蝙蝠寄生刺圓屬線蟲新種的鑒定（圓形目莫林科）

菅 蕊，徐 真，高佳麗，呂國平，秦麗云，張 晛，劇慧棟*

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056038；3.石家莊學(xué)院，河北 石家莊 050035；4.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050020；5.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050010）

近年來蝙蝠作為一種人獸共患疾病病原的重要載體，越來越引起人們的重視，蝙蝠寄生線蟲作為潛在的人獸共患病原需要研究。1926 年Boulenger 從埃及墓蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種線蟲，命名為多刺組圓線蟲（Histiostrongylus spinosusBoulenger，1926）。1935 年Travassos 認(rèn)為該種線蟲不屬于組圓屬（HistiostrongylusMolin，1861），因此建立了刺圓屬（SpinostrongylusTravassos，1935），并將Spinostrongylus spinosus（Bou-lenger，1926）Travassos, 1935，作為刺圓屬的模式種[1]。目前為止，該屬線蟲共報(bào)道6 種，該屬的鑒定特征為：頭端具頭泡，并有由14～16 個(gè)尖端向后的刺構(gòu)成的頭領(lǐng)。頭領(lǐng)后有大量環(huán)狀排列的小刺。口腔小，食道短，呈棒狀。雄蟲：交合傘由2 個(gè)大側(cè)葉和1 個(gè)小背葉組成。交合傘肋的排列方式為2～3型，第2 肋和第3 肋基部連接在一起，并與主干相連，肋的遠(yuǎn)端分離。第4 肋、第5 肋和第6 肋的基部連接在一起，然后與主干相連，肋的遠(yuǎn)端分離。背肋從基部垂直向后延伸。交合刺較細(xì)長，交合刺的柄部短，刃部長。具引帶。雌蟲：陰門位于蟲體后半部。子宮為對(duì)宮型。尾端圓錐形，末端尖。寄生于翼手目動(dòng)物。

本研究首先對(duì)寄生于黑髯墓蝠的線蟲使用光學(xué)顯微鏡初步觀察并繪制形態(tài)結(jié)構(gòu)圖，然后使用掃描電鏡觀察其重要結(jié)構(gòu)并采集圖譜確定該種屬于刺圓屬且為一新種，結(jié)合該線蟲ITS 基因在GenBank 中的比對(duì)結(jié)果與其形態(tài)學(xué)特征，確定該種應(yīng)屬于刺圓屬。本研究發(fā)現(xiàn)了一種新的潛在寄生蟲病的病原，為寄生蟲病的預(yù)防和診斷提供了基礎(chǔ)資料及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)本采自2018 年廣東省龍門縣小黃蝠（翼手目蝙蝠科）Scotophilus kuhlii（Leach）（Chi-roptera，Vespertilionidae）的小腸。用80 ℃左右的熱水將蟲體燙直，并將線蟲保存于70%酒精中。記錄宿主的種名、寄生部位、采集時(shí)間和地點(diǎn)。透明液（乳酸:苯酚：蒸餾水：甘油=1：1：1：2）由河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與分子進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室配制；DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑盒和蛋白酶K 購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 線蟲的觀察、繪圖及鑒定將已固定的標(biāo)本用75%酒精或透明液制成臨時(shí)裝片，在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下，對(duì)線蟲標(biāo)本的各個(gè)部分進(jìn)行初步的形態(tài)觀察，并使用顯微測(cè)微尺測(cè)量標(biāo)本的重要形態(tài)學(xué)特征，并記錄數(shù)據(jù)，借助可拍攝的光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)線蟲標(biāo)本的主要形態(tài)特征進(jìn)行鑒別并拍照，查閱文獻(xiàn)，進(jìn)行比對(duì)確定線蟲種類[2]。模式標(biāo)本保存于河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.3 線蟲ITS 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析從70%酒精中取出1 條雌蟲，分別置于不同的1.5 mL 離心管內(nèi)做好標(biāo)記， 用蒸餾水漂洗3～5 次，提取DNA，置-20 ℃冰箱中保存、備用。引物序列如下[2]：

