蛋白質二硫鍵異構酶與α-突觸核蛋白的相互作用及對其聚集的影響

裴云山，張 偲，劉曉黎，成 凱，張則婷*，李從剛

1.中國科學院生物磁共振分析重點實驗室，波譜與原子分子物理國家重點實驗室（中國科學院 精密測量科學與技術創(chuàng)新研究院），湖北 武漢 430071；2.中國科學院大學，北京 100049

引 言

α-突觸核蛋白（α-synuclein，αsyn）是一種突觸前神經(jīng)元蛋白，在正常生理條件下以天然無結構可溶性的單體形式存在[1,2]．病理學研究表明，帕金森癥（Parkinson’s disease，PD）患者大腦中葉存在大量黑質神經(jīng)元路易小體（Lewy bodies，LB），其主要成分是異常聚集形成纖維的αsyn，這也將αsyn 與PD 等神經(jīng)退行性疾病密切關聯(lián)[3-9]．αsyn 含有140 個氨基酸殘基，按照氨基酸序列及其性質可以分為三個區(qū)域：（1）1～60 號殘基組成的N 端區(qū)域，此區(qū)域主要是膜、分子伴侶和其他蛋白質的結合位點[10-12]；（2）61～95 號殘基組成的非淀粉樣成分（non-amyloid component，NAC）區(qū)域，被認為是αsyn 聚集的必需區(qū)域[13]；（3）96～140 號殘基組成的C 端區(qū)域，該區(qū)域富含酸性氨基酸，是蛋白質、金屬離子和聚胺等的結合位點[14-16].

前期研究表明分子伴侶，如熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、熱激同源蛋白70（heat shock cognate 70，HSC70）、蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）等，能夠與αsyn 的N 端結合，防止αsyn 的錯誤折疊和異常聚集，尤其是PDI 甚至能反向解聚初步形成的αsyn 纖維[17]，這顯示了伴侶蛋白在阻止αsyn 聚集并調節(jié)αsyn 生理功能中起到重要作用[11,18-22]．PDI是一種多功能性應激蛋白，幾乎存在于所有組織細胞中，如神經(jīng)組織中的丘腦中腦細胞、視網(wǎng)膜細胞、上皮組織的腺上皮細胞等[23]．晶體結構顯示，PDI 的abb'xa'c 等結構域以U 型排列[24]．其中，同源結構域a 和a'都包含一個活性位點CGHC 基序，該位點主要負責催化氧化還原反應中二硫鍵的重排[25]；b 和b'同源結構域則形成一個大的疏水表面，主要負責識別與結合錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白[26]．在功能方面，PDI 是一種主要定位于內(nèi)質網(wǎng)的關鍵酶和伴侶蛋白[27]，負責催化內(nèi)質網(wǎng)中新生蛋白的二硫鍵氧化還原反應，并協(xié)助蛋白質的正確折疊[28,29]．PDI 還可以預防內(nèi)質網(wǎng)應激和蛋白質錯誤折疊相關的神經(jīng)毒性．有研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者的大腦中存在功能失調的S-亞硝基化PDI（SNO-PDI），亞硝基化修飾抑制了PDI 正常參與蛋白折疊反應，從而導致細胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)質網(wǎng)應激反應、蛋白質錯誤折疊等，進而引起神經(jīng)元細胞的死亡[23,30]．

有研究[31]表明，PDI 的a'結構域在體外能有效抑制αsyn 聚集，PDI 通過與αsyn 的N 端（尤其是His50 殘基）相互作用抑制αsyn 形成纖維[22]，但是PDI 識別αsyn 的機制仍不明確．雖然Yagi-Utsumi等[32]通過液體核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）及X 射線晶體衍射等手段闡述了Humicola insolensPDI（HiPDI）與人源αsyn 多肽的結合方式，但HiPDI 與人源PDI 在序列和結構上都存在著明顯的差異.因此研究人源伴侶蛋白PDI 識別αsyn 并影響其纖維化的機理仍至關重要.

