不同宿主來(lái)源猬迭宮絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體pcox1、pcox3和prrnS基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

賀峻琳，龔騰芳，謝馨銳，李文超，陳叔玉，李 芬，劉 偉

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

裂頭蚴?。⊿parganosis）是由迭宮屬絳蟲(chóng)裂頭蚴引起的人畜共患絳蟲(chóng)蚴病，迄今為止已報(bào)道2 000 多例病例[1]，主要集中在東亞和東南亞[2]。迭宮屬絳蟲(chóng)在人體內(nèi)一般以原尾蚴或裂頭蚴的形式存在，可導(dǎo)致皮下裂頭蚴病、內(nèi)臟裂頭蚴病、眼裂頭蚴病、腦裂頭蚴病等[1-3]。但在某些情況下，幼蟲(chóng)可能會(huì)在人體腸道內(nèi)發(fā)育成熟，而被誤認(rèn)為是闊節(jié)裂頭絳蟲(chóng)病[1]。

猬迭宮絳蟲(chóng)（Spirometra erinaceieuropaei）的分類(lèi)學(xué)地位一直有較大爭(zhēng)議，目前迭宮屬絳蟲(chóng)有64 個(gè)名義種，但只有4 個(gè)種有效[4]。雖然傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)是鑒定寄生蟲(chóng)的主要方法，但由于環(huán)境變化和宿主差異，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定寄生蟲(chóng)尤其是形態(tài)相似的蟲(chóng)株存在一定缺陷。線(xiàn)粒體DNA 具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速度快等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的鑒定和分類(lèi)[5-7]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者將線(xiàn)粒體全基因組或其cox1、cox3、nad1、nad4、nad5、cytb、rrnS 以及核糖體28S rDNA、18S rDNA、ITS 等基因用于迭宮屬絳蟲(chóng)種類(lèi)鑒定和種內(nèi)遺傳變異研究[5,8,9-11]，但國(guó)內(nèi)關(guān)于不同宿主猬迭宮絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因遺傳變異的研究較少。鑒于此，本研究對(duì)采自7種宿主體內(nèi)的猬迭宮絳蟲(chóng)或中絳期裂頭蚴線(xiàn)粒體pcox1、pcox3和prrnS基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增，通過(guò)分析不同宿主來(lái)源的pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列的同源性、多樣性及不同宿主的猬迭宮絳蟲(chóng)與其他絳蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為猬迭宮絳蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)和種群遺傳關(guān)系研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源本實(shí)驗(yàn)的7 株猬迭宮絳蟲(chóng)或中絳期裂頭蚴樣品中，3 株猬迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴樣品分別采自湖南省不同地區(qū)的黑眉錦蛇（Elaphe taeniura）、王錦蛇（Elaphe carinata）、烏梢蛇（Ptyas dhumnades）；4 株猬迭宮絳蟲(chóng)樣品分別采自湖南省長(zhǎng)沙市生態(tài)動(dòng)物園的西伯利亞虎（Panthera tigrisssp.altaica）、白化孟加拉虎（Panthera tigrisssp.tigris）、豹貓（Prionailurus bengalensis）和湖南省長(zhǎng)沙市寵物醫(yī)院的家貓小腸內(nèi)，蟲(chóng)體洗滌后置于70%乙醇于-20 ℃保存。

1.2 主要試劑組織DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白酶K 購(gòu)自Merck 公司；TaqDNA 聚合酶及相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 蟲(chóng)體DNA 的提取將7 株蟲(chóng)體分別剪成2 cm～3 cm，并用雙蒸水洗滌5 min，重復(fù)6次。將洗滌后的蟲(chóng)體置于1.5 mL 離心管中，加入20 μL 蛋白酶K 混勻，56 ℃恒溫消化1 h～3 h后提取蟲(chóng)株基因組DNA備用。

1.4 線(xiàn)粒體pcox1、pcox3 和prrnS 基因的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序按照參考文獻(xiàn)并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成3對(duì)引物用于pcox1[6]、pcox3[12]和prrnS[7]基因的擴(kuò)增。以1.3 中提取的7 株猬迭宮絳蟲(chóng)或裂頭蚴DNA 為模板，采用上述引物經(jīng)PCR 分別擴(kuò)增pcox1、pcox3 和prrnS 基因。以超純水作為陰性對(duì)照。PCR 擴(kuò) 增 條 件 為：94 ℃5 min； 94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)； 72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物回收純化后由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。

