朊樣蛋白Doppel的研究進(jìn)展

王 川，俞海山，楊宇澤，魏亞琴，張 釗，萬學(xué)瑞，賈曉蕊，吳 潤(rùn)

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.北京市畜牧總站，北京 100125；3.甘肅省科學(xué)院生物研究所甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/厭氧微生物中心，甘肅 蘭州 730000）

傳染性海綿狀腦?。═ransmissible spongiform en-cephalopathies，TSEs）是由朊蛋白（Prion protein，PrP）引起的一種致命的神經(jīng)退行性疾病，最早于18 世紀(jì)中期在歐洲地區(qū)羊群中發(fā)現(xiàn)羊瘙癢病，目前已在人和多種哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)了傳染性海綿狀腦病[1-2]。現(xiàn)在普遍認(rèn)為當(dāng)人和哺乳動(dòng)物的正常細(xì)胞型朊蛋白（Cel-lular isoform of prion protein，PrPC）發(fā)生錯(cuò)誤折疊轉(zhuǎn)變?yōu)榘W病型朊蛋白（Scrapie isoform of prion protein，PrP-Sc）后導(dǎo)致傳染性海綿狀腦病的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)缺乏PrPC蛋白的小鼠對(duì)羊瘙癢癥具有抗性[4]，此外PrPC在神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)傳遞、神經(jīng)可塑性以及細(xì)胞死亡[5]，癌細(xì)胞的抗凋亡、耐藥、遷移[6]，細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和DNA 損傷修復(fù)等多種生理功能中起重要作用[7]。Doppel 蛋白（Prion-like protein，Dpl）是在制備PrP 敲除小鼠研究朊蛋白相關(guān)功能過程中發(fā)現(xiàn)的朊蛋白家族成員，研究發(fā)現(xiàn)Doppel 在雄性生殖功能中發(fā)揮作用，同時(shí)Doppel 與癌癥的發(fā)生也密切相關(guān)。Doppel與PrP 雖然二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但是生理功能并不相同，甚至存在拮抗作用。本文就Doppel 蛋白的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，為后續(xù)朊蛋白家族的研究提供參考。

1 朊蛋白家族及Doppel 蛋白

朊蛋白家族成員包括prnp基因編碼的PrP 蛋白[8]，sprn基因編碼的Shadoo 蛋白[8-9]，prnd基因編碼的Doppel 蛋白[8-9]以及prnt基因編碼的Prt 蛋白[8,10]。

1.1 朊蛋白prnp基因編碼的朊蛋白廣泛表達(dá)于在自然界多種動(dòng)物機(jī)體，尤其在哺乳動(dòng)物腦組織中高度表達(dá)，其編碼的PrP 蛋白有兩種構(gòu)象，其中PrPSc是傳染性海綿狀腦病的病原體，另一種構(gòu)象PrPC是一種GPI 錨定蛋白（GPI-anchored protein）錨定的膜糖蛋白，在人和動(dòng)物全身多種細(xì)胞通路和信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[11]；由于PrPC由GPI 錨定蛋白錨定在細(xì)胞膜上并沒有直接進(jìn)入細(xì)胞，所以信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)不能夠直接被PrPC調(diào)節(jié)，而是需要與其他跨膜蛋白相互作用來完成[12-13]；此外朊蛋白具有多種生理功能，不僅在細(xì)胞粘附、抗細(xì)胞凋亡等過程也發(fā)揮作用[14-15]，同時(shí)也在細(xì)菌感染過程中發(fā)揮重要作用，牛分枝桿菌感染導(dǎo)致prnp mRNA 表達(dá)水平逐漸升高且在感染過程中調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]；而流產(chǎn)布魯氏菌可利用腸道M 細(xì)胞上的PrPC作為一種侵入性受體[17]；在感染幽門螺桿菌患者的胃黏膜中PrPC高表達(dá)，但在未受感染的胃黏膜中不表達(dá)或低表達(dá)[18]；PrP 敲除小鼠在鏈球菌引起的細(xì)菌性敗血癥模型中顯示易感性改變[19]；人的朊蛋白N 端重組蛋白也表現(xiàn)出了抗革蘭氏陽性菌和陰性菌的活性[20]。