NMR 技術是研究生物大分子間相互作用的有效方法[33,34]，比如液體NMR 技術能夠準確提供生物大分子間殘基水平的作用位點信息．本文利用NMR 方法和硫黃素T（thioflavin T，ThT）纖維化熒光實驗研究了人源PDI ab、PDI b'xa'和PDI 與αsyn 的相互作用及其對αsyn 聚集過程的影響，并采用NMR 滴定實驗檢測了αsyn 識別PDI b'xa'結構域的結合位點．基于以上結果通過HDOCK 在線平臺對接服務構建了PDI 結合αsyn 的分子模型，探討并提出了PDI 抑制αsyn 聚集的作用機理．本研究有助于我們進一步了解PD，從而為后續(xù)的疾病預防及治療提供一定的理論基礎．

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、K2HPO4、NaH2PO4、NaCl、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）購自國藥集團化學試劑有限公司；咪唑、2-嗎啉乙磺酸（MES）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、1,6-己二醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標記所需的同位素15NH4Cl 和鎖場溶劑D2O 均購于Cambridge Isotope Laboratories；αsyn 1-19 多肽MDVFMKGLSKAKEGVAAA 和αsyn 30-42 多肽AGKTKEGVLYVGS 均購于上海生工生物技術有限公司，基因測序由上海生工生物技術有限公司完成.

1.2 蛋白質樣品的制備

將人源αsyn 全長蛋白（簡稱αsyn）的編碼序列克隆到pT7-7 載體上，將N 端含His6-tag 和煙草蝕斑病毒蛋白酶（tobacco etch virus protease，TEV）酶切位點的人源PDI 全長蛋白（簡稱PDI）以及PDI b'xa'結構域蛋白（簡稱PDI b'xa'）的編碼序列克隆到pET-28a 載體上.通過單點突變的方法，成功獲得編碼含有完整N 端區(qū)域的αsyn 1-60 截短體蛋白（簡稱αsyn 1-60）以及PDI ab 結構域蛋白（簡稱PDI ab）的質粒.

將上述5種質粒通過熱激法轉化進BL21(DE3)大腸桿菌中，并分別于LB 培養(yǎng)基和含15NH4Cl同位素的M9培養(yǎng)基中表達非標記和15N標記的各種目的蛋白．在220 rpm、37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600達0.6～0.8 后，加入終濃度為1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl 1-thio-β-Dgalactopyranoside，IPTG）誘導6 h，以過量表達目的蛋白．

所有收集的菌液于高壓裂菌儀裂解，并在裂解前加入 PMSF 及蛋白酶抑制劑 cocktail（P2714-1BTL）防止目的蛋白降解．αsyn 及PDI b'xa'的純化方法參照文獻[35-38]；αsyn 1-60 經(jīng)SP陽離子交換柱（GE Healthcare）初步純化，并于Superdex 75 26/600 分子篩柱（GE Healthcare）進行細分離；PDI 先使用HiLoad Ni 親和柱（GE Healthcare）除去一部分雜蛋白，再上樣至Source Q（GE Healthcare）陰離子交換柱去除剩余大部分雜蛋白，最后上樣至Superdex 75 分子篩柱，純度達到NMR 實驗要求；PDI ab 通過Ni（GE Healthcare）柱和Superdex 75 分子篩柱兩步純化，純度達到95%以上．所有目的蛋白都脫鹽至超純水中，凍干備用．

根據(jù)280 nm 處的摩爾消光系數(shù)（Ext.Coefficient: 5 960、1 490、45 380、21 430、23 950 mol?1?cm?1對應于αsyn、αsyn 1-60、PDI、PDI ab 和PDI b'xa'），使用Nanodrop 2000 采集的紫外吸收強度標定各蛋白的濃度（https://web.expasy.org/protparam/），并經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行純度分析.

1.3 NMR 譜圖采集及數(shù)據(jù)處理

1H-15N HSQC 實驗樣品的制備：15N 標記的凍干αsyn 樣品溶于含20 mmol/L Hepes、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L TCEP，pH=7.0 的緩沖液中，并加入10% (v/v)的D2O，終濃度為0.1 mmol/L．采集1H-15N HSQC 譜圖后，再按等摩爾濃度比例加入非標記的PDI 或者PDI ab 或者PDI b'xa'等凍干蛋白并調整溶液pH，然后再次采集1H-15N HSQC 譜圖.

