囊膜蛋白的糖基化修飾對(duì)病毒感染和致病性影響的研究進(jìn)展

趙小天，袁夢(mèng)淇，張 新，楊曉柯，馬吉飛，李永鋒*，仇華吉,*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069；3.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

糖基化（Glycosylation）是指蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在酶的作用下連接糖鏈的一種修飾形式。作為生物體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一，糖基化調(diào)控了蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性[1-2]。細(xì)胞內(nèi)超過(guò)50%的蛋白質(zhì)均有糖鏈的修飾，它們參與了包括細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞分化、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等在內(nèi)的各種重要的生命活動(dòng)。在多種疾病，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管病、代謝性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中均伴隨著蛋白質(zhì)糖基化異常的發(fā)生[3-4]。因此，針對(duì)糖鏈形成、糖鏈結(jié)構(gòu)和糖鏈功能等的糖生物學(xué)研究已成為當(dāng)前生命科學(xué)中不可忽視的領(lǐng)域。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)的差異，糖鏈可分為以下幾種類型：（1）連接于天冬酰胺（Asparagine，Asn）殘基酰胺氮的N-連接糖鏈；（2）連接于絲氨酸（Serine，Ser）、蘇氨酸（Threonine，Thr）殘基羥基氧的O-連接糖鏈；（3）與磷酸絲氨酸上的磷酸連接的糖鏈；（4）連接于色氨酸（Tryptophan，Trp）殘基上碳的C-連接糖鏈（很少見(jiàn)）；（5）糖基磷脂酰肌醇化[5]。其中N-連接糖鏈（或稱N-糖基化）在真核生物中廣泛存在，也是研究最為深入的一種糖基化方式。

一些病毒具有包裹在衣殼外的一層囊膜，這層囊膜主要來(lái)源于宿主細(xì)胞膜（磷脂層和膜蛋白），但也包含一些病毒自身的糖蛋白。多數(shù)囊膜病毒的囊膜蛋白存在糖基化修飾。在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，首先是病毒囊膜表面上的糖蛋白識(shí)別并結(jié)合宿主表面受體，接著病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜結(jié)合，最后病毒的衣殼和基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞，完成感染過(guò)程。

1 N-糖基化修飾過(guò)程

N-連接的糖鏈合成起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），完成于高爾基體。N-糖鏈合成的第一步是將一個(gè)14 糖的核心寡聚糖添加到新形成的特征序列為Asn-X-Ser/Thr（X 代表任何一種氨基酸）多肽鏈的天冬酰胺上。核心寡聚糖是由兩分子N-乙酰葡萄糖胺、九分子甘露糖和三分子葡萄糖依次組成，第一位N-乙酰葡萄糖胺與ER 雙脂層膜上的磷酸多萜醇的磷酸基結(jié)合，當(dāng)ER 膜上有新多肽合成時(shí)，整個(gè)糖鏈將會(huì)一起轉(zhuǎn)移。寡聚糖轉(zhuǎn)移到新生肽以后，在ER 中進(jìn)一步加工，依次切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖。在ER 形成的糖蛋白具有相似的糖鏈，由順式面進(jìn)入高爾基體后，在各扁平膜囊之間的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，原來(lái)糖鏈上的大部分甘露糖被切除，但又由多種糖基轉(zhuǎn)移酶依次加上了不同類型的糖分子，形成了結(jié)構(gòu)各異的寡糖鏈。血漿等體液中蛋白質(zhì)多發(fā)生N-糖基化，因此N-糖蛋白又稱為血漿型糖蛋白。值得注意的是，病毒蛋白的糖基化途徑可能不是嚴(yán)格線性的，而且一些病毒顆粒在糖基化途徑中早期發(fā)生出芽/易位，這可能也解釋了一些病毒糖蛋白上存在異常聚糖的原因[6]。此外，許多病毒糖蛋白不遵循經(jīng)典的分泌途徑。例如，病毒直接從ER 運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜，繞過(guò)高爾基體中的聚糖而成熟[7]。

