致病性大腸桿菌非編碼小RNA（sRNAs）的研究進(jìn)展

楊 延，毛 曌，李干武，江豐偉

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

細(xì)菌非編碼小RNA（Small non-coding RNAs，sRNAs）是一類長度介于40 nt～500 nt 不編碼蛋白質(zhì)的RNA 分子，其半衰期短，常作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物。sRNAs 多由一段多變的靶標(biāo)結(jié)合序列、保守序列和不依賴于Rho 因子的轉(zhuǎn)錄終止序列等3 部分組成[1]，其形成的二級結(jié)構(gòu)多存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)顯著提高了sRNAs 的穩(wěn)定性[2]。sRNAs 與靶基因的配對方式多樣，根據(jù)配對方式的不同，可以將細(xì)菌sRNAs 分為順式編碼的sRNAs（Cis-encoded sRNAs）和反式編碼的sRNAs（Trans-encoded sRNAs）。順式編碼的sRNAs 存在于質(zhì)粒、染色體、轉(zhuǎn)座子等多種位置，由調(diào)控靶基因的反義鏈編碼而來，能與靶基因的mRNA 完全互補(bǔ)配對。反式編碼的sRNAs 是由與編碼靶標(biāo)mRNA 的基因完全不同的基因組位置轉(zhuǎn)錄而來，這些sRNAs 與靶標(biāo)mRNAs 的互補(bǔ)性較小且多依賴Hfq、ProQ、CsrA 等RNA 伴侶蛋白來維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能的發(fā)揮[3]。作為細(xì)菌眾多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要分支，sRNAs 通過直接或間接的作用方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而對外界環(huán)境刺激做出迅速的反應(yīng)。由于sRNAs 在調(diào)控基因表達(dá)方面存在耗能低、反應(yīng)快等優(yōu)勢，因此針對sRNAs 及其生物學(xué)功能的研究一直是近年來的研究重點(diǎn)。

1984年，Mizuno等首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）中存在一個174 nt 的sRNAmicF，可以在環(huán)境脅迫條件下通過RNA/RNA 堿基配對的方式抑制外膜孔蛋白OmpF 的翻譯[4]。但是，大腸桿菌sRNAs 的研究受制于傳統(tǒng)的序列分析及實(shí)驗(yàn)技術(shù)因而進(jìn)展緩慢，在近30 年的時間里僅發(fā)現(xiàn)了4 種sRNAs[5]。21 世紀(jì)以后，隨著對sRNAs 結(jié)構(gòu)及靶標(biāo)序列特征的深入研究，研究者開發(fā)了許多高精度識別sRNAs 的生物信息學(xué)分析程序，比如SIPHT 和NAPP等[6]。2001 年Liron 等首次在大腸桿菌全基因組水平篩選并驗(yàn)證了14 個新型sRNAs[7]，生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動了sRNAs的不斷發(fā)現(xiàn)。這些生物信息學(xué)算法及后續(xù)的熒光定量PCR（RT-qPCR）和Northern blot 等能夠準(zhǔn)確反映生物體內(nèi)sRNAs 的實(shí)際表達(dá)情況，使得sRNAs的發(fā)現(xiàn)迅速加快。截止目前，在sRNAmap數(shù)據(jù)庫已記載了數(shù)百種sRNAs，其中以大腸桿菌和沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)的最多。因此，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證sRNAs 的存在已經(jīng)不能阻礙sRNAs 的研究，有關(guān)sRNAs 的研究更傾向于對sRNAs 生物學(xué)功能的探究、靶基因的鑒定、sRNAs調(diào)控靶基因的分子作用機(jī)制以及sRNAs 的應(yīng)用前景等方面。

近年來隨著多組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，sRNAs 在調(diào)控致病性大腸桿菌毒力基因表達(dá)中發(fā)揮的重要作用也得到了探究，同時也發(fā)現(xiàn)了許多新的作用機(jī)制。本文主要對致病性大腸桿菌sRNAs 的生物學(xué)功能、sRNAs 靶基因的篩選、sRNAs 對靶基因調(diào)控的分子作用機(jī)制等方面進(jìn)行系統(tǒng)的闡述，旨在明確sRNAs在大腸桿菌致病過程中發(fā)揮的作用，為研究致病性大腸桿菌sRNAs 在調(diào)控毒力基因表達(dá)方面提供新視野，為防控該類疫病提供理論基礎(chǔ)。