NMR 滴定實驗樣品的制備：15N 標記的凍干PDI b'xa'樣品溶于含20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L TCEP，pH=7.0 的緩沖液中，并加入10% (v/v)的D2O，終濃度為0.2 mmol/L．采集1H-15N TROSY 譜圖后，再以1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4 或1:5 的摩爾濃度梯度比例分別加入非標記αsyn 1-19 多肽或者αsyn30-42多肽或者αsyn 1-60 等凍干樣品，調整溶液pH 后再依次采集1H-15N TROSY 譜圖.

NMR 譜圖在配有5 mm TCI H-C/N-D CryoProbeTM超低溫探頭的Bruker Avance 850 MHz NMR譜儀上采集．1H-15N HSQC 實驗F2維和F1維譜寬分別為12 ppm 和28 ppm，譜中心分別為δH4.70和δN119.0；采樣點陣t2×t1=2 048×256，掃描次數(shù)ns=10；采樣溫度為288 K．1H-15N TROSY 實驗F2維和F1維譜寬分別為12 ppm和35 ppm，譜中心分別為δH4.70和δN119.0；采樣點陣t2×t1=2 048×256，ns=24；采樣溫度為303 K．譜峰指認依據(jù)BioMagResBank（entry number 16543 和59363）．二維NMR 數(shù)據(jù)通過NMRPipe[39]處理，使用Sparky[40]軟件分析．

化學位移擾動（chemical shift perturbations，CSPs）通過(1)式[41]計算：

ΔδH和ΔδN分別代表PDI b'xa' 加入αsyn 1-19 多肽或αsyn 30-42 多肽或αsyn 1-60 后的1H 和15N 化學位移偏移量.

結合常數(shù)KD由(2)式[42]擬合得到：

Δδ代表檢測CSPs 值；Δδmax代表擬合的最大化學位移變化值；[P]t代表PDI b'xa'的初始濃度，固定為0.2 mmol/L；[L]t代表滴加αsyn 1-19 多肽或αsyn 30-42 多肽或αsyn 1-60 的濃度，最高達1.0 mmol/L.

1.4 αsyn 聚集監(jiān)測的ThT 熒光實驗

將凍干的αsyn、PDI、PDI ab 和PDI b'xa'蛋白分別溶于纖維化緩沖液（含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、2 mmol/L TCEP、0.01% (w/v) NaN3，pH=7.5）中至終濃度為0.6 mmol/L，配置濃度為1.5 mmol/L 的ThT 儲液，并利用0.22 μm 濾膜除去可能殘留的不溶物及寡聚體大分子．按照αsyn:PDI /PDI ab/PDI b'xa' = 1:1 的摩爾比例配置αsyn+PDI、αsyn+PDI ab、αsyn+PDI b'xa'混合溶液，單獨αsyn 對照組加入等體積緩沖液．每個混合溶液體系體積為200 μL，再加入2 μL ThT 儲液使ThT終濃度約為15 μmol/L．將混勻后的溶液分別加入到底透黑邊的96 孔板中，每個樣品孔中再放置1 個直徑為2.5 mm 的干凈透明玻璃球助勻[43]，使用錫箔紙將96 孔板上層密封以防止長時間高溫揮發(fā)，蓋上蓋子后利用SpectroMax i3x 酶標儀（Molecular Devices）在37 ℃溫度下高速環(huán)形（orbital）震蕩500 s，之后每10 min 檢測一次ThT 熒光，激發(fā)波長為444 nm、發(fā)射波長為482 nm.纖維化聚集所需的半數(shù)時間t1/2等參數(shù)由(3)式[44]擬合得到：

其中，F(xiàn)(t)是根據(jù)實驗最高ThT 熒光強度歸一化后的熒光值，F(xiàn)0是歸一化后的樣品初始熒光值，A是擬合的到達平臺期時的最大歸一化熒光值，t是纖維生長時間，k代表對數(shù)期時纖維化生長速率常數(shù).t1/2經(jīng)Graphpad Prism 9 軟件的單因素方差統(tǒng)計方法分析.產(chǎn)生纖維的滯后期時長t1ag=t1/2?2/k.