2 囊膜蛋白糖基化與病毒復(fù)制

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的主要囊膜蛋白GP5 是一種跨膜蛋白，GP5 蛋白有2～4 個(gè)潛在的N-糖基化（N-linked glycosylation，NLG）位點(diǎn)。PRRSV 囊膜蛋白不同的糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒的復(fù)制有不同的影響。（1）GP5 蛋白中N30、N35、N44 和N51 單個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變并不會(huì)影響病毒在細(xì)胞中的感染性，但是與野生型（Wild type，WT）病毒相比，當(dāng)GP5 蛋白的NLG 位點(diǎn)存在多個(gè)突變時(shí)病毒滴度顯著降低[8]；（2）II 型PRRSV FL12 株GP3 蛋白或GP5 蛋白中NLG 位點(diǎn)的突變會(huì)嚴(yán)重影響病毒在Marc-145 細(xì)胞中的復(fù)制[9]；（3）盡管在II 型PRRSV 野毒株（PRRSV-01）和PRRSV FL12 嵌合病毒中的GP3 蛋白和GP5 蛋白無(wú)NLG 位點(diǎn)，但其在Marc-145 細(xì)胞中的復(fù)制效率卻提高了[10]。出現(xiàn)這種差異，一種可能的原因是由于NLG 位點(diǎn)被敲除的方式不同所致。因?yàn)橛袌?bào)道顯示FL12 株GP3 蛋白和GP5 蛋白中的NLG 位點(diǎn)均是通過(guò)人工方式從病毒基因組中敲除，并且無(wú)其他突變[11]；而在PRRSV-01 和PRRSV FL12 嵌合病毒中的NLG 位點(diǎn)則是發(fā)生了自然缺失。另一個(gè)原因可能是PRRSV-01 GP3 蛋白和GP5 蛋白NLG 位點(diǎn)被敲除的同時(shí)可能還發(fā)生了其他代償性突變，這些突變共同增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力（表1）。

表1 不同病毒囊膜蛋白去除糖基化修飾對(duì)病毒復(fù)制、免疫原性、致病性的影響

同樣，神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）蛋白作為流感病毒的一種糖蛋白，在病毒出芽和釋放過(guò)程中起著重要的作用[12]。在流感病毒A/1933/WSN/H1N1（WSN）株NA 蛋白中NLG 的突變降低了病毒的出芽和復(fù)制，尤其是當(dāng)位于NA蛋白的第219位點(diǎn)的NLG突變顯著降低了H1N1流感病毒在體內(nèi)外的復(fù)制[13]。

除此之外，囊膜蛋白糖基化對(duì)病毒復(fù)制的影響還存在體內(nèi)外的差異。例如，在體外哺乳動(dòng)物模型中，囊膜蛋白糖基化不影響寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）在BHK 細(xì)胞和Vero 細(xì)胞中的復(fù)制；然而，囊膜蛋白糖基化的敲除卻顯著降低了A129 小鼠模型中ZIKV 的復(fù)制水平[14]。同樣，敲除登革熱病毒2 型（DENV-2）囊膜蛋白的N153 糖基化位點(diǎn)抑制了病毒在C6/36 細(xì)胞中的復(fù)制水平[15-16]，但未影響病毒在埃及伊蚊中的復(fù)制[17]。有趣的是在西尼羅河病毒（West nile virus，WNV）中，敲除囊膜蛋白的N154 糖基化位點(diǎn)并不影響病毒在C6/36 細(xì)胞中的復(fù)制，但顯著減少了病毒在庫(kù)蚊中的傳播[18]。而在DENV-2 中敲除囊膜蛋白N67 糖基化位點(diǎn)則會(huì)破壞DENV-2 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生感染性病毒的能力，但并不會(huì)影響病毒在蚊子細(xì)胞中的感染性[16-17]。以上結(jié)果說(shuō)明糖基化修飾可以增強(qiáng)病毒體內(nèi)外的復(fù)制。因此，可以突變強(qiáng)毒株蛋白的NLG，使其失去糖基化修飾，從而使突變體病毒在體內(nèi)外的復(fù)制效率降低，進(jìn)而為以后弱毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)，但是要注意并不是所有的糖基化修飾對(duì)病毒復(fù)制都會(huì)起到增強(qiáng)作用，細(xì)胞和宿主種類的不同也會(huì)使糖基化修飾對(duì)病毒在體內(nèi)外復(fù)制水平有所差異。