1 靶基因確定

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者在全基因組水平高精度預(yù)測并證實(shí)了數(shù)百種sRNAs。但有關(guān)sRNAs 靶基因的研究仍相對較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上sRNAs的發(fā)現(xiàn)速度，因此極大地限制了sRNAs作用機(jī)制的研究。究其原因，一方面是因?yàn)閟RNAs 與mRNAs 發(fā)生有限的堿基互補(bǔ)配對且不存在雜交熱點(diǎn)區(qū)域；另一方面是因?yàn)樵诓煌h(huán)境刺激下，同一種sRNA 往往靶向不同的mRNAs，增加了靶基因?qū)ふ业碾y度。為了能夠更好的從分子水平解析sRNAs的作用機(jī)制，靶基因的尋找是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵。目前對于靶基因的尋找方法，主要?dú)w結(jié)為以下4 類：

1.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因sRNAs 靶基因的篩選可以通過生物信息學(xué)的方法進(jìn)行預(yù)測，常用的生物信息學(xué)軟件包括TargetRNA 2[8]和CopraRNA[9]等。TargetRNA 2 可在線預(yù)測細(xì)菌sRNAs 調(diào)控的mRNAs 靶標(biāo)及其結(jié)合位點(diǎn)。該預(yù)測軟件根據(jù)細(xì)菌sRNAs 的保守性、sRNAs 的二級結(jié)構(gòu)、候選靶基因的二級結(jié)構(gòu)以及sRNAs 與每個候選靶標(biāo)之間的雜交能量，對可能的調(diào)控靶標(biāo)進(jìn)行篩選，進(jìn)而快速、準(zhǔn)確地識別sRNAs 的作用靶標(biāo)[10]。但由于其數(shù)據(jù)庫內(nèi)參考菌株較少，對于非參考菌株sRNAs 靶基因的篩選存在不確定性。CopraRNA 是一種將系統(tǒng)發(fā)育信息整合到基因組水平上進(jìn)而預(yù)測sRNAs 靶標(biāo)的比較預(yù)測算法。該算法根據(jù)不同生物體中同源靶標(biāo)的保守性，通過功能富集分析和網(wǎng)絡(luò)分析后重建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而精準(zhǔn)識別sRNAs 的靶基因。分析表明，CopraRNA 可以極大改善靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測水平，與Target-RNA 2 相比假陽性率顯著降低，且該方法適用于非參考細(xì)菌sRNAs 靶基因的識別[11]。

盡管這些生物信息學(xué)預(yù)測的方法可以有效地篩選候選靶標(biāo)，極大地降低尋找靶標(biāo)的盲目性。但是由于這些預(yù)測方法多是基于堿基配對的基本原則，針對mRNA 中的堿基位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，忽視了sRNAs可以通過與蛋白直接互作的方式調(diào)控靶基因。因此，該方法在預(yù)測sRNAs 的靶標(biāo)方面具有一定的局限性。另一方面，生物信息學(xué)方法預(yù)測的結(jié)合靶標(biāo)是否真實(shí)可靠，經(jīng)軟件預(yù)測的互作又是否在細(xì)菌體內(nèi)真實(shí)發(fā)生，這些情況均需要在生物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。為此，研究者開發(fā)了一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)用以篩選sRNAs 的靶標(biāo)。

