新冠病毒藥物研發(fā)新靶點(diǎn)—LLQY 基序

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的全球大流行帶來(lái)了前所未有的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題，也給世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了巨大的打擊，同時(shí)也極大的推動(dòng)了病毒學(xué)研究的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒（SARSCoV-2）是引起COVID-19 的唯一病原體，為β 冠狀病毒屬有囊膜的單股正鏈RNA 病毒。SARS-CoV-2 顆粒直徑約60 nm～140 nm，呈球形或卵圓形，主要由刺突蛋白（S）、基質(zhì)蛋白（M）、胞膜蛋白（E）、核衣殼蛋白（N）、RNA 依賴型RNA 聚合酶蛋白（RdRp）以及RNA 基因組構(gòu)成，其中S 蛋白負(fù)責(zé)與受體結(jié)合并介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，是病毒感染的關(guān)鍵組分，也是目前疫苗和藥物研發(fā)的主要靶點(diǎn)。

近日，《Journal of Virology》雜志發(fā)表了題為“The LLQY motif on SARS-CoV-2 spike protein affects s in‐corporation into virus particles”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 S 蛋白保守的753-LLQY-756 基序在S 蛋白的合成、加工及病毒組裝和感染的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 S 蛋白前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，被高爾基體中的Furin 蛋白酶切割形成S1 和S2 兩個(gè)亞基，并通過(guò)非共價(jià)鍵作用結(jié)合形成成熟的S 蛋白并參與病毒顆粒的組裝。其中，S1 亞基主要與人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（hACE2）受體結(jié)合，S2 亞基將S 蛋白錨定在病毒膜上，同時(shí)介導(dǎo)病毒—細(xì)胞的融合過(guò)程。在S2 亞基的N 端存在跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）識(shí)別位點(diǎn)S2'，在S2 發(fā)揮融合功能的過(guò)程中，TMPRSS2 識(shí)別并切割S2'位點(diǎn)，暴露融合肽。該研究比較分析了大量SARS-CoV-2 S 蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，在S1/S2 切割位點(diǎn)與S2'切割位點(diǎn)之間存在一段高度保守的氨基酸基序。同時(shí)對(duì)S 蛋白三維結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，這段保守的氨基酸基序中L753、Y756、F759與T998之間通過(guò)氫鍵相互連接形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其中Y756位于中間，起到支撐作用，推測(cè)這種空間結(jié)構(gòu)在維持S 蛋白融合前構(gòu)象的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步證實(shí)這一推測(cè)，該研究首先根據(jù)多種冠狀病毒S 蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)Y756進(jìn)行了多種突變，結(jié)果顯示，當(dāng)酪氨酸（Y）突變?yōu)楸彼幔ˋ）、甘氨酸（G）、谷氨酸（E）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的S 蛋白前體不能被裂解為S1 和S2 兩個(gè)亞基，突變?yōu)樯彼幔╓）、組氨酸（H）時(shí)，S蛋白前體的裂解水平降低，表明Y756突變會(huì)影響到蛋白酶對(duì)S1/S2 裂解位點(diǎn)的識(shí)別。隨后該研究基于HIV-1 慢病毒包裝系統(tǒng)，構(gòu)建了Y756突變型假型病毒，感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型病毒相比，Y756突變的SARS-CoV-2 假型病毒感染表達(dá)hACE2 的293T 細(xì)胞（293T-hACE2）以及人肝癌細(xì)胞（Huh7）的水平均顯著降低，對(duì)L753、F759以及T998突變后得到同樣的結(jié)果，表明753-LLQY-759 基序的穩(wěn)定對(duì)SARS-CoV-2 感染細(xì)胞至關(guān)重要。進(jìn)一步研究顯示，L753和Y756突變會(huì)導(dǎo)致S 蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，表明753-LLQY-759基序的穩(wěn)定能夠影響S 蛋白的正確轉(zhuǎn)運(yùn)。對(duì)L753和Y756均突變的SARS-CoV-2 假型病毒以及病毒樣顆粒分別通過(guò)western blot試驗(yàn)以及透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變會(huì)影響S 蛋白插入到假型病毒或病毒樣顆粒的囊膜中。最后該研究分析了753-LLQY-759 基序中單氨基酸突變包裝的假型病毒對(duì)其受體結(jié)合區(qū)（RBD）誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體中和活性的敏感性，結(jié)果顯示，Y756突變使得SARS-CoV-2 假型病毒對(duì)RBD 誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的敏感性降低。

綜上所述，該研究充分證明了SARS-CoV-2 S 蛋白中的753-LLQY-759 基序通過(guò)影響S 蛋白的加工、成熟以及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，從而影響病毒粒子的組裝和產(chǎn)生。因此，該保守的基序或可作為廣譜抗冠狀病毒藥物設(shè)計(jì)和研發(fā)的潛在靶點(diǎn)，對(duì)于防控和治療新型冠狀病毒肺炎策略的研究有重要的借鑒意義。