基于RP-HPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同品種木豆葉質(zhì)量及主要成分含量測(cè)定

符麗娜，王立濤，王建棟，王燕秋，蔡子輝，閆鑫宇，趙棚權(quán)，張 謖，付玉杰

基于RP-HPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同品種木豆葉質(zhì)量及主要成分含量測(cè)定

符麗娜，王立濤，王建棟，王燕秋，蔡子輝，閆鑫宇，趙棚權(quán)，張 謖，付玉杰*

北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083

基于RP-HPLC-DAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，評(píng)價(jià)不同品種木豆葉質(zhì)量特征的共有性和差異性，為木豆葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。通過RP-HPLC-DAD建立13個(gè)不同品種木豆葉的RP-HPLC-DAD指紋圖譜，進(jìn)行相似度分析（similarity analysis，SA），結(jié)合聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）對(duì)木豆葉質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并對(duì)樣品中6種主要成分進(jìn)行含量測(cè)定。木豆葉RP-HPLC-DAD指紋圖譜共標(biāo)定13個(gè)共有峰，13個(gè)品種木豆葉的相似度均在0.90以上，通過HCA可將這13個(gè)品種的木豆葉分為5類。PCA與HCA結(jié)果基本一致，經(jīng)過PCA分析發(fā)現(xiàn)S8的綜合得分最高，質(zhì)量最好，其次是S9和S12。PLS-DA與PCA結(jié)果基本一致，不同品種木豆葉的化學(xué)成分差異主要由7、10、6、9、11號(hào)5個(gè)色譜峰引起的。S8、S9和S12的含量處于前3，與PCA分析的綜合得分一致。指紋圖譜結(jié)合HCA、PCA和PLS-DA可以全面的評(píng)價(jià)木豆葉質(zhì)量，為木豆葉的質(zhì)量控制提供全面的參考。

木豆葉；指紋圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；聚類分析；主成分分析；最小二乘判別分析；葒草苷；異牡荊苷；牡荊苷；木犀草苷；質(zhì)量評(píng)價(jià)

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，搭配二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；勻質(zhì)機(jī)（廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW型萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Multifuge×1R高效速凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；Cascada III.I5型超純水系統(tǒng)（北京頗爾過濾器有限公司）。

1.2 材料

表1 木豆葉品種信息

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精確稱取1 g木豆葉樣品，置于錐形瓶中，加50 mL 70%乙醇，高速勻質(zhì)1 min，超聲30 min提取1次，超濾或離心后用70%乙醇定容至50 mL，取上清液用0.22 μm的濾膜濾過備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～10 min，20% B；10～20 min，20%～65% B；20～40 min，65%～80% B；40～45 min，80%～20% B；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，色譜圖見圖1。

1-葒草苷 2-異牡荊苷 3-牡荊苷 4-木犀草苷 5-球松素 6-木豆酸

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批木豆樣品S8（LP-1）1 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積值，均以球松素為參比峰，測(cè)得S8樣品13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批木豆樣品S8（LP-1）1 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，在室溫放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，記錄峰面積值，以球松素為參比峰，測(cè)得S8樣品13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于4.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于10.0%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批木豆樣品S8（LP-1）1 g，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下的方法分別制備6份平行供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積值，以球松素為參比峰，測(cè)得S8樣品13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%。

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜的生成及共有峰的確定

取13個(gè)不同品種的木豆葉，分別按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到13個(gè)品種木豆葉的色譜圖。將這13個(gè)不同品種木豆葉的色譜圖以AIA格式導(dǎo)入由國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版），以S9號(hào)樣品的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.9 s，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后生成木豆葉指紋圖譜的共有模式，13個(gè)品種木豆指紋圖譜疊加圖共標(biāo)定共有峰13個(gè)（圖2）。

5-葒草苷 6-異牡荊苷 7-牡荊苷 8-木犀草苷 11-球松素 13-木豆酸

3.2 相似度（similarity analysis，SA）評(píng)價(jià)