1.2 通過Hfq 蛋白篩選sRNAs 調(diào)控的靶基因大腸桿菌中約40%的已知sRNAs 需要通過分子伴侶蛋白Hfq 的橋梁作用與靶基因相互作用。Hfq 通過與細(xì)菌sRNAs 的富含AU 的單鏈區(qū)緊密結(jié)合，對sRNAs 產(chǎn)生很強(qiáng)的保護(hù)作用，顯著促進(jìn)了sRNAs 的穩(wěn)定性，同時Hfq 還能與sRNA 的靶標(biāo)mRNA 結(jié)合，促進(jìn)sRNA與其靶標(biāo)mRNA 的相互作用[12]。因此，根據(jù)免疫共沉淀（Co-IP）的原理，通過在hfq基因C-端添加FLAG 標(biāo)簽的方式構(gòu)建3×FLAG-hfq標(biāo)簽菌株，F(xiàn)LAG標(biāo)簽?zāi)芘c吸附在親和介質(zhì)上的FLAG 抗體相互作用，從而將與Hfq 特異性互作的RNA 沉淀下來，再通過轉(zhuǎn)錄組測序的技術(shù)對洗脫并純化的mRNA/sRNA 測序，完成對分子伴侶Hfq 蛋白參與下的sRNAs 靶向位點(diǎn)的篩選[13]。但是，由于Co-IP 本身存在非特異性結(jié)合的缺點(diǎn)，常導(dǎo)致后期的篩選困難；而且由于這類依賴Hfq 輔助的sRNAs 通常利用反式編碼的方式與靶基因形成不完全互補(bǔ)的堿基配對，忽視了那些與sRNA 形成順式編碼互作的靶基因，因此該方法在進(jìn)行sRNAs 靶標(biāo)篩選時存在一定的局限性。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序篩選靶基因轉(zhuǎn)錄組測序篩選靶基因，是通過比較野生株、sRNAs 缺失株以及sRNAs過表達(dá)菌株中差異表達(dá)的基因進(jìn)而篩選靶基因的方法。該方法將目標(biāo)sRNAs 克隆在異源質(zhì)粒PBAD的啟動子之后，通過阿拉伯糖對sRNAs 進(jìn)行短時間（10 min～15 min）誘導(dǎo)，誘導(dǎo)生成的sRNAs 能夠直接靶向mRNAs，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較sRNAs過表達(dá)菌株和野生株之間差異表達(dá)的基因。該方法能夠避免長時間誘導(dǎo)sRNAs 所導(dǎo)致的間接調(diào)控效應(yīng)[14]，同時可以結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測的方法，顯著縮小候選靶標(biāo)的篩選范圍。

通過這種方式，Choi 等將sRNAsdsR克隆至質(zhì)粒pHM4T 中構(gòu)建了重組質(zhì)粒psdsR，在利用阿拉伯糖誘導(dǎo)sRNAsdsR短時間過表達(dá)后，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出sRNAsdsR過表達(dá)菌株與野生株中存在2 倍以上表達(dá)差異的209 種mRNAs。最后，結(jié)合CopraRNA軟件及構(gòu)建人工sRNAs 的方法，篩選并驗(yàn)證了sRNAsdsR在大腸桿菌MG1655 生長穩(wěn)定期調(diào)控的靶基因—yhcB[12]。

1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與sRNAs 直接相互作用的靶基因蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)一般用于分析sRNAs 在整體層面上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平的變化，該方法有助于識別出翻譯水平上受sRNAs 調(diào)控的靶分子，以及在轉(zhuǎn)錄組分析過程中被忽視的靶分子。該方法通過iTRAQ 和LC-MS 技術(shù)尋找那些在sRNAs 缺失株和野生株中顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而根據(jù)差異表達(dá)蛋白的特性篩選出sRNAs 的靶向位點(diǎn)。在大腸桿菌HMS174 sRNAS-20的研究中，研究者利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過比較野生株和誘導(dǎo)sRNAS-20表達(dá)菌株在對數(shù)生長期差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了存在明顯差異表達(dá)的蛋白TrpB和GlyRS，這兩種蛋白質(zhì)分別調(diào)控氨基酸合成和甘氨酰-tRNA 的合成。在此基礎(chǔ)上研究者通過體外翻譯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了sRNAS-20對trpB、glyRS基因表達(dá)具有直接調(diào)控的作用，從而證實(shí)了S-20通過對這些靶基因的調(diào)控進(jìn)而介導(dǎo)對大腸桿菌的生長抑制[15]。

此外，核糖體圖譜（Ribo-seq）[16]、差異性RNAseq（dRNA-seq）[17]、通過連接和測序進(jìn)行sRNA 靶標(biāo)識別（GRIL-Seq）[18]等技術(shù)也先后應(yīng)用于sRNAs 靶基因的預(yù)測，這些方法顯著地提高了sRNA 靶基因的尋找速度，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2 作用機(jī)制