1.2 Shadoo 蛋白sprn基因是在公共數(shù)據(jù)庫中搜索與prnd序列相似的核苷酸序列時(shí)發(fā)現(xiàn)的，隨后在魚類（斑馬魚、河豚）和哺乳動(dòng)物（小鼠、大鼠、人類）中發(fā)現(xiàn)表達(dá)，其由兩個(gè)外顯子組成，整個(gè)開放閱讀框（ORF）包含在第二個(gè)單外顯子中，編碼的Shadoo蛋白包含130～150 個(gè)氨基酸。Shadoo 和PrP 之間結(jié)構(gòu)差異的主要是疏水C 末端和N 末端重復(fù)區(qū)域，但其總體結(jié)構(gòu)與PrP 密切相關(guān)。通過哺乳動(dòng)物（人、鼠、大鼠）的腦轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)Shadoo 在腦中有顯著的特異性表達(dá)，且兩者之間功能上具有一定重疊，如中和Doppel 神經(jīng)毒性以及神經(jīng)保護(hù)作用[21]。

1.3 Prt 蛋白prnt基因又稱睪丸特異性基因，編碼睪丸特異性朊蛋白Prt，其在睪丸組織中高度表達(dá)，主要在生精細(xì)胞發(fā)育階段的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的細(xì)胞核及精細(xì)胞和精子頭部頂體區(qū)域中表達(dá)[22]；此外prnt在骨骼肌、乳房、附睪、小毛囊、大毛囊、子宮和卵巢中也有表達(dá)，而且在卵巢的表達(dá)量最高，其次是子宮、大卵泡和小卵泡[23]。

1.4 Doppel 蛋白

1.4.1 Doppel 結(jié)構(gòu)prnd基因編碼的Doppel 蛋白是在制備prnp基因敲除小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)朊蛋白家族成員，因其位于朊蛋白的下游而得名為Doppel 蛋白，具有179 個(gè)左右氨基酸殘基；同時(shí)在小鼠、大鼠和人類中均發(fā)現(xiàn)了完整的prnd開放閱讀框（ORF），小鼠prnd位于2 號(hào)染色體短臂prnp下游16 kb 處，包含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，ORF 位于第2 個(gè)外顯子上，產(chǎn)生1.7 kb 和2.7 kb 兩個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[24]；小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)的Doppel 蛋白中存在兩個(gè)N 端連接的糖基化位點(diǎn)，在細(xì)胞表面通過GPI 錨定蛋白錨定在細(xì)胞膜上[25]；小鼠和大鼠Doppel 蛋白同源性大于90%，小鼠和人類Doppel 蛋白同源性為76%；對(duì)重組PrP 和Doppel 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)Doppel蛋白與已知的PrP 同源性為25%[24]；雖然兩者的同源性并不高，但它們?cè)诜g和修飾后的空間結(jié)構(gòu)卻十分相似[26]；雞Doppel 與PrPC具有相似的翻譯后修飾和空間結(jié)構(gòu)，但兩者表現(xiàn)為拮抗作用[27]；通過人工表達(dá)出小鼠的Doppel 和PrP 蛋白，發(fā)現(xiàn)兩者整體的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件非常相似，都具有3 個(gè)α 螺旋和2 個(gè)β折疊，但α螺旋長(zhǎng)度和β鏈方向之間存在差異[28]；在蛋白結(jié)構(gòu)上，Doppel 存在2 個(gè)二硫鍵，而PrP 只具有1 個(gè)二硫鍵[25]；研究Doppel 和PrPC的糖基化和修飾是否相互影響發(fā)現(xiàn)，Doppel的修飾不受PrPC影響，而PrPC的N端短片段則因Doppel表達(dá)而減少[29]。