2 結果與討論

2.1 αsyn N 端識別PDI 的b'xa'結構域的檢測

αsyn 作為天然無結構蛋白，其二維1H-15N HSQC 譜峰在1H 維的化學位移僅分布在7.7～8.5 ppm范圍內(nèi)，而15N 維信號仍正常分布在105～131 ppm 范圍內(nèi)．前期研究[22]顯示，人源分子伴侶PDI 與αsyn N 端結合．為研究PDI 與αsyn 相互作用時PDI 的識別位點，本文根據(jù)文獻[31,32]報道及序列分析將PDI 劃分并制備了PDI ab 和b'xa'兩個結構域蛋白[圖1(a)、(b)]，并分別作用于αsyn．1H-15N HSQC譜圖顯示，與加入PDI 的結果類似[圖1(d)]，15N 標記的αsyn 樣品中加入等量的PDI b'xa'后，位于N 端的交叉峰信號均產(chǎn)生明顯的化學位移擾動及譜峰強度減弱[圖1(e)、(f)]，表明PDI b'xa'同樣結合于αsyn 的N 端前20 個殘基和Tyr39 位點附近約10 個殘基區(qū)域，與文獻[11,22]報道的PDI 等伴侶蛋白結合于αsyn 的N 端結果一致.值得注意的是，αsyn 滴加PDI 后會導致溶液pH 發(fā)生變化，如果不調節(jié)pH，His50 殘基信號會產(chǎn)生明顯化學位移擾動（調節(jié)前約δH8.36/δN125.0，調節(jié)后約為Hδ8.41/δN125.3）．而如果控制pH 變化在0.1 以內(nèi)，His50 的交叉峰既沒有明顯化學位移的變化，也沒有信號強度的降低，這表明在溶液pH 穩(wěn)定時，PDI 及PDI b'xa'不結合αsyn 的His50 殘基，His50殘基可作為反應過程中的pH 探針[45]．我們推測，文獻[22]中αsyn 出現(xiàn)的His50 殘基化學位移擾動可能是由于加入PDI 后，溶液（20 mmol/L PBS，pH 6.0）pH 值變化導致．另外，與PDI 相互作用的αsyn 的區(qū)域與通過優(yōu)化最適疏水性（Optimized Matching Hydrophobicity，OMH）法[46]序列疏水性預測得到的疏水區(qū)域較為吻合[圖1(g)].

圖1 PDI 的b'xa'結構域與αsyn 的N 端區(qū)域相互作用.PDI（紅色）的(a)一級序列模型及(b)晶體結構（PDB ID: 4EKZ）表面圖，粉色和藍色分別代表PDI ab 與PDI b'xa'結構域；(c) SDS-PAGE 分析各蛋白純度，1～5 泳道分別代表αsyn1-60、αsyn、PDI ab、PDI b'xa'、PDI，M 代表Marker；(d)、(e) αsyn 不加（黑色）與加入等量PDI（紅色）或PDI b'xa'（藍色）的譜圖疊加，圖中標注了明顯發(fā)生信號減弱或移動的殘基；(f)加入等量PDI（紅色）、PDI ab（粉色）、PDI b'xa'（藍色）后，αsyn 譜峰強度變化（I/I0）；(g)基于OMH 法預測αsyn 序列疏水性分析圖，互作區(qū)域或疏水性較強的區(qū)域用灰色標出Fig.1 The b'xa' domain of PDI interacts with N-terminal domain of αsyn.(a) Model for PDI (red) primary sequence, PDI ab domain(pink) and PDI b'xa' domain (blue) are shown underneath.(b) Surface crystal structure of human PDI (PDB ID: 4EKZ).(c) Protein purities analyzed by SDS-PAGE.M, Marker; lane 1, αsyn1-60; lane 2, αsyn; lane 3, PDI ab; lane 4, PDI b'xa'; lane 5, PDI.(d) and (e) Spectral overlay of αsyn in the absence (black) and presence of equivalent amount of PDI (red) and PDI b'xa' (blue).Residues showing significant signal attenuation or shifts were marked.(f) Residue-resolved attenuation (I/I0) of αsyn in the presence of PDI (red), PDI ab (pink) and PDI b'xa' (blue).(g) Hydrophobic residues of αsyn predicted by OMH method, the binding and hydrophobic areas are colored gray