如表2所示，13個(gè)品種木豆與對(duì)照指紋圖譜的相似度見表2，均在0.90以上，說明各品種木豆間相似度良好。

3.3 聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）

以木豆樣品中13個(gè)共有峰的峰面積為變量，得到13×13階原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用SPSS 19.0軟件，采用組間連接法，以歐式平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)13個(gè)品種木豆樣品進(jìn)行HCA分析。當(dāng)分類距離為15時(shí)，13個(gè)品種木豆樣品可聚為5類，S4、S8、S12分別單獨(dú)聚為1類，S3、S6、S11聚為1類，剩余品種聚為1類（圖3）。

表2 13個(gè)木豆品種HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

圖3 13個(gè)品種木豆指紋圖譜HCA分析的樹狀圖

3.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

以木豆樣品中13個(gè)共有峰的峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行PCA分析，提取得到5個(gè)主成分，其特征值λ均＞1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為88.614%＞85%，可以代表樣品88.614%的信息（表3），因子載荷矩陣見表4。第1主成分的信息主要來自于8、10、12和13號(hào)色譜峰；第2主成分信息主要來自3和10號(hào)色譜峰；第3主成分信息主要來自2和9號(hào)色譜峰；第4主成分信息主要來自7號(hào)色譜峰；第5主成分信息主要來自1號(hào)峰。用SPSS 19.0進(jìn)行因子分析時(shí)，得到的是因子載荷矩陣，未經(jīng)過旋轉(zhuǎn)，計(jì)算主成分得分時(shí)，需要用未旋轉(zhuǎn)的因子載荷矩陣的系數(shù)除以對(duì)應(yīng)成份特征根的平方根作為指標(biāo)的系數(shù)權(quán)重，即特征向量。特征向量由因子載荷矩陣以及特征值λ計(jì)算而來，即i＝i/i1/2，求得特征向量（表5）。

表3 木豆葉主成分分析特征值和方差貢獻(xiàn)率

表4 因子載荷矩陣

以1、2、3、4、5代表5個(gè)主成分作為13個(gè)品種木豆樣品成分所表達(dá)的信息，以標(biāo)準(zhǔn)化的共有峰峰面積（A1～A13）為變量，建立起品質(zhì)評(píng)價(jià)模型，計(jì)算其綜合得分。1＝0.2091－0.2662＋0.1203－0.3724＋0.1995－0.3646＋0.1397＋0.3648＋0.2169＋0.33510＋0.09911＋0.32112＋0.36913；2＝0.1991－0.2572＋0.3423＋0.2884－0.3885＋0.2616－0.1497＋0.1418－0.3079＋0.35910－0.46811＋0.10812＋0.12213；3＝0.1471＋0.4052＋0.1453＋0.1884－0.4055＋0.2656＋0.1437－0.1768＋0.3719－0.03510＋0.34711＋0.33312＋0.31813；4＝0.1081＋0.2202＋0.1363－0.1134＋0.2395＋0.1056＋0.7707－0.2208－0.4199＋0.10210－0.11211－0.00212＋0.02413；5＝0.6721－0.0342＋0.2443＋0.1244＋0.0285＋0.0336＋0.0847＋0.2578－0.1369－0.07210＋0.27511－0.41712－0.35413；綜合得分＝（34.327%1＋18.335%2＋15.253%3＋10.049%4＋8.649%5）/86.614%，結(jié)果見表6。S8、S12和S9得分最高。為進(jìn)一步分析13個(gè)品種木豆樣品間的組間差距，將木豆樣品中11個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件繪制PCA得分圖，見圖4。13個(gè)品種木豆被分為5類，與HCA結(jié)果基本一致，樣品之間的離散程度較大，表明樣品差異性較大。

表5 成分的特征向量

表6 木豆葉主成分得分及排名

圖4 13個(gè)木豆葉品種的PCA得分圖

3.5 最小二乘判別分析 (partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)