NC1： 5'-AACAACCCTGAACCAGACGT-3'/NC5：5'-AATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段長度約為650 bp。擴(kuò)增程序如下：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。利用MegAlign 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果及GenBank中莫林科10 種線蟲的ITS 基因序列進(jìn)行同源性分析。分別采用最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建ITS 基因系統(tǒng)發(fā)育樹，將Amidostomoides monodon（KJ186098）和Amidostomoides acutum（KJ186097）設(shè)置為外群[3-4]，探究線蟲間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果該線蟲的模式宿主為黑髯墓蝠（翼手目，鞘尾蝠科）Taphozous melanopogon（Tem-minck）（Chiroptera: Emballonuridae）。寄生部位為小腸，感染率為9%（解剖11 只其中感染1 只），感染強(qiáng)度為6 條。宿主采集地為中國廣東省龍門縣。模式標(biāo)本中正模為1 條雄蟲（HBNU-M1015），配模為1 條雌蟲（HBNU-M1016），副模為2 條雌蟲（HBNU-M1017）。新種以交合刺遠(yuǎn)端呈雙叉狀分支的特征命名。

形態(tài)特征：該線蟲為小型線蟲，口孔三角形，口孔周圍有4 個(gè)頭乳突和1對(duì)頭感器。頭端有一圈角質(zhì)刺（圖1B），共16個(gè)。角質(zhì)刺分為兩種，一種是末端不分叉的單刺，另一種是末端分叉的分支刺（圖2A），其中背面和腹面兩端為單刺，中間有兩個(gè)分支刺，兩側(cè)面各有4根分支刺。食道短粗，呈花瓶狀（圖1A）。神經(jīng)環(huán)位于食道中部，頸乳突和排泄孔與神經(jīng)環(huán)在同一水平位置。頸刺從頭領(lǐng)后開始出現(xiàn)并向后延伸到大約蟲體前1/9 處，頸刺從前向后逐漸變小，呈環(huán)狀排列，有50～70 圈（圖2A 和圖2C），最后由刺變?yōu)檫B續(xù)的縱脊（圖2D 和圖2E）。身體中部脊的個(gè)數(shù)為80，一直延續(xù)到尾端為66 條，此時(shí)又由脊變?yōu)橥黄稹?/p>

其中正模（雄蟲1 條）僅有尾部部分。交合傘發(fā)達(dá)，有兩個(gè)大的側(cè)葉和一個(gè)小的背葉。交合傘肋的排列為2～3，第2 肋和第3 肋基部平行，末端明顯分開；第4～6 肋平行發(fā)出，末端稍微分離。第8 肋起自背肋基部，末端未達(dá)傘緣。背肋主干垂直向下延伸，近末端首先分出一細(xì)長側(cè)支，然后分為兩個(gè)短小的分支（圖1C）。交合刺細(xì)長，末端有兩個(gè)分叉，分叉有膜包被，交合刺長342 μm。引帶為高爾夫球棒狀，長58 μm（圖1D）。

配模（雌蟲1條）體長9.63 mm，最大體寬為356 μm，頭刺長96 μm，頭寬256 μm。神經(jīng)環(huán)、頸乳突、排泄孔與頭端的距離為198 μm。食道長365 μm，最大寬度為139 μm。陰門位于體后大約1/3 處，距尾端3.29 mm。括約肌長23 μm，寬32 μm，漏斗長49 μm，寬26 μm。蟲卵長107 μm，寬87 μm（圖1E）。雌蟲尾部圓錐形，末端尖，肛門距尾端126 μm。

副模為2 條雌蟲，體長9.21～9.86（9.53）mm，（括號(hào)內(nèi)的數(shù)值為平均值，下同）最大體寬為320～372（346）μm，頭刺長85～108（97）μm，頭寬241～267（254）μm。神經(jīng)環(huán)、頸乳突、排泄孔距頭端170～213（192）μm。食道長321～387（354）μm，最大寬度為125～150（138）μm。陰門位于蟲體后大約1/3 處，距尾端3.09～3.48（3.29）mm。括約肌長21～25（23）μm，寬27～35（31）μm，漏 斗 長45～52（49）μm，寬21～27（24）μm。蟲卵長102～112（107）μm，寬80～92（86）μm。雌蟲尾部圓錐形，末端尖（圖1F 和圖2F），肛門距尾端120～131（126）μm。