但對比譜峰強度減弱程度可以發(fā)現(xiàn)，αsyn 結合PDI b'xa'的強度弱于PDI．同時我們發(fā)現(xiàn)，在加入PDI ab 后，譜峰不發(fā)生明顯變化，說明PDI 的ab 區(qū)域不會與αsyn 結合[圖1(f)]．

2.2 PDI b'xa'抑制αsyn 聚集的ThT 熒光實驗

ThT 熒光實驗是目前體內(nèi)外研究淀粉樣蛋白纖維化過程最流行的手段之一[47]．它利用游離的ThT 染料結合纖維化過程中淀粉樣蛋白所形成的β片層后熒光強度大幅增強的特性來實時監(jiān)測纖維的生長過程[48]．我們采用ThT 熒光實驗研究了PDI 各結構域與αsyn 相互作用對其聚集形成纖維這一過程的影響．

如圖2所示，對照組αsyn 在約6 h 后逐漸形成纖維；約10 h 后達到半數(shù)平臺期水平；約21 h后到達平臺期．而加入PDI 后，其產(chǎn)生纖維的滯后期時長tlag及達到半數(shù)平臺期水平時長t1/2均延長至超過3 倍，分別為約24 h 及35 h．纖維動力學曲線圖及t1/2統(tǒng)計分析顯示PDI 能有效抑制αsyn 纖維的形成，與文獻[17,22,31,49]報道的PDI 抑制αsyn 纖維化的結論一致．而加入PDI ab 的纖維生長曲線與對照組幾乎一致，t1/2統(tǒng)計分析也表明二者沒有明顯差異．但是加入PDI b'xa'后，αsyn 纖維化生長曲線顯著被延后，具體表現(xiàn)為tlag由約6 h 延長至約13 h，t1/2增長至約23 h．說明PDI b'xa'對αsyn 的聚集也有明顯的抑制作用，抑制效果約為2 倍，具體參數(shù)如表1所示．但是，此抑制效果與PDI 相比，也顯現(xiàn)出不可忽略的差異（圖2）．

圖2 ThT 熒光實驗檢測PDI、PDI ab 及PDI b'xa'對αsyn 聚集的影響.(a) αsyn 不加（黑色）和加入等量PDI ab（粉色）、PDI b'xa'（藍色）、PDI（紅色）后的纖維生長動力學曲線；(b)由動力曲線擬合得到的纖維生長達半數(shù)平臺期所需時間t1/2 及其統(tǒng)計分析，ns 表示無明顯差異，****表示p<0.0001；圓點表示四組平行實驗所求得的數(shù)值Fig.2 The effect on αsyn aggregation of PDI, PDI ab and PDI b'xa' detected by ThT experiment.(a) Aggregations kinetics of αsyn in the absence (black) and presence of equimolar PDI ab (pink), PDI b'xa' (blue) and PDI (red).(b) The fitted half-time (t1/2) values of aggregation and their statistical analysis.ns: not significant, ****: p < 0.0001; the dots represent the values obtained from four parallel experiments

表1 纖維化生長參數(shù)Table 1 Aggregation kinetics data

以上結果也表明，PDI 的ab 結構域不與αsyn 相互作用，也不影響αsyn 的聚集．PDI 的b'xa'結構域結合αsyn 的N 端兩個區(qū)域，同時也表現(xiàn)出對αsyn 聚集的抑制.這與PDI 類似，但PDI b'xa'與αsyn 相互作用的強度以及對αsyn 聚集的抑制程度均不及PDI．相互作用與纖維化抑制作用同步的現(xiàn)象表明PDI 通過b'xa'結構域與αsyn 相互作用來影響αsyn 的纖維化過程．

