基于代謝組學(xué)技術(shù)探討鱉血柴胡“清肝退熱”作用的“物質(zhì)-效應(yīng)”機制

寧艷梅，任 遠(yuǎn)*，吳國泰，王瑞瓊，段海婧，張金保，吳平安，竇翰辰，王 蕊

基于代謝組學(xué)技術(shù)探討鱉血柴胡“清肝退熱”作用的“物質(zhì)-效應(yīng)”機制

寧艷梅1, 2，任 遠(yuǎn)1, 2*，吳國泰1, 2，王瑞瓊1, 2，段海婧1, 2，張金保1, 2，吳平安1, 3，竇翰辰1，王 蕊1

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

基于代謝組學(xué)技術(shù)探討鱉血柴胡炮制前后“物質(zhì)-效應(yīng)”變化，闡釋炮制對其“清肝退熱”作用的影響。通過中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，闡釋物質(zhì)基礎(chǔ)變化與“清肝退熱”作用相關(guān)性；通過2,4-二硝基苯酚致發(fā)熱大鼠模型及肝臟代謝組學(xué)評價鱉血柴胡的解熱作用，闡釋效應(yīng)變化與“清肝退熱”作用相關(guān)性。鱉血柴胡炮制前后的物質(zhì)基礎(chǔ)變化，在中醫(yī)證候?qū)W上更側(cè)重影響肝經(jīng)，與風(fēng)熱、火熱、濕熱、血熱等熱證呈現(xiàn)證素相關(guān)性。解熱藥效學(xué)顯示鱉血柴胡具有與生柴胡相似的解熱作用，并對發(fā)熱過程中的肝臟代謝物的影響較顯著，具有肝臟損傷保護的優(yōu)勢?！拔镔|(zhì)-效應(yīng)”的代謝組學(xué)變化顯示，炮制可促進(jìn)鱉血柴胡“清肝退熱”的綜合作用。

柴胡；鱉血；炮制；代謝組學(xué)；功效；清肝退熱

柴胡為傘形科植物柴胡DC.或狹葉柴胡Willd.的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”和“南柴胡”，藥性苦、辛，微寒，主入肝、膽、肺經(jīng)，功效解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣[1]，為中醫(yī)傳統(tǒng)解表退熱的藥物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[2]。柴胡具有多種炮制品，如醋柴胡、酒柴胡、鱉血柴胡等[3]，以鱉血柴胡尤為特色，古人期望以鱉血陰液之性，增強柴胡清肝退熱之效[3]。鱉血柴胡為江西樟樹幫地方炮制沿用[4]，但這種用藥的地域化也造成了其使用的局限性[5]，內(nèi)在炮制機制的科學(xué)價值闡釋對其合理推廣應(yīng)用具有實際意義。

中藥炮制機制是用于闡明中藥炮制的目的以及中藥炮制后對機體產(chǎn)生的作用，即解決中藥為什么要炮制的問題[6]。中藥所含成分在輔料與炮制工藝的共同作用下，發(fā)生“質(zhì)”和“量”上復(fù)雜的化學(xué)變化，并成為中藥炮制前后性味、功能改變的重要原因[7-8]?；谳o料作用的炮制增效減毒機制研究重在闡明加輔料炮制后所引起的成分變化及該變化對藥理效應(yīng)的影響，包括中藥的化學(xué)成分/組分構(gòu)成與藥效、傳統(tǒng)功效之間的潛在關(guān)系?，F(xiàn)代研究對鱉血柴胡的化學(xué)成分規(guī)律有所闡釋，如皂苷類成分[9]、揮發(fā)性成分[10]和多糖類成分[11]等，但相對全面的成分變化解析才能更好地解釋炮制機制[12]。