3 囊膜蛋白糖基化與病毒蛋白的免疫原性

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）強(qiáng)毒株和兔化弱毒疫苗株（C 株）E2 蛋白分別含有5 個(gè)和6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其中N986 是兔化弱毒疫苗株所特有的[19]。這些糖基化位點(diǎn)對(duì)豬瘟病毒的感染十分重要，如果將它們同時(shí)突變，病毒就會(huì)失去感染性[20]。有研究顯示，CSFV囊膜糖蛋白的糖基化位點(diǎn)在病毒吸附與靶細(xì)胞侵入、抗體產(chǎn)生、誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)及病毒毒力等方面發(fā)揮重要的作用（圖1），比如存在于E2 蛋白116 位的NLG 位點(diǎn)在豬瘟病毒毒力減弱方面發(fā)揮十分重要的作用，而185 位的NLG 位點(diǎn)對(duì)于病毒活性至關(guān)重要[21]。

圖1 囊膜糖基化去除對(duì)病毒復(fù)制、致病性、免疫原性的影響

對(duì)于許多囊膜病毒如丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）和人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）而言，囊膜蛋白糖基化修飾能夠影響可用抗原表位的數(shù)量，并調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫識(shí)別，從而影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)[22]。同樣，囊膜蛋白的糖基化修飾也會(huì)影響PRRSV 的免疫原性。PRRSV GP5 蛋 白 胞 外 區(qū) 存 在3 個(gè)NLG 位 點(diǎn)（N34、N44 和N51），而在N34、N51 和N34/51 位點(diǎn)突變的病毒對(duì)WT PRRSV 特異性抗體的中和作用敏感性增強(qiáng)。此外，用突變體病毒接種豬誘導(dǎo)了針對(duì)突變株和WT PRRSV 高水平的中和抗體（Neutralizing antibodies，NAbs），這表明GP5 蛋白胞外區(qū)多糖殘基的突變?cè)鰪?qiáng)了體外病毒對(duì)中和抗體的敏感性，進(jìn)而增強(qiáng)了鄰近的中和表位的免疫原性[9]。

PRRSV-01 株GP5 蛋白N51 位NLG 的突變?cè)黾恿瞬《緦?duì)NAbs 的敏感性，并增強(qiáng)了病毒產(chǎn)生同源NAbs 應(yīng)答的能力，同時(shí)PRRSV-01 株GP3 蛋白中N131 位NLG 的缺失也會(huì)導(dǎo)致其對(duì)NAbs 敏感性及其應(yīng)答能力的增強(qiáng)[10]。但是，PRRSV FL12 株GP3 蛋白中N29、N152 和N160 位的突變并不影響病毒對(duì)NAbs敏感性及其應(yīng)答能力[11]。這些結(jié)果提示，糖蛋白中特定糖基化位點(diǎn)可能對(duì)調(diào)節(jié)NAbs 誘導(dǎo)的能力很重要，不僅使病毒對(duì)抗體的中和產(chǎn)生抵抗力，而且還削弱了病毒誘導(dǎo)NAbs 反應(yīng)的能力。因此，糖基化位點(diǎn)的去除增強(qiáng)了病毒對(duì)抗體中和的敏感性，并增強(qiáng)了病毒在體內(nèi)誘導(dǎo)NAbs 的能力。在以后的針對(duì)病毒疫苗的研發(fā)過(guò)程中，病毒蛋白糖基化位點(diǎn)或許可以成為一個(gè)關(guān)鍵的靶點(diǎn)，通過(guò)突變糖基化位點(diǎn)，使病毒蛋白發(fā)生/去除糖基化修飾，使其誘導(dǎo)中和抗體的能力增加，進(jìn)而抵抗病毒的感染。

4 囊膜蛋白糖基化與病毒致病性

ZIKV 的囊膜蛋白作為病毒的主要毒力基因，與病毒的致病性密切相關(guān)。研究表明，敲除囊膜蛋白的N154 糖基化位點(diǎn)后ZIKV 對(duì)小鼠的神經(jīng)侵襲力減弱，從而導(dǎo)致致病性減弱，并且減弱了對(duì)蚊子的感染能力[14,23]，這是由于4 個(gè)氨基酸缺失或N154A 替代而導(dǎo)致囊膜糖基化缺失的ZIKV MR766 株在A129 小鼠的血清和大腦中產(chǎn)生的病毒載量低于糖基化修飾的病毒[23]。同樣，與WT 糖基化病毒相比，由于N154Q突變而導(dǎo)致囊膜糖基化缺失的ZIKV 導(dǎo)致A129 小鼠血清中的病毒載量下降[14]。由此推斷4 個(gè)氨基酸或N154 是病毒毒力因子或病毒囊膜蛋白糖基化修飾的關(guān)鍵位點(diǎn)。