2.3 PDI b'xa'蛋白通過疏水空腔識別αsyn N 端區(qū)域

為了進一步研究αsyn 與PDI b'xa'作用的位點，我們將不同濃度的αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽加入至15N 標記的PDI b'xa'溶液中，進行了NMR 滴定實驗．實驗結果顯示，逐漸加入αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽過程中，PDI b'xa'的TROSY 譜圖中部分交叉峰逐漸出現(xiàn)化學位移變化，這些氨基酸殘基的表觀化學位移為總體化學位移的加權平均，說明PDI b'xa'與αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽的相互作用在液體NMR 的時間尺度上屬于快交換[圖3(a)、(d)]．進一步分析PDI b'xa'譜產(chǎn)生的CSPs 分布發(fā)現(xiàn)，與αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽結合的區(qū)域為PDI 的b'結構域．將上述CSPs 值大于閾值（平均值+標準差）的氨基酸殘基標注在PDI b'xa'三維結構上，發(fā)現(xiàn)αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽主要結合于PDI b'結構域的I289、I291、I301、L302、I318、L320 等殘基形成的疏水空腔上，另有少數(shù)殘基分散在x linker 及a'結構域表面[圖3(b)、(e)]．

圖3 PDI b'xa'與αsyn N 端相互作用的NMR 檢測.PDI b'xa'（紅色）加入（藍色）αsyn 1-19 多肽(a)、αsyn 30-42 多肽(d)、αsyn 1-60蛋白(g)的1H-15N TROSY 譜圖，選取E239 殘基展示PDI b'xa'加入各底物后全局殘基化學位移變化；PDI b'xa'加入αsyn 1-19 多肽(b)、αsyn 30-42 多肽(e)、αsyn 1-60 (h)后的CSPs 柱狀圖，以及根據(jù)CSPs 隨底物αsyn 1-19 多肽(c)、αsyn 30-42 多肽(f)、αsyn 1-60 (i)濃度變化擬合計算解離常數(shù).柱狀圖中用CSPs 的（平均值+標準差）作為閾值，高于閾值的殘基標注在二維譜中，并在b'xa'的晶體結構表面用紅色標記；上述高于閾值的殘基通過全局擬合得到相應解離常數(shù)，離散的擾動殘基通過以（平均值+2×標準差）為閾值驗證并去除Fig.3 NMR results showing the interaction between PDI b'xa' with the N-terminal domain of αsyn.Overlaid 1H-15N TROSY spectra of PDI b'xa' (red) with (blue) αsyn 1-19 (a), αsyn 30-42 (d) or αsyn 1-60 (g).E239 were selected as representative residues for global chemical shift perturbations (CSPs) during NMR titration.Residue-resolved CSPs of PDI b'xa' during titrations with αsyn 1-19(b), 30-42(e) and 1-60 (h).KD values were fitted from curves of residues with significant CSPs, as a function of αsyn 1-19(c), αsyn 30-42(f), and αsyn 1-60 (i) concentration.Residues showing significant CSPs were marked in spectra and mapped red on the crystal structure surface of PDI b'xa'.Threshold level was indicated as ‘mean+standard deviation’.Disperse residues were verified and removed by the threshold of ‘mean +2×standard deviation’

將上述殘基的化學位移隨滴定濃度作曲線并通過全局擬合得到αsyn 1-19 以及αsyn 30-42 多肽結合PDI b'xa'的親和力.結果顯示αsyn 1-19 多肽結合PDI b'xa'的解離常數(shù)KD約為67.7±9.1 μmol/L，αsyn 30-42 多肽結合PDI b'xa'的KD約為136.3±16.0 μmol/L [圖3(c)、(f)]，這表明αsyn 的1-19 區(qū)域結合PDI b'xa'的親和力稍強于30-42 區(qū)域．此外，我們構建了含有完整N 端區(qū)域的αsyn 1-60，并研究了其與PDI b'xa'的相互作用．實驗結果顯示，PDI b'xa'與αsyn 1-60 仍表現(xiàn)為快交換的相互作用[圖3(g)]，并且兩者的結合位點仍集中在PDI 的b'結構域的疏水空腔[圖3(h)]，其解離常數(shù)KD為185.3±14.2 μmol/L [圖3(i)]．