1.4.2 Doppel 生物學(xué)功能 研究表明prnp-/-小鼠的血管生成缺陷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障完整性受損，Doppel 能促進(jìn)血管生成和血腦屏障發(fā)育[30]；通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)9 周齡的野生型小鼠各Doppel 在睪丸和心臟高水平表達(dá)，在脾臟和骨骼肌中表達(dá)較少，在腦、腎、肝和肺幾乎不表達(dá)[31]； Doppel 在人類睪丸的支持細(xì)胞、附睪和成熟精子的鞭毛中均有表達(dá)；同時(shí)數(shù)據(jù)也表明，精子是研究Doppel 和PrP 之間潛在相互作用的有益模型[32]；Doppel 敲除的雄性小鼠在其精子發(fā)生過程中，圓形的精子細(xì)胞向有頭有尾的精子轉(zhuǎn)化是異常的，這阻礙了精子的發(fā)生，同時(shí)觀察到后期分化的精子數(shù)量減少，成熟精子的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了異常，鞭毛和頭部出現(xiàn)了畸形，頂體功能受損，導(dǎo)致不育[33]；在發(fā)育山羊的兩性生殖細(xì)胞和胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞中都可以檢測(cè)到Doppel 蛋白[34]；在育成綿羊睪丸中并未檢測(cè)到Doppel，但在成年綿羊組織中發(fā)現(xiàn)了Doppel 的表達(dá)[35]；研究發(fā)現(xiàn)在ARR/ARQ 基因型綿羊大腦中Doppel mRNA 含量最高，神經(jīng)組織中腦干中最低，ARH/ARQ 基因型綿羊丘腦中最高，腦干中最低，Doppel mRNA 在脾臟、扁桃體、下頜下淋巴結(jié)和咽部表達(dá)量中等，Prnp基因型對(duì)Doppel 基因表達(dá)的影響在ARR/ARQ 和ARH/ARQ 基因型綿羊相同組織中Doppel 基因轉(zhuǎn)錄水平差異顯著[36]；在具有較高受胎率（SCR）的荷斯坦公牛精液中檢測(cè)到了更高的Doppel mRNA 豐度[37]；通過克隆綿羊prnd并人工表達(dá)出Doppel 蛋白，在公羊精子獲能過程中添加Doppel 蛋白，會(huì)顯著提高精子的活力、生存能力和受精率[38]；已經(jīng)證明PrP 和Doppel 還會(huì)由一些免疫細(xì)胞表達(dá)，特別是B 淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的激活（即細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和MAP 激酶途徑的激活）表明PrP 和Dpl 與B 細(xì)胞上的功能受體結(jié)合，PrP 和Doppel 在免疫細(xì)胞間相互作用中可能發(fā)揮作用[39]；此外發(fā)現(xiàn)用牛源糞腸球菌和金黃色葡萄球菌感染BALB/c 雌鼠時(shí)PrP 和Dop-pel 的表達(dá)發(fā)生變化，其可能直接或者間接參與了小鼠機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的過程[40-41]。