在PCA分析提取得到5個(gè)主成分的基礎(chǔ)上，建立有監(jiān)督模式PLS-DA模型。PLS-DA得分圖如圖5所示，13個(gè)木豆品種分成5組，該結(jié)果與PCA結(jié)果一致，說明不同品種的木豆化學(xué)成分均存在差異。根據(jù)變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）圖（圖6）可知，VIP＞1的色譜峰有7、10、6、9、11號(hào)峰，說明不同品種木豆葉的化學(xué)成分主要是由上述成分引起的。

3.6 不同品種木豆葉中主成分含量比較

圖5 13個(gè)木豆葉樣品PLS-DA得分圖

圖6 13個(gè)木豆葉樣品VIP值圖

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n = 3)

4 討論

不同品種的木豆葉所具有的化學(xué)成分各有差異，進(jìn)而影響其藥效，因此有必要建立一種可靠的木豆葉質(zhì)量控制方法。本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，以峰數(shù)和分離度為指標(biāo)，將樣品在286～335 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，分別考察了254、286、335 nm波長(zhǎng)下的色譜峰，結(jié)果286 nm下的色譜峰分離效果最好，因此確定286 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。依據(jù)此色譜方法建立起木豆葉的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)13個(gè)品種木豆葉的相似度均在0.9以上，說明這些木豆葉中化學(xué)成分的種類相差不大，但在含量上存在一定差異。

隨著人們對(duì)中藥需求量的增大以及用藥安全意識(shí)的加強(qiáng)，中藥質(zhì)量控制越顯重要。指紋圖譜作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的模式，可用于評(píng)價(jià)藥材的一致性和穩(wěn)定性，以其科學(xué)的理論依據(jù)獲得了國(guó)際上的一致認(rèn)可[20]。指紋圖譜在色譜峰未明確為何種成分的情況下，仍能給出充分、可靠的信息，用以控制中藥材質(zhì)量[21]。本研究所建立的RP-HPLC-DAD指紋圖譜、HCA、PCA以及PLS-DA的結(jié)果不僅可以為木豆葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)的方法，也為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of differentleaves based on RP-HPLC-DAD fingerprint combined with chemometrics and determination of main components

FU Li-na, WANG Li-tao, WANG Jian-dong, WANG Yan-qiu, CAI Zi-hui, YAN Xin-yu, ZHAO Peng-quan, ZHANG Su, FU Yu-jie

College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

To evaluate the commonality and difference ofleaves based on RP-HPLC-DAD fingerprints combined with chemometric methods, providing a scientific basis for the quality evaluation ofleaves.The RP-HPLC-DAD fingerprints of 13 different species ofleaves were established by RP-HPLC-DAD. The quality ofleaves. was evaluated by similarity analysis (SA), hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and partial least square discriminant analysis (PLS-DA) and six main components in the sample were determined by RP-HPLC-DAD.The HPLC fingerprint ofleaves was calibrated with 13 common peaks, and the similarity of them were all above 0.90. These 13 species ofleaves were divided into five categories by HCA. The results of PCA and HCA were basically consistent. According to PCA, S8 had the highest comprehensive score and the best quality, followed by S9 and S12. The results of PLS-DA and PCA were basically consistent. The differences in composition ofleaves were mainly caused by chromatographic peaks 7, 10, 6, 9, and 11. The content of S8, S9 and S12 were among the top 3, which was consistent with the comprehensive score of PCA.Fingerprint combined with HCA, PCA and PLS-DA can comprehensively evaluate the quality ofleaves and provide a comprehensive reference for quality control ofleaves.

leaves of(L.) Millsp; fingerprint; chemometrics; cluster analysis; principal component analysis; partial least square discriminant analysis; orientin; isovitexin; vitexin; luteoloside;quality evaluation

R286.2

A

0253 - 2670(2022)24 - 7880 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.025

2022-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31930076）；通絡(luò)生骨膠囊品質(zhì)提升研究（2020HXFWLXY001）

符麗娜（1997—），女，碩士，研究方向?yàn)樯种参镔Y源開發(fā)與利用。Tel: 13121888511 E-mail: 1315136640@qq.com

付玉杰，博士生導(dǎo)師，教授，從事森林資源活性成分提取分離與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。Tel: (010)62926233 E-mail: yujie_fu@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]