對比αsyn 1-19 多肽，αsyn 30-42 多肽滴定時，PDI b'xa'的Thr453 殘基附近產(chǎn)生明顯擾動，表明PDI 在行使伴侶功能的過程中，可能需要a'結構域（如Thr453 附近的殘基）輔助b'結構域的疏水口袋結合αsyn 底物．PDI b'xa'結合αsyn 1-60 的結果顯示，Thr453 附近仍存在擾動，但程度略輕于αsyn 30-42 多肽．這可能是1-19 號殘基區(qū)域與30-42 號殘基區(qū)域均競爭性結合PDI b'疏水口袋，但由于1-19 號殘基區(qū)域結合PDI b'xa'的親和力強于30-42 號殘基區(qū)域，因此在αsyn 1-60 結合PDI b'xa'時，主要表現(xiàn)為1-19 號殘基區(qū)域與PDI b'xa'的相互作用，而30-42 號殘基區(qū)域的Thr453 附近的氨基酸殘基結合PDI b'xa'的概率相應減少，最終表現(xiàn)出Thr453 附近的化學位移擾動減少的現(xiàn)象．這些推論仍需在后續(xù)研究中進行確認．

2.4 討論

我們的研究結果顯示，PDI 和PDI b'xa'結合αsyn 較為疏水的前20 個殘基和Tyr39 附近區(qū)域[圖1(f)～(g)]．ThT 熒光實驗顯示PDI 和PDI b'xa'均能有效抑制αsyn 聚集，而PDI ab 在溶液中與αsyn沒有相互作用（圖2）．Cheng 等[31]的研究表明，PDI 的c 端截短變體PDI-c 對αsyn 纖維的抑制作用與PDI 一致．結合PDI b'xa'對αsyn 的親和力以及對聚集的抑制作用都不及PDI 等結果，表明在PDI 結合αsyn 過程中，雖然ab 結構域及c 端不參與αsyn 的直接相互作用，但是它們可能增強b'xa'結構域與αsyn 的結合并促進其對αsyn 聚集的抑制作用.這種促進作用可能源于ab 結構域對b'xa'結構域疏水口袋的保護和穩(wěn)定作用[50]，從而使得PDI 比PDI b'xa'更穩(wěn)定且高效結合底物蛋白αsyn，并使其表現(xiàn)出更強的聚集抑制作用．

結合NMR 滴定實驗結果和還原型人源PDI 晶體結構（PDB ID: 4EKZ），我們使用HDOCK 服務[51]對接得到PDI 與αsyn1-40 的結合模型如圖4(a)所示．最佳對接模型中，PDI 主要通過b'上的疏水空腔結合αsyn N 端區(qū)域．對接模型的局部放大圖顯示，αsyn1-40 蛋白以1～8 號和37～40 號的疏水氨基酸殘基將PDI b'上的疏水口袋完全占據(jù)，與我們提出的PDI 結合αsyn 的方式為疏水相互作用相吻合．Yagi-Utsumi 等[32]的研究結果顯示，結合人源αsyn31-41 多肽時，HiPDI b'xa'以氧化態(tài)形式參與反應，還原態(tài)則不能結合底物．而本研究顯示，人源PDI 及PDI b'xa'在還原條件下均能有效結合αsyn 并抑制其聚集．然而，由于人源氧化態(tài)PDI 及PDI b'xa'較還原條件下更易發(fā)生多聚[24]，導致無法獲得高質量的NMR 譜圖，因此本研究未對氧化態(tài)PDI 與αsyn 的相互作用展開研究．由于HiPDI 比人源PDI b'結構域的疏水空腔面積小，且序列比對結果顯示HiPDI 與人源PDI 的序列相似度不高，疏水口袋b'區(qū)域（237～347 號氨基酸殘基）序列相似度僅為31.5%．因此結合αsyn 多肽時，氧化態(tài)HiPDI 參與相互作用的關鍵殘基分布與人源PDI 也有所差別[圖4(b)]．但是HiPDI 仍通過b'結構域疏水殘基參與αsyn 多肽的相互作用[32]，與本研究中人源PDI 通過b'結構域的疏水空腔結合αsyn 的結果相似（圖4），表明兩種不同來源的PDI 都以疏水相互作用結合αsyn 底物．