2 Doppel 與朊蛋白家族之間的互作

2.1 PrP 和Doppel研究發(fā)現(xiàn)PrP 的表達(dá)與DNA 修復(fù)之間存在聯(lián)系，人類和小鼠神經(jīng)元細(xì)胞中的PrP是DNA 損傷修復(fù)所必需的[7]；雞PrPC下調(diào)可以抑制雞MSB1 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)G1 期細(xì)胞周期阻滯和凋亡[42]；而雞PrPC過表達(dá)可促進(jìn)雞DF-1細(xì)胞的粘附、增殖、侵襲和遷移，但抑制細(xì)胞凋亡[43-45]；PrP 對(duì)氧化應(yīng)激保護(hù)以及細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)當(dāng)中也發(fā)揮重要功能[46]；PrP 在動(dòng)物神經(jīng)組織中高度表達(dá)[47]，缺乏PrP 的小腦細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感，并且比野生型細(xì)胞更容易發(fā)生細(xì)胞死亡[48]，細(xì)胞缺失PrP 時(shí)會(huì)增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激損傷的易感性[49]；越來越多的研究顯示PrP 不僅具有保護(hù)正常神經(jīng)元細(xì)胞的作用，而且還與癌癥相關(guān)，PrP 過度表達(dá)與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生相關(guān)[50]，其與相關(guān)受體、生長(zhǎng)因子等相關(guān)蛋白結(jié)合，通過調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和分化而有助于腫瘤發(fā)生[51]，同時(shí)其也可抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性[52]，抵抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖并調(diào)控腫瘤的形成與發(fā)展[53]；此外也發(fā)現(xiàn)PrP 功能喪失和Doppel 異位表達(dá)是共濟(jì)失調(diào)小鼠神經(jīng)變性所必需的[54]，在prnp-/-的Nagasaki 和Rcm0 品系小鼠中過度表達(dá)prnd時(shí)，小鼠會(huì)表現(xiàn)出共濟(jì)失調(diào)[24]，prnp-/-小鼠的Doppel 過量表達(dá)時(shí)，加劇了氧化應(yīng)激而導(dǎo)致血紅素加氧酶（HO-1）和一氧化氮合酶（NOS）參與的反應(yīng)發(fā)生[55]；Doppel 過度表達(dá)所引起的細(xì)胞死亡和共濟(jì)失調(diào)可以通過PrP 的同時(shí)表達(dá)來抵消[56]；并且PrP 的缺失對(duì)于Doppel 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是必需的[57]，表明PrP與Doppel 存在拮抗作用。Doppel 在N2a 細(xì)胞（小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞）中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生活性氧（ROS），誘導(dǎo)細(xì)胞活力降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[58]；BEHRENS 等提出PrP 和Doppel 兩種蛋白之間作用的競(jìng)爭(zhēng)模型，PrP 與PrP 配體之間存在相互作用，在不存在PrP 的情況下，Doppel 與PrP 配體結(jié)合可能會(huì)觸發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，但如果PrP 對(duì)PrP 配體親和力高于Doppel，則會(huì)優(yōu)先結(jié)合PrP 配體，阻止Doppel 的凋亡信號(hào)[59]。

2.2 Shadoo 和Doppel通過構(gòu)建sprn過表達(dá)小鼠來研究Shadoo 在成年小鼠其他組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)基因只在睪丸間質(zhì)細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)[60]；而構(gòu)建sprn-/-胚胎和sprn-/-小鼠發(fā)現(xiàn)，胚胎致死率顯著增加，且sprn缺失的幼崽生長(zhǎng)遲緩、雌性哺乳缺陷，同時(shí)轉(zhuǎn)錄組分析表明Shadoo 參與小鼠胚胎和乳腺發(fā)育和分化，且PrP 和Shadoo 在早期胚胎發(fā)育中有拮抗作用[61]；通過prnp-/-小鼠小腦顆粒細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行功能測(cè)定以及對(duì)哺乳動(dòng)物腦組織轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)Shadoo 在腦中有顯著的特異性表達(dá)[21]，且其和PrPC一樣也能夠?qū)oppel 拮抗，可消除Dop-pel 的神經(jīng)毒性[62]。

2.3 Prt 和Doppel通過體外受精過程中加入阻斷Prt 功能的抗體的研究，發(fā)現(xiàn)受精率顯著降低[63]，其可能在精子發(fā)生、分化、獲能以及受精過程中發(fā)揮作用，而其與Doppel 的相互作用鮮有報(bào)導(dǎo)。

