(adenosine-5′-diphosphate，ADP)和鳥苷二磷酸(guanosine-5′-diphosphate，GDP)的反饋抑制[10]。為解除反饋調(diào)控，本研究首先敲除了INO2-4的purR基因，構(gòu)建了菌株INO3-1。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，INO3-1的肌苷產(chǎn)量為1.6 g/L，與INO2-4相比提升了14.3%，OD600值沒有明顯變化。據(jù)報道，在大腸桿菌的Prs中引入D128A位點突變[2]和在解淀粉芽孢桿菌的Prs中引入N120S和L135I位點突變[13]，均可解除PRPP合酶所受反饋抑制。因此，本研究在INO3-1中的gapC位點分別整合了prsecoD128A與prsbazN120S,L135I突變基因，由Ptrc啟動子控制，構(gòu)建了菌株INO3-2和INO3-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，INO3-2的肌苷產(chǎn)量達到3.1 g/L，與INO3-1相比提升了93.8%，而INO3-3的肌苷產(chǎn)量沒有提升。這表明突變體PrsecoD128A的過表達有效增強了PRPP的供應，進而提升了肌苷的產(chǎn)量。

2.4 肌苷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的改造

產(chǎn)物在胞內(nèi)積累過多會給細胞帶來代謝負擔，也會引起產(chǎn)物介導的反饋抑制，需要及時排到胞外。為促進肌苷外排，本研究在INO3-2的yjiT位點整合了大腸桿菌來源的nepI基因[14]和解淀粉芽孢桿菌來源的pbuE基因[15]，由Ptrc啟動子控制，構(gòu)建了菌株INO4-1和INO4-2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，INO4-2的肌苷產(chǎn)量為3.9 g/L，相比INO3-2提升了25.8%；OD600值為35.2，相比INO3-2提升了16.7%；INO4-1的肌苷產(chǎn)量和OD600值均無明顯提升。這表明異源轉(zhuǎn)運蛋白的引入有效提升了菌體對肌苷的外排能力，同時緩解細胞內(nèi)代謝負擔，促進了菌體生長。為進一步提升肌苷產(chǎn)量，本研究在INO4-2的ilvG及ylbE位點分別整合了pbuE基因的雙拷貝及三拷貝，由Ptrc啟動子控制，構(gòu)建了菌株INO4-3與INO4-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，INO4-3的肌苷產(chǎn)量為4.5 g/L，相比INO4-2提升了15.4%；INO4-4的肌苷產(chǎn)量沒有提升。這表明兩個拷貝的pbuE基因已最大化菌體對肌苷的外排能力。另外，nupC[16]、nupG[16]、ydhC[17]和xapB[16]基因也編碼肌苷轉(zhuǎn)運蛋白，可將肌苷從胞外攝取到胞內(nèi)。于是本研究分別敲除了INO4-3的nupC、nupG、ydhC和xapB基因，構(gòu)建了菌株INO4-5、INO4-6、INO4-7與INO4-8。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，INO4-5的肌苷產(chǎn)量為5.0 g/L，與INO4-3相比提升了11.1%，其余菌株的肌苷產(chǎn)量均沒有提升。這表明nupC基因所編碼的轉(zhuǎn)運蛋白是參與肌苷攝取的主要透性酶，敲除該基因可減弱菌體對肌苷的吸收。

圖5 增強PRPP供應對肌苷發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of enhancing the supply of PRPP on inosine fermentation

2.5 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵測試

為測試菌株INO4-5的發(fā)酵性能，本研究5 L發(fā)酵罐中進行了分批補料發(fā)酵。當葡萄糖質(zhì)量濃度低于2 g/L時，開始流加800 g/L的葡萄糖。發(fā)酵結(jié)果如圖7所示，菌株在發(fā)酵初期生長緩慢，20 h后OD600值達到最高并進入穩(wěn)定期。0～12 h，肌苷合成速率較慢；12～32 h，肌苷保持了較高的合成速率。48 h 時肌苷的最終產(chǎn)量為20.2 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.12 g/g葡萄糖，生產(chǎn)強度為0.42 g/(L·h)。

圖6 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)改造對肌苷發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of transport system modification on inosine fermentation

圖7 工程菌INO4-5的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fermentation results of the engineered strain INO4-5 in a 5 L bioreactor