1.5 pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列及遺傳進(jìn)化分析利用DNAStar 5.0 軟件對(duì)上述PCR 產(chǎn)物測(cè)序并經(jīng)拼接后獲得pcox1、pcox3 和prrnS 基因。將獲得的猬迭宮絳蟲(chóng)上述3 種基因序列與GenBank 中其他絳蟲(chóng)相應(yīng)基因序列利用DNAStar 5.0 軟件進(jìn)行種內(nèi)及種間比較，分析基因序列的堿基組成和序列同源性。利用DnaSP V6.12 軟件計(jì)算各基因序列單倍型數(shù)（H）、核苷酸多樣性（Pi）、單倍型多樣性（Hd）和平均核苷酸差異（K）。利用Mega 7.0 軟件采用Kimura-2-parameter模型，利用鄰接法法（Neighbor-Joining，NJ 法）繪制基于上述3 種基因的猬迭宮絳蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化樹(shù)，自舉檢驗(yàn)1 000 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 pcox1、pcox3 和prrnS 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以7 株猬迭宮絳蟲(chóng)或裂頭蚴DNA 為模板PCR 擴(kuò)增獲得的pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列分別約400 bp、350 bp 和300 bp，均與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶（圖1），表明從不同宿主來(lái)源的7株猬迭宮絳蟲(chóng)或裂頭蚴中均擴(kuò)增到了各目的基因片段。

圖1 猬迭宮絳蟲(chóng)pcox1（A）、pcox3（B）和prrnS（C）基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of S.erinaceieuropaei based on pcox1(A),pcox3(B)and prrnS(C)gene

2.2 pcox1、pcox3 和prrnS 基因測(cè)序和序列分析7 株猬迭宮絳蟲(chóng)或裂頭蚴的pcox1、pcox3 和prrnS 基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接、比對(duì)、校正后，擴(kuò)增的長(zhǎng)度分別為396 bp、362 bp 和280 bp，平均A+T 堿基含量分別為62.10%、66.70%和63.60%。測(cè)序獲得的pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的基因登錄號(hào)分別為MZ774075～MZ774081、MZ783069～MZ783075、MZ783076～MZ783082。

核苷酸序列同源性分析結(jié)果顯示，7 株猬迭宮絳蟲(chóng)或裂頭蚴的線(xiàn)粒體pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列之間的堿基差異率分別為0～2.27%、0～1.10%和0～1.79%，其差異是堿基互換；與不同宿主猬迭宮絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體pcox1、pcox3 和prrnS 基因序列比較后的同源性分別為97.20%～100.00%、98.90%～100.00%和97.90%～100.00%；與其他絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體pcox1、pcox3和prrnS 基因序列同源性分別為66.70%～84.10%、51.70%～72.10%和63.80%～87.10%。上述結(jié)果表明，猬迭宮絳蟲(chóng)pcox1、pcox3和prrnS基因種間變異大于種內(nèi)變異，因此pcox1、pcox3和prrnS基因均可以作為研究不同宿主來(lái)源猬迭宮絳蟲(chóng)遺傳變異的分子標(biāo)記。

利用DnaSP軟件分析基因序列的多樣性，結(jié)果顯示7株猬迭宮絳蟲(chóng)或裂頭蚴pcox1基因的H為4，Hd和Pi分別為0.714±0.181 和0.012 51±0.002 92，K 為4.952；pcox3 基因的H 為2，Hd 和Pi 分別為0.476±0.171 和0.005 26±0.001 89，K 為1.905；prrnS 基因的H為5，Hd 和Pi 分別為0.857±0.137 和0.010 20±0.001 69，K 為2.857。Hd 和Pi 作為兩個(gè)重要指標(biāo)可以衡量一個(gè)種群的遺傳變異關(guān)系，其中Pi 具有在生物進(jìn)化中更為保守的優(yōu)點(diǎn)，是研究生物進(jìn)化的更優(yōu)指標(biāo)。在大多數(shù)動(dòng)物中Pi大于0.01就認(rèn)為變異較大[13]。本研究中pcox1和prrnS 基因Pi 均大于0.01，變異較大，其中pcox1 基因的Pi 大于prrnS 基因；且堿基差異率也是pcox1＞prrnS＞pcox3。由此推斷，pcox1基因可能更適用于猬迭宮絳蟲(chóng)的種內(nèi)遺傳多態(tài)性分析，pcox3可能更適合作為猬迭宮絳蟲(chóng)定種的分子標(biāo)記。