圖1 雙叉刺圓線蟲光鏡下的手繪圖譜Fig.1 Hand drawing of Spinostrongylus bifurcus n.sp.from Taphozous melanopogon based on optical microscope

綜上所述，該線蟲具有刺圓屬的形態(tài)特征。

Travassos 于1935 年建立了刺圓屬，隨后我國學(xué)者伍獻(xiàn)文和劉建康在中國的蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一新種，命名為中華刺圓線蟲（Spinostrongylus sinensisWu et Liu，1940）[5]；Lovekar 在印度的肯尼亞墓蝠體內(nèi)報(bào)道一個(gè)新種，為印度刺圓線蟲（Spinostrongylus indicusLovekar，1970）[6]；Trivedi 報(bào) 道 了 印 度 蝙 蝠 寄 生 刺圓屬線蟲3 個(gè)新種，包括寄生于印度山蝠小腸和直腸的Spinostrongylus johnstoniTrivedi, 1990，寄生于假吸血蝠胃腸內(nèi)的Spinostrongylus singhiTrivedi，1990以及寄生于長臂墓蝠小腸的Spinostrongylus priceiTrivedi，1990[7]。到目前為止，該屬線蟲共報(bào)道了6種。

該種線蟲與S. spinosus的主要區(qū)別為前者的交合刺末端分為2 支，而后者交合刺末端尖，不分支；前者的頸刺延伸至食道之后，大約為體長的1/9，而后者的頸刺僅延伸至食道末端。該種線蟲與S. indicus的區(qū)別為前者交合刺末端分為2 支，而后者的交合刺末端分為3 支。S. johnstoni有頭翼，具傘前乳突，交合刺上具有5 個(gè)～9 個(gè)角質(zhì)環(huán)，無引帶，與該種線蟲有明顯區(qū)別。S. singhi的兩根交合刺稍不等長，頭端的角質(zhì)刺12 個(gè)～14 個(gè)，而該種線蟲的交合刺等長，頭端角質(zhì)刺16 個(gè)。S.pricei的陰門位于蟲體中部稍后，并有明顯的陰門蓋，頸刺25 環(huán)～30 環(huán)；而該種線蟲的陰門位于體后1/3處，頸刺50環(huán)～70環(huán)。中華刺圓線蟲是我國報(bào)道的唯一一種刺圓屬線蟲，但該種線蟲與中華刺圓線蟲有明顯區(qū)別，一是前者交合刺末端分為2 支，而后者交合刺末端尖，不分支；二是該種線蟲的食道呈花瓶狀，而中華刺圓線蟲的食道為棒狀；前者的背肋先分出一個(gè)側(cè)支，然后分為2 個(gè)短支，而后者背肋僅分為2 短支。綜上所述，該種與該屬其他6種線蟲均有明顯區(qū)別，應(yīng)為一新種。

Fig.2 雙叉刺圓線蟲掃描電鏡圖譜Fig.2 Scanning electron micrographs ofSpinostrongylus bifurcusn.sp.

2.2 基于ITS基因序列的同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 同源性分析 對(duì)目的基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將得到的ITS 基因序列與GenBank 中莫林科10 種線蟲的18 條ITS 基因比對(duì)后的結(jié)果顯示，該線蟲與上述10種線蟲的同源性是32.73%～84.5%，表明莫林科線蟲的ITS 基因呈遺傳多樣性。其中雙叉刺圓線蟲與細(xì)頸屬、小細(xì)頸屬、類細(xì)頸屬線蟲的同源性為32.73%～45.57%，雙叉刺圓線蟲與絲狀?yuàn)W庫線蟲的同源性為37.30%～37.79%，雙叉刺圓線蟲與廣東杜瑞特線蟲的同源性為84.5%，雙叉刺圓線蟲與蝠杜瑞特線蟲的同源性為84.2%，GenBank 中尚無刺圓屬的基因信息，與該線蟲ITS 基因同源性最高的物種為杜瑞特線屬線蟲，它們之間的基因差異分別為15.5%和15.8%，明顯高于杜瑞特線屬中廣東杜瑞特線蟲與蝠杜瑞特線蟲0.63%的屬內(nèi)基因差距，表明雙叉刺圓線蟲不屬于杜瑞特線屬，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征以及杜瑞特線屬與刺圓屬在莫林科的分類學(xué)地位，該種應(yīng)屬于刺圓屬。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 本實(shí)驗(yàn)選取該線蟲ITS 基因序列和GenBank 中莫林科線蟲的19 條ITS 基因序列，包括2 亞科5 屬11 種，選取Amidostomoides monodon（KJ186098）和Amidostomoides acutum（KJ186097）為外群。利用MEGA6.0 和MrBayes3.2 軟件對(duì)20 條線蟲的ITS 基因序列構(gòu)建的ML 樹和BI 樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹分為3 個(gè)分支，其中類細(xì)頸屬的斑馬類細(xì)頸線蟲（Nematodiroides zembrae）單獨(dú)為一個(gè)分支。