3 Doppel 蛋白在癌癥方面的研究

大量研究發(fā)現(xiàn)Doppel 與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，Doppel 表達(dá)程度與星形細(xì)胞瘤的惡性程度呈正相關(guān)[64]。研究白血病細(xì)胞系HL-60、K562 以及44 例急性髓系白血病（AML）和63 例骨髓增生異常綜合征（MDS）（其 中 包 含RA、RARS、RAEB、RAEB-t、CMML）患者的骨髓細(xì)胞，并將健康非血液病樣本的骨髓細(xì)胞作為對(duì)照。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDS 樣本Doppel 表達(dá)比正常對(duì)照骨髓樣本更強(qiáng)；熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組prndmRNA 轉(zhuǎn)錄水平最低，RA、RARS 樣本中Doppel 基因的轉(zhuǎn)錄水平也 顯 著 增 高，RAEB、RAEB-t、CMML 以 及AML 樣本中也明顯升高，RARS 和CMML 病例中Doppel 基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，HL-60 細(xì)胞系中Doppel 的轉(zhuǎn)錄水平中等程度的上調(diào)，K562 細(xì)胞系中Doppel 的轉(zhuǎn)錄水平與正常對(duì)照相似。證實(shí)了Doppel 在AML 和MDS 骨髓樣本中均表達(dá)，健康對(duì)照樣本中均不表達(dá)或幾乎檢測(cè)不到[65]；利用prnd探針通過Northern 印跡雜交研究發(fā)現(xiàn)，健康人腦組織中prnd不表達(dá)，在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤組織和人腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系PRTHU2 中高表達(dá)[66]；利用反義RNA 和小干擾RNA 來減少IPDDC-A2 星形細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系中Doppel 的表達(dá)，通過劃痕傷口愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Doppel 沉默后細(xì)胞遷移減少；在Hela 細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)Doppel 表達(dá)，與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)Doppel 的細(xì)胞遷移率顯著增加，說明Doppel 影響細(xì)胞的體外遷移能力[67]；分析星形細(xì)胞瘤標(biāo)本、健康睪丸和大腦組織Doppel 表達(dá)，結(jié)果顯示在大腦胞質(zhì)和微粒體部分以及睪丸細(xì)胞質(zhì)中均檢測(cè)不到Doppel，而在86%的星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中檢測(cè)出了Doppel[68]；Doppel 在各種腫瘤發(fā)生的血管生成過程中普遍表達(dá)，對(duì)人類癌組織進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，在肺癌和結(jié)腸癌樣本中Doppel 強(qiáng)烈表達(dá)。對(duì)18 個(gè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和32 個(gè)結(jié)腸癌以及18 個(gè)肺和1 個(gè)結(jié)腸的正常組織進(jìn)行Doppel 表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有83%的NSCLC 和78%的結(jié)腸癌樣本顯示Dop-pel 表達(dá)增加；通過熒光定量測(cè)定小鼠血管生成性鱗狀細(xì)胞癌7（SCC7）分離出的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其Doppel 表達(dá)量比正常內(nèi)皮細(xì)胞高38 倍，脈管系統(tǒng)在原發(fā)性腫瘤中表達(dá)高水平的Doppel；Doppel 僅在發(fā)育中的小鼠大腦和視網(wǎng)膜及新生的一些血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)減少，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEG-FR2）相互作用激活內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)通路[43]；建立Doppel 過表達(dá)腫瘤模型并追蹤Doppel 的表達(dá)和血管形成過程發(fā)現(xiàn)，在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的Doppel 同樣促進(jìn)VEGFR2 信號(hào)傳導(dǎo)[69]；Doppel 在腫瘤細(xì)胞和組織的表達(dá)說明其在腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用。

Doppel 作為朊蛋白家族的一個(gè)成員，但目前研究表明Doppel 與傳染性海綿腦病的發(fā)生并不相關(guān)。然而已有研究顯示Doppel 與癌癥的發(fā)生以及在細(xì)菌感染的感染相關(guān)，其具體機(jī)制還需要大量研究來闡明，從而為癌癥和細(xì)菌病的研究和治療提供新的思路和方法。