原核生物由于自身結(jié)構(gòu)的特異性，其基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)在一起的。因此前期的研究認(rèn)為在原核生物中，轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控相對于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控更加高效，是原核生物基因表達(dá)的主導(dǎo)調(diào)控方式。但隨著對基因表達(dá)調(diào)控方面研究的深入，發(fā)現(xiàn)原核生物也存在許多與真核生物類似的microRNA調(diào)控、蛋白質(zhì)調(diào)控等轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控現(xiàn)象。這些調(diào)控方式通過解除轉(zhuǎn)錄和翻譯的偶聯(lián)來微調(diào)基因表達(dá)，在基因表達(dá)調(diào)控中同樣發(fā)揮著不可替代的作用，也因此成為近年來的研究熱點(diǎn)。相對于蛋白質(zhì)介導(dǎo)的翻譯水平的調(diào)控，sRNAs 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具有生成速度快、耗能低、易降解等特點(diǎn)，在細(xì)菌應(yīng)對外界環(huán)境壓力時表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，因此引起研究者的廣泛關(guān)注。有研究表明，sRNAs 不僅可以通過與其靶標(biāo)之間的相互作用直接促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)，還可以作為誘餌與RNA 結(jié)合或與蛋白結(jié)合，間接調(diào)控基因的表達(dá)[19]。目前，原核生物sRNAs的作用機(jī)制可按照其調(diào)控靶基因的方式分為直接調(diào)控、間接調(diào)控以及構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控等。

2.1 直接調(diào)控

2.1.1 sRNAs 與mRNAs 通過堿基互補(bǔ)形式發(fā)揮直接調(diào)控作用 隨著生物信息學(xué)預(yù)測軟件的發(fā)展更新，使得高精度識別sRNAs 的靶標(biāo)mRNAs 并尋找mRNA中的堿基互補(bǔ)位點(diǎn)得以實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌sRNAs 與mRNAs通過互補(bǔ)配對的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)已成為現(xiàn)階段研究最為廣泛的sRNAs 介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。sRNAs與mRNAs 的堿基互補(bǔ)區(qū)域也從單一的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome binding site，RBS）擴(kuò)展到5'非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）、3'UTR 等一至多個區(qū)域。在大腸桿菌MG1655 中，順式編碼的sRNAryeA的堿基序列能夠與sdsR-pphA雙順反子5'UTR 完全堿基互補(bǔ)，抑制sRNAsdsR和PphA 蛋白的表達(dá)，影響磷酸酶的產(chǎn)生[20]。另外，反式編碼的sRNAgadY通過與mRNAgadX的3'UTR 進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，進(jìn)而抑制RNase 對gadX基因的降解，促進(jìn)GadX 的表達(dá)，使得大腸桿菌可以抵御外界的酸性環(huán)境[21]。

2.1.2 sRNAs 與蛋白質(zhì)相互作用 sRNAs 除了通過與靶基因mRNA 直接進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對發(fā)揮作用以外，還可以通過直接結(jié)合靶蛋白發(fā)揮作用。相對于sRNAs 與mRNAs 的互作方式，sRNAs 與蛋白質(zhì)的直接互作由于缺乏相應(yīng)的生物信息學(xué)預(yù)測方法，導(dǎo)致有關(guān)sRNAs 與蛋白直接互作的研究相對較少且進(jìn)展緩慢，但已有的研究表明這種調(diào)控方式在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境刺激方面發(fā)揮著重要的作用。例如，在大腸桿菌中，CsrA 作為一種具有全局性調(diào)控作用的RNA 結(jié)合蛋白，可以結(jié)合多種靶mRNAs 的5'UTR GGA 基序，進(jìn)而影響靶mRNAs 的穩(wěn)定和（或）翻譯。而sRNAcsrB能夠在細(xì)菌生長對數(shù)期或營養(yǎng)缺陷的情況下被誘導(dǎo)表達(dá)，直接與CsrA 蛋白的多個亞基結(jié)合，從而遮蓋了CsrA 的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致CsrA 活性降低進(jìn)而影響細(xì)菌的核心碳通量[22]、生物被膜（Bacterial biofilms，BF）[23]、運(yùn)動性[24]等多種生物表型。