同樣，敲除DENV-4 型囊膜蛋白糖基化減弱了病毒對(duì)小鼠的神經(jīng)毒性[24]；敲除日本腦炎病毒（JEV）囊膜蛋白N154 位糖基化后病毒對(duì)小鼠的神經(jīng)毒性和神經(jīng)侵襲力均減弱[25]；鴨坦布蘇病毒（DTMUV）囊膜蛋白N156 位氨基酸定點(diǎn)突變后，減弱了病毒在產(chǎn)蛋鴨中的傳播，同時(shí)降低了病毒在產(chǎn)蛋鴨外周組織中的載量[26]。敲除Erns 和E2 中特定的糖基化位點(diǎn)也會(huì)導(dǎo)致CSFV Brescia 株的毒力減弱[27]。無(wú)獨(dú)有偶，與WT 相比，用WNV 感染幼齡家雞，在感染非糖基化突變株的小雞中觀察到較低的病毒血癥和器官中低水平的病毒[28]。同樣，與WT 病毒相比，缺失囊膜糖基化的亞洲和非洲ZIKV 病毒株的組織病毒載量更低[29]。

研究表明，敲除新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）蛋白的NLG，可以導(dǎo)致該病毒在雞中的毒力減弱從而顯著降低病毒的致病力[30]。同樣，HA 蛋白aa158 突變對(duì)H5N1 流感病毒在小鼠體內(nèi)的致病性也有重要作用。比如G158N 突變，即在HA 蛋白的aa158～aa160 位引入NLG 時(shí)，NLG 將會(huì)提高感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的病毒產(chǎn)量，并加劇宿主對(duì)病毒感染的免疫和炎癥反應(yīng)從而增強(qiáng)病毒的致病性[31]。與此不同的是，該糖基化位點(diǎn)的突變僅略微降低了另一種高致病性H5N1 病毒A/鴨子/湖南/49/05 株對(duì)小鼠的毒力[32]。因此，推測(cè)HA 蛋白的糖基化在病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性可能因病毒亞型或毒株的不同而有所差異。以上研究表明，囊膜蛋白糖基化修飾能夠增強(qiáng)病毒的致病性，但是這些糖基化修飾如何影響病毒毒力的機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。

5 小結(jié)與展望

NLG 是一種常見(jiàn)的蛋白翻譯后修飾，對(duì)蛋白的構(gòu)象和功能起著重要的作用。對(duì)于許多囊膜病毒來(lái)說(shuō)，其囊膜蛋白糖基化會(huì)影響病毒的免疫原性、感染性和毒力。但是在囊膜蛋白和NS1 蛋白中同時(shí)含有糖基化位點(diǎn)突變的ZIKV 是否比只攜帶NS1 突變的DENV-2 更穩(wěn)定，或者編碼非糖基化囊膜蛋白和NS1蛋白的病毒（m5MR）中是否存在其他病毒蛋白編碼區(qū)的補(bǔ)償突變目前尚不清楚。此外，糖基化修飾是如何影響病毒毒力的機(jī)制也不清楚。這些都值得進(jìn)一步探究，可作為以后研究的方向。根據(jù)研究表明，糖基化在病毒復(fù)制能力中起到一定的增強(qiáng)作用，但并不是所有的糖基化都會(huì)對(duì)病毒復(fù)制起到增強(qiáng)作用。NLG 位點(diǎn)對(duì)病毒復(fù)制影響的差異是否是由于NLG 位點(diǎn)被敲除的方式不同所致還需要進(jìn)一步研究。這些問(wèn)題的答案將進(jìn)一步加深人們對(duì)囊膜蛋白糖基化修飾影響病毒感染和致病機(jī)制的了解，并可能有助于尋找抗病毒的新靶點(diǎn)。

關(guān)于蛋白糖基化對(duì)病毒毒力影響的報(bào)道均是針對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，目前有研究發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白糖基化修飾也會(huì)對(duì)病毒毒力產(chǎn)生影響，比如ZIKV NS1蛋白。盡管非結(jié)構(gòu)蛋白糖基化修飾背后還有很多復(fù)雜和未知的機(jī)制有待探索，但它為抗病毒感染、疫苗的研制等方面的研究開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)新的思路。相信隨著糖組學(xué)的出現(xiàn)和糖生物學(xué)的全面發(fā)展，病毒囊膜蛋白糖基化的研究一定會(huì)在抗病毒藥物開(kāi)發(fā)和新型疫苗研制方面大有作為。