圖4 PDI 與αsyn N 端的疏水結合模式.(a) PDI 結合αsyn 1-40 多肽的對接模型（左）及其結合區(qū)域的局部放大圖（右），HDOCK對接實驗在網(wǎng)站服務器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）上運行，上傳人源PDI 晶體結構，αsyn1-40 序列及NMR 滴定鑒定的結合位點，最佳對接結果使用PyMol 軟件作圖，PDI 表面結構呈灰色，疏水口袋以紅色標出，αsyn1-40 卡通結構呈品紅色，右圖中參與結合的αsyn 殘基以棒狀模式顯示并標出．(b)人源PDI b'xa'與HiPDI b'xa'的氨基酸序列比對．序列一致性和相似性由Clustalw[52]和ESPript 3.0[53]分析所得，相似氨基酸（黑色字母填充黃色方框）以及相同氨基酸（白色字母填充紅色方框）分別被標出，頂部標注人源PDI b'xa'二級結構區(qū)域，藍色和綠色星號分別表示αsyn 結合人源PDI 和HiPDI 的關鍵疏水氨基酸殘基Fig.4 Hydrophobic binding mode of PDI with the N-terminal domain of αsyn.(a) Docking model of PDI binding αsyn1-40 (left panel)and a local zoom view of binding area (right panel).The relevant residues of αsyn1-40 involving in binding PDI were depicted as magenta sticks.HDOCK experiments were performed on the web server (http://hdock.phys.hust.edu.cn/) by uploading human PDI crystal structure,amino acid sequences of αsyn1-40 and their binding sites identified by NMR titration.Optimal docking results were plotted with PyMol software, PDI molecular surface was colored gray and its hydrophobic pocket was marked in red, the magenta cartoon represented αsyn1-40 structure.(b) Alignment of amino acid sequence of human PDI b'xa' from HiPDI b'xa'. Sequence identity and similarity were calculated by Clustalw[52] and ESPript 3.0[53].Similar amino acids were showed as black letters in yellow boxes and identical amino acids were showed as white letters in red boxes.The secondary structural domains were indicated on the top of the sequences.Blue and green asterisks represented the key hydrophobic residues of αsyn interacting with human PDI and HiPDI, respectively

文獻[54]顯示，Tyr39 位點附近的區(qū)域被認為是αsyn 聚集過程中的主控單元，缺少或突變Tyr39位點附近區(qū)域中的位點影響αsyn 的聚集，結合本研究，我們認為PDI 抑制αsyn 纖維化聚集的主要機制在于PDI b'xa'通過b'結構域上I289、I291、I301、L302、I318、L320 等疏水氨基酸殘基形成的疏水空腔結合αsyn 的N 端的兩個區(qū)域，這種相互作用可能減少了αsyn 單體間的接觸幾率，也減弱主控單元Tyr39 附近區(qū)域對αsyn 聚集的控制作用，進而抑制了αsyn 的纖維化．

3 結論

本文通過液體NMR 技術研究了伴侶蛋白PDI 與αsyn 的相互作用，發(fā)現(xiàn)與αsyn 相互作用的區(qū)域是PDI 的b'xa'結構域．ThT 熒光實驗顯示PDI b'xa'能夠抑制αsyn 的聚集．NMR 滴定實驗結果顯示PDI 識別αsyn 并與其相互作用的位點主要位于PDI b'結構域上I289、I291、I301、L302、I318、L320 等殘基形成的疏水口袋．另外，我們通過HDOCK 對接構建了人源PDI 結合αsyn N 端區(qū)域的模型．本文還提出了人源伴侶蛋白PDI 通過b'xa'結構域疏水結合αsyn N 端區(qū)域從而抑制其纖維化聚集的機制．這一研究為理解伴侶蛋白與αsyn 的相互作用以及伴侶蛋白抑制αsyn 蛋白聚集提供了實驗依據(jù)．

致謝

感謝國家自然科學基金（21673284，21773300）的支持.

利益沖突

無