2.2 間接調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，sRNAs 除了通過與靶位點(diǎn)直接結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用外，還可以利用sRNAs間的相互作用，消除阻遏物sRNAs，進(jìn)而激活其靶mRNAs 的翻譯，間接調(diào)控基因表達(dá)。這類sRNAs，通過與具有潛在沉默子功能的特定sRNAs 堿基互補(bǔ)配對，阻礙特定sRNAs 發(fā)揮沉默基因的功能，減輕阻遏物sRNAs 對靶mRNAs 的抑制作用進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。例如，大腸桿菌中編碼谷氨酸/天冬氨酸ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的gltIJKL 操縱子，能夠在gltI-gltJ的順反子間隔產(chǎn)生一個不依賴Rho 的RNA，該RNA 在RNase E 的參與下產(chǎn)生一個長160 nt 的sRNAsroC[25]。sRNAsroC可以通過堿基互補(bǔ)配對的方式與抑制gltIJKL 操縱子活性的sRNAgcvB相互作用，進(jìn)而解除了受sRNAgcvB抑制的整簇基因的表達(dá)[26]。Choi 等人2018 年在大腸桿菌首次發(fā)現(xiàn)一種新型的毒素-抗毒素（T/A）系統(tǒng)，其毒素SdsR 和抗毒素RyeA 均為sRNAs，且由同一基因非編碼間區(qū)的DNA不同鏈編碼而來。毒素SdsR可抑制編碼內(nèi)膜蛋白的基因—yhcB的表達(dá)，引起細(xì)胞絲化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，抗毒素RyeA 可以通過與sRNA SdsR 形成完全堿基互補(bǔ)配對的sRNAsRNA 二聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)而抑制sRNA SdsR 殺菌功能的發(fā)揮，從而保證大腸桿菌的正常生存[20]。

2.3 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的適應(yīng)性調(diào)控不僅可以通過單個sRNA 直接影響單個或多個基因的表達(dá)，而且還存在多個sRNAs 共同作用調(diào)控細(xì)菌適應(yīng)性的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。其中研究較為清楚的有兩種：（1）sRNAs 分級調(diào)控系統(tǒng)，即第一個sRNA 結(jié)合并充分重排其靶標(biāo)，從而為第二個sRNA 提供結(jié)合位點(diǎn)。這種調(diào)控級聯(lián)中，兩個或多個不同sRNAs 與它們的靶標(biāo)之間發(fā)生順序相互作用從而調(diào)控基因表達(dá)的方式稱為分級調(diào)控[27]。例如，在大腸桿菌中sRNAglmY和sRNAglmZ組合形成調(diào)節(jié)級聯(lián)，依次調(diào)控mRNAglmS的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)編碼氨基糖代謝中的一種必需酶—氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS 的合成[28]。（2）多種sRNAs 分別調(diào)控同一基因表達(dá)。在大腸桿菌中，sRNAomrA、oxyS和arcZ均可以抑制編碼大腸桿菌鞭毛合成的fhlDC操縱子的表達(dá)且不存在功能冗余[29]。

3 生物學(xué)功能

sRNAs 作為細(xì)菌響應(yīng)外界環(huán)境變化的一種適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制，對細(xì)菌的生長、增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用。在致病性大腸桿菌中，它們的主要功能表現(xiàn)在調(diào)控毒力基因的表達(dá)、參與BF 形成、參與環(huán)境應(yīng)答調(diào)控等多個方面。