2.3 pcox1、pcox3 和prrnS 基因的遺傳進(jìn)化分析以日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum，NC_002544）為外群，分別基于pcox1（圖2A）、pcox3（圖2B）和prrnS（圖2C）基因構(gòu)建猬迭宮絳蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。3 個(gè)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果均顯示，7 株不同宿主來(lái)源的猬迭宮絳蟲(chóng)均可與其他猬迭宮絳蟲(chóng)聚類(lèi)在同一大分支上，但內(nèi)部存在兩個(gè)較小的分支，推測(cè)其可能分別對(duì)應(yīng)猬迭宮絳蟲(chóng)的2 個(gè)基因型（但至今并未有基因型系統(tǒng)的分類(lèi)依據(jù)）。且本研究的7株蟲(chóng)株均能與其他屬的絳蟲(chóng)如長(zhǎng)膜殼絳蟲(chóng)（Hymenolepis diminuta，NC_002767）、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus equinus，AF346403）、牛帶絳蟲(chóng)（Taenia saginata，NC_009938）和多頭帶絳蟲(chóng)（Taenia multiceps，F(xiàn)J495086）等明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖2A～圖2C）。表明，pcox1、pcox3 和prrnS 基因均可用于不同宿主來(lái)源猬迭宮絳蟲(chóng)蟲(chóng)種的鑒定。

圖2 基于pcox1（A）、pcox3（B）和prrnS基因（C）猬迭宮絳蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic relationship of S.erinaceieuropaei based on pcox1,pcox3 and prrnS genes,respectively

在猬迭宮絳蟲(chóng)的分支里，相同宿主的猬迭宮絳蟲(chóng)或者處于同一發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲(chóng)并未聚為同一分支，而不同宿主或不同發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲(chóng)則聚為同一分支（圖2A～圖2C）。Zhu 等基于cox1 基因進(jìn)行序列多態(tài)性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在澳大利亞的猬迭宮絳蟲(chóng)至少存在兩種基因型，兩種基因型分別來(lái)自非兩棲宿主（犬、狐貍、貓、虎和蛇）和兩棲宿主（蛙）[14]；Okamoto 等研究發(fā)現(xiàn)從不同國(guó)家分離的猬迭宮絳蟲(chóng)存在不同基因型，且這些基因型不具有地理或宿主特異性[15]；Zhang 等基于cytb、cox1、rrnS、28S rDNA 基因?qū)ξ覈?guó)西南9 個(gè)區(qū)域蛙源裂頭蚴進(jìn)行序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的兩棲宿主蛙體內(nèi)的猬迭宮絳蟲(chóng)存在兩種基因型，且在上世紀(jì)中期開(kāi)始分化，并推測(cè)這兩種基因型可能是猬迭宮絳蟲(chóng)和不同氣候環(huán)境下的中間宿主共同進(jìn)化所導(dǎo)致[8]。本研究系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示猬迭宮絳蟲(chóng)存在不同基因型，且進(jìn)一步推測(cè)，在不同宿主和不同地區(qū)的猬迭宮絳蟲(chóng)種內(nèi)存在多種基因型。且相同宿主或相同發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲(chóng)并未聚類(lèi)在同一分支，在同一分支里也存在不同宿主或不同發(fā)育階段的猬迭宮絳蟲(chóng)，本研究結(jié)果也提示猬迭宮絳蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化與其宿主和發(fā)育階段無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，這與Okamoto 等提出的猬迭宮絳蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化與其宿主無(wú)明顯關(guān)聯(lián)的結(jié)論相符，但Okamoto 并未提及猬迭宮絳蟲(chóng)的不同基因型是否與蟲(chóng)株不同的發(fā)育階段有關(guān)聯(lián)，該研究者認(rèn)為不同宿主的猬迭宮絳蟲(chóng)屬于同一基因型是由于人類(lèi)遷移或者經(jīng)濟(jì)活動(dòng)所引起的[15]。推測(cè)可能是由于貓、犬等寵物以及西伯利亞虎、孟加拉虎等珍惜動(dòng)物宿主被人為的遷徙到不同地區(qū)，猬迭宮絳蟲(chóng)為了適應(yīng)環(huán)境變化和不同宿主，致使不同基因型的猬迭宮絳蟲(chóng)可以感染同一宿主，或同一基因型的猬迭宮絳蟲(chóng)也可以感染不同宿主。

綜上所述，本研究推測(cè)在猬迭宮絳蟲(chóng)中存在至少兩種基因型，且各基因型與猬迭宮絳蟲(chóng)的宿主及其發(fā)育階段無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。因此，未來(lái)需要更多樣本進(jìn)一步證明猬迭宮絳蟲(chóng)的遺傳多樣性。本研究通過(guò)對(duì)猬迭宮絳蟲(chóng)的分子流行病學(xué)研究，豐富了其宿主譜，并為其群體遺傳研究提供了數(shù)據(jù)支持。