細(xì)頸屬的瑞士細(xì)頸線蟲（Nematodirus helvetia-nus）、花苞細(xì)頸線蟲（Nematodirus spathiger）、伊朗細(xì)頸線蟲（Nematodirus oiratianus）、棉絮細(xì)頸線蟲（Nem-atodirus battus）、絲狀細(xì)頸線蟲（Nematodirus filicollis）和小細(xì)頸屬的駱駝小細(xì)頸線蟲（Nematodirella cameli）組成一個(gè)分支。

絲狀?yuàn)W庫線蟲（Oswaldocruzia filiformis）、杜瑞特線屬的蝠杜瑞特線蟲（Durettenema rhinolophi）、廣東杜瑞特線蟲（Durettenema guangdongense）和刺圓屬的雙叉刺圓線蟲（Spinostrongylus bifurcus）為一個(gè)分支（圖3）。

ITS 基因系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，雙叉刺圓線蟲（見圖3 中*號(hào)）、蝠杜瑞特線蟲與廣東杜瑞特線蟲組成一支（見圖3 中右向大括號(hào)），表明三者有更近的親緣關(guān)系。杜瑞特線屬線蟲與雙叉刺圓線蟲分為兩個(gè)分支，廣東杜瑞特線蟲和蝠杜瑞特線蟲ITS 基因的相似性為96%，而雙叉刺圓線蟲與杜瑞特線屬線蟲ITS 基因的相似性為82%，表明雙叉刺圓線蟲不應(yīng)屬于杜瑞特線屬，基于其形態(tài)學(xué)特征以及杜瑞特線屬與刺圓屬在莫林科的分類學(xué)地位，該種應(yīng)屬于刺圓屬?；贗TS 基因序列的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，進(jìn)一步證明該種歸于刺圓屬。又因其形態(tài)學(xué)特征與刺圓屬現(xiàn)有的6 種均不完全相同，因此可以判斷該種為刺圓屬一新種，根據(jù)其交合刺的特征將該新種命名為雙叉刺圓線蟲（Spinostrongylus bifurcusn.sp.）。

Fig.3 基于ITS基因采用貝葉斯法（A）和最大似然法（B）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Bayes(A)and ML(B)trees constructed using ITS rDNA sequence data of Molineidae

從本世紀(jì)初開始，由蝙蝠攜帶的病原造成的人類重大傳染疾病事件已有多起，蝙蝠攜帶的病原對(duì)人畜均有潛在的感染性，雖然目前尚無蝙蝠寄生線蟲感染人類的病例，但由于社會(huì)發(fā)展和環(huán)境變化等因素的影響，新發(fā)寄生蟲病原不斷出現(xiàn)，且在免疫性疾病等因素的影響下，一些病原的易感人群規(guī)模逐漸擴(kuò)大[8]，導(dǎo)致一些人畜共患寄生蟲病未得到有效控制，在局部地區(qū)存在潛在的流行風(fēng)險(xiǎn)或者已經(jīng)開始蔓延[9]。廣州管圓線蟲病、異尖線蟲病、比翼線蟲病均由生食或半生食感染性蟲卵或感染性幼蟲的宿主或中間宿主而致病[10]。東南亞和我國的一些地區(qū)有食用蝙蝠的習(xí)慣，條件適宜的情況下就有可能造成蝙蝠寄生線蟲的感染引起寄生蟲病。雙叉刺圓線蟲這一新的潛在寄生蟲病病原的發(fā)現(xiàn)，為人畜寄生蟲病的預(yù)防和病原學(xué)檢測(cè)提供了參考依據(jù)。