3.1 調(diào)控毒力基因的表達(dá)致病性大腸桿菌在侵入機(jī)體后，為應(yīng)對宿主的殺傷機(jī)制，會產(chǎn)生sRNAs 以迅速調(diào)控毒力基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)菌的粘附和侵襲，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)菌對宿主的適應(yīng)能力。近年來，有關(guān)腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenicE. coli，ExPEC）sRNA 的報道逐漸增多，sRNA 在調(diào)控大腸桿菌毒力基因表達(dá)方面的作用也越發(fā)明顯。在腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE. coli，EHEC）O157:H7 菌株中，腸細(xì)胞抹除位點(diǎn)（Locus of enterocyte effacement，LEE）致病基因島和志賀氏毒素作為研究最為深入的毒力因子，其表達(dá)情況受到多水平的調(diào)控，sRNAs 在其中也起著不可或缺的作用。例如，sRNAdicF可以感知宿主結(jié)腸內(nèi)的低氧環(huán)境進(jìn)而通過結(jié)合于mRNApchA的核心編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）以促進(jìn)mRNApchA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)LEE 致病基因島的表達(dá)，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的脫落病變，引起血性腹瀉和溶血性尿毒癥綜合征的暴發(fā)[30]。此外，Wang 等發(fā)現(xiàn)sRNAcsrB/C也可以通過調(diào)控csrA基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)LEE 致病島上ler（LEE 基因的主要調(diào)控子）、escT（LEE1 編碼基因）、escC（LEE2 編碼基因）等基因的表達(dá)[31]。Brandon等發(fā)現(xiàn)，編碼志賀氏毒素的stx1A基因上游存在一個長為74 nt 的sRNA—stxS，該sRNA 可以在Hfq 蛋白的參與下，直接結(jié)合于志賀氏毒素基因stx1B的核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)而抑制志賀氏毒素在細(xì)菌溶源期的表達(dá)[32]。

近期的研究發(fā)現(xiàn)sRNAs 在調(diào)控尿路致病性大腸桿菌（UropathogenicE. coli，UPEC）致病過程中也發(fā)揮著重要作用。Porcheron 等在2014 年首次發(fā)現(xiàn)UPEC CFT073 菌株中的sRNAryhB，對于UPEC 在膀胱中的持久性定植起到關(guān)鍵作用。在小鼠感染模型中，sRNAryhB通過調(diào)節(jié)產(chǎn)氣菌素相關(guān)mRNAiucD的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控鐵載體總量的表達(dá)，最終使得UPEC在宿主泌尿道內(nèi)定植[33]。Khandige 等在研究中發(fā)現(xiàn)，UTI89 在侵染膀胱上皮細(xì)胞PD07i 后，促使sRNApapR在菌體內(nèi)富集，該sRNA 在Hfq 的參與下與靶基因papI進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對進(jìn)而調(diào)控P 菌毛的表達(dá)，從而促進(jìn)UPEC 在膀胱上皮的黏附和侵襲[34]。

新生兒腦膜炎大腸桿菌（Neonatal meningitisE.coli，NMEC）作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的ExPEC，可造成新生兒出現(xiàn)腦膜炎癥狀，具有極高的致死率，其毒力基因的表達(dá)也受到sRNA 的調(diào)控。孫浩等在研究中發(fā)現(xiàn)NMEC RS218 在yfdP-orf基因間區(qū)存在一個新型的sRNA—sRNA17。該sRNA 在氧氣感應(yīng)調(diào)節(jié)因子ArcAB 的調(diào)控下，通過感知血液內(nèi)的微氧條件進(jìn)而下調(diào)自身的表達(dá)，從而促進(jìn)glnP基因的表達(dá)，導(dǎo)致NMEC 在血液中的存活能力增強(qiáng)并有利于其穿越血腦屏障[35]。

3.2 參與BF 的形成細(xì)菌BF 是由細(xì)菌分泌到細(xì)胞外的多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和生物表面活性劑等成分聚合形成的膜狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)可以直接影響細(xì)菌的一系列生理行為，包括生物發(fā)光、毒力因子的表達(dá)、對抗生素的抗性以及浮游和固著生活方式之間的轉(zhuǎn)變[36]。研究表明，BF 的形成受到多個水平的調(diào)控，sRNA 所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控在其中也發(fā)揮著不可替代的作用。在大腸桿菌中，許多sRNAs（omrA、omrB、mcaS、rprA、gcvB、rydC和rybB）都可以將信號傳送到遺傳網(wǎng)絡(luò)中形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以非冗余的形式調(diào)控csgD基因的表達(dá)，csgD基因是編碼大腸桿菌胞外纖維狀蛋白的重要組成部分，可以直接影響B(tài)F 的形成。其中sRNAsomrA、omrB、rydC、rybB通過抑制核糖體的結(jié)合進(jìn)而抑制csgD的表達(dá)，而sRNAmcaS通過招募核糖核酸內(nèi)切酶裂解csgD基因5' UTR 的A/U 富集區(qū)進(jìn)而抑制其表達(dá)[37]。這些sRNAs 通過調(diào)控大腸桿菌BF 的形成，進(jìn)而增強(qiáng)其抵御外界不良環(huán)境的能力并提高其對抗生素的耐受能力，更有利于大腸桿菌在動物機(jī)體的定植并發(fā)揮致病作用。