3 討論

近年來，隨著抗病毒和抗腫瘤藥物需求量的增加，嘌呤核苷及其衍生物受到廣泛關(guān)注。然而，由于代謝途徑冗長、代謝調(diào)控復雜以及多種前體物需求，肌苷合成十分困難。芽孢桿菌因具有較強的PPP途徑和嘌呤合成途徑通量，以及較弱的核苷磷酸化酶活力，是肌苷生產(chǎn)菌株選育中常見的底盤菌株。相比芽孢桿菌，大腸桿菌基因操作高效、發(fā)酵控制簡便、生產(chǎn)周期較短，是發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷另一個優(yōu)良的宿主。于是，本研究將Ptrc啟動子控制下的芽孢桿菌嘌呤操縱子引入大腸桿菌，不僅繞過了PurR介導的反饋阻遏機制、鳥嘌呤介導的轉(zhuǎn)錄衰減機制[18]，而且通過借助異源優(yōu)勢，提高了嘌呤從頭合成酶系的表達水平。隨著各模塊的優(yōu)化組合，肌苷產(chǎn)量持續(xù)提高，進一步體現(xiàn)了引入芽孢桿菌嘌呤操縱子的重要作用。

腺苷和鳥苷支路對碳代謝流的分流也是肌苷合成的重要限制因素。本研究對比了阻斷這兩條支路對肌苷產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)腺苷支路的阻斷對肌苷產(chǎn)量提升效果更加明顯，但會導致菌體營養(yǎng)缺陷。為平衡菌體生長和產(chǎn)物合成，本研究嘗試了兩種方式來改造腺苷支路。一方面是靜態(tài)弱化。本研究通過將自身PurA替換為低酶活力的PurAbsuP242N突變體的方式來弱化腺苷支路，相比于直接阻斷的方式，菌體生長水平和肌苷產(chǎn)量均大幅提升。為進一步提升菌株發(fā)酵性能，本研究嘗試拷貝了第二個purAbsuP242N基因。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，菌體OD600值達到70，而肌苷產(chǎn)量大幅降低，表明二拷貝purAbsuP242N基因使腺苷支路分流過強，不利于肌苷合成。后期應嘗試其他表達強度，或開發(fā)新的活性位點突變，使PurA的表達更加均衡，同步提升菌體生長水平和肌苷產(chǎn)量。另一方面是動態(tài)調(diào)控。本研究選擇引入群體感應系統(tǒng)[19]，通過響應菌體密度來動態(tài)調(diào)控purA基因的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)酵結(jié)果顯示，在生長初期，菌體OD600值相比對照菌株INO1-4偏低；12 h后，菌體OD600值與對照菌株INO1-4幾乎保持一致；24 h搖瓶發(fā)酵后，肌苷產(chǎn)量僅為0.3 g/L。推測purA基因轉(zhuǎn)錄停止后，胞內(nèi)已表達的PurA持續(xù)催化腺苷支路，導致肌苷支路通量不足。后期應嘗試在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基礎上，結(jié)合蛋白水平的調(diào)節(jié)，如引入TEVp[20]、SsrA[21]等元件適時降解PurA，使動態(tài)調(diào)控更加嚴謹和高效，真正實現(xiàn)“生長模式”到“生產(chǎn)模式”的自動切換。

PRPP是嘌呤從頭合成過程中的重要前體物。本研究通過敲除purR基因、過表達prsecoD128A基因，增強了PRPP的供應，顯著提升了肌苷的產(chǎn)量。由于PRPP的前體物5-磷酸核糖經(jīng)PPP途徑生成，為持續(xù)提升菌株發(fā)酵性能，需對PPP途徑進行改造。為此，本研究過表達了PPP途徑的關(guān)鍵酶編碼基因gnd和zwf，發(fā)酵結(jié)果顯示，肌苷的產(chǎn)量并沒有提高，而菌體OD600值略有下降。我們推測PPP途徑的強化，使胞內(nèi)還原力NADPH水平提升，反饋抑制了關(guān)鍵酶6-磷酸葡糖酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的酶活力，進而限制了PPP碳通量的增強；胞內(nèi)NADPH/NADP+的比例失衡，可能是影響菌體生長的原因。因此，開發(fā)解除反饋抑制的關(guān)鍵酶活性位點突變，同時增強NADPH的代謝以平衡細胞內(nèi)氧化還原水平，是進一步提升肌苷產(chǎn)量的潛在策略。此外，減弱競爭途徑也是提升PPP途徑通量的關(guān)鍵考慮。糖酵解途徑(embden-meyerhof-parnas，EMP)是PPP的主要競爭途徑。WU等[22]通過敲除pgi基因來完全阻斷EMP途徑，經(jīng)52 h發(fā)酵，組氨酸產(chǎn)量與對照菌株相同，而菌體OD600值大幅下降，糖耗也顯著降低。這表明通過減弱EMP途徑來增強PPP途徑通量的方式，可顯著提升以PRPP為前體物的產(chǎn)物的糖酸轉(zhuǎn)化率。但對于EMP途徑與PPP途徑通量的再分配，應側(cè)重于更加溫和可控方式，如通過起始密碼子替換或動態(tài)調(diào)控等方式來減弱EMP途徑，才能達到同步提升產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的目的。同樣地，減弱2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸途徑[23]與PPP途徑的非氧化分支[24]，也有助于降低碳代謝流損失，促使更多碳代謝流流向肌苷合成途徑，提升肌苷的產(chǎn)量。