3.3 參與環(huán)境應(yīng)答調(diào)控為了實(shí)現(xiàn)在動物體內(nèi)的定植，腸道內(nèi)致病性大腸桿菌（Intestinal pathogenicE. coli，IPEC）必須適應(yīng)機(jī)體內(nèi)不斷變化的環(huán)境壓力，比如胃腸道內(nèi)的低氧、低pH、低離子環(huán)境等，sRNAs 在其中發(fā)揮著重要的作用。Lay 等在2012 年證實(shí)sRNAsarcZ、omrA、omrB、oxyS、sdsR和gadY等可以抑制大腸桿菌的移動，而sRNAsmcaS、micA可以促進(jìn)大腸桿菌的移動，這些sRNAs 可以協(xié)同調(diào)控大腸桿菌的運(yùn)動性使菌體向適宜的生存條件移動[29]。Bak 等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌MG1655 在酸性環(huán)境下（pH5）可以誘導(dǎo)sRNAdsrA和rprA的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)轉(zhuǎn)錄活化因子RpoS 的表達(dá)，導(dǎo)致Ⅱ型酸耐受系統(tǒng)（Acid resistance 2，AR2）的活化，從而增強(qiáng)大腸桿菌對胃酸等低pH 環(huán)境的適應(yīng)能力[38]。在大腸桿菌K12株的Csr 信號通路中，sRNAcsrC和其同源類似物sRNAcsrB可以直接與CsrA 蛋白相互作用并抑制其功能的發(fā)揮，一方面可以促進(jìn)糖原的合成和分解代謝[39]、糖異生[40]和BF 形成[23]；另一方面可以抑制糖酵解運(yùn)動[41]、鞭毛合成[24]和乙酸酯代謝[40]。通過sRNA 調(diào)控生物合成代謝的過程，使細(xì)菌能夠迅速響應(yīng)外界環(huán)境的變化，進(jìn)而完成其生長和增殖等生命過程。

4 小結(jié)與展望

sRNAs 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具有合成快、半衰期短、功能多樣等特點(diǎn)，是細(xì)菌響應(yīng)外界環(huán)境變化進(jìn)而做出迅速應(yīng)答的適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制，一直是人們研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著sRNAs 篩選及其靶點(diǎn)鑒定相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展與更新，使得越來越多的sRNAs 及其作用機(jī)制被揭示。同時，sRNAs 的實(shí)際應(yīng)用價值也得到了逐步開發(fā)，最新的研究顯示，人工合成的sRNAs 已經(jīng)被用以改造大腸桿菌以提高免疫球蛋白IgG 的產(chǎn)量，該產(chǎn)物在治療自身免疫性疾病和腫瘤相關(guān)疾病方面發(fā)揮重要的作用[42]。同時，通過向工程菌導(dǎo)入質(zhì)粒介導(dǎo)的人工合成的sRNAs，極大地提高了苯酚、1, 5-戊二胺、腺苷甲硫胺酸、正丁醇、N-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）等工業(yè)用品的產(chǎn)量，并且部分改造的工程菌已經(jīng)成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)價值。但有關(guān)sRNAs 對病原菌毒力基因表達(dá)調(diào)控方面的研究還相對較少，在這方面的應(yīng)用價值仍待進(jìn)一步發(fā)掘。因此，從sRNAs角度揭示病原菌的致病機(jī)制，解析sRNAs 在毒力基因表達(dá)中所發(fā)揮的作用將是下一步的研究重心，這將為疫病的防控提供重要的理論基礎(chǔ)，為開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)提供新思路。