代謝組學(xué)旨在識別生物系統(tǒng)內(nèi)源性代謝物在內(nèi)在和外在因素影響下的變化，傾向于一系列事件的最終結(jié)果[13-14]，利用代謝組學(xué)的方法，可以篩選出所有與藥效作用有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并對與之相關(guān)的代謝途徑進(jìn)行分析，從整體出發(fā)，探究中藥炮制增效的內(nèi)在原因。因此本研究以代謝組學(xué)技術(shù)為主要研究策略，通過炮制前后物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效變化機制，探究炮制對鱉血柴胡“清肝退熱”作用的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，6～7周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心，實驗動物許可證號SCXK（甘）2011-0001-6200100000050。動物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心的SPF級實驗動物中心，飼養(yǎng)區(qū)通風(fēng)良好，室溫18～25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h光照/黑暗交替，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。動物實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2022-127）。中華鱉購自甘肅省蘭州市灘尖子農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 藥材

柴胡飲片（批號20210601）購自甘肅省蘭州市安寧區(qū)醫(yī)藥公司，由隴西縣百寶藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)王明偉副教授鑒定為傘形科植物北柴胡DC.的干燥根，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

LC-MS級甲醇、乙腈、甲酸購自NW Technologies；-2-氯苯丙氨酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海恒柏生物科技有限公司；阿司匹林腸溶片（2 mg/片，批號13010441）購自山西晉新雙鶴藥業(yè)有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號MM-0047R2）、大鼠IL-6 ELISA試劑盒（批號MM-0190R2）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號MM-0180R2）、大鼠環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）ELISA試劑盒（批號MM-0549R2）、大鼠精氨酸加壓素（antidiuretic hormone，AVP）ELISA試劑盒（批號MM-20932R2）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；2,4-二硝基苯酚購自中國華東師范大學(xué)化工廠。

1.4 儀器

Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple TOF 5600型高分辨質(zhì)譜（AB Sciex公司）；7890A型氣相色譜儀（美國Agilent公司）；PEGASUS HT型質(zhì)譜儀（LECO公司）；Heraeus Fresco17型離心機、Forma 900 series型超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA124S-CW型天平、BT125D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；JXFSTPRP-24型號研磨儀（上海凈信科技有限公司）；明澈D24 UV型號純水儀（Merck Millipore公司）；YM-080S型超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）；DHG-9023A型烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LNG-T98型真空干燥儀（太倉市華美生化儀器廠）；AL104型萬分之一分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；HX502T型電子天平（慈溪市天東衡器廠）；MC-106B型電子體溫計（大連歐姆龍有限公司）；組織精密勻漿器（上海易擴儀器有限公司）；DDL-5型超速冷凍離心機（日本三洋電器有限公司）；R811型水平振蕩器（長沙諾達(dá)儀器設(shè)備有限公司）；101A-1型恒溫孵育箱（北京福意電器有限公司）；C21-ST21125型酶標(biāo)儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 藥材炮制

2.1.1 生柴胡炮制 將原藥材除去雜質(zhì)和殘莖，用水潤透，干燥所得[3]。

2.1.2 鱉血柴胡炮制 將用適量純凈水稀釋1倍后的新鮮鱉血與生柴胡，按照藥材-鱉血（100∶20）的比例進(jìn)行炮制，4 ℃儲藏悶潤，至輔料被完全吸盡后，用文火加熱炒干晾涼即得[3,15]。

2.2 鱉血柴胡“清肝退熱”作用的物質(zhì)基礎(chǔ)機制分析

2.2.1 鱉血柴胡炮制前后化學(xué)成分UHPLC-QTOF/MS分析

（1）色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～3.5 min，95% A；3.5～6.0 min，95%～85% A；6.0～12 min，85%～70% A；12～18 min，70%～30% A；18～25 min，30%～0 A。柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

（2）質(zhì)譜條件：在Analyst TF 1.7、AB Sciex控制下基于IDA功能進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進(jìn)行采集對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量40 eV；碰撞能差20 V；ESI離子源；霧化氣壓（GS1）379.225 kPa；輔助氣壓379.225 kPa；氣簾氣壓241.325 kPa；溫度550 ℃；噴霧電壓5500 V（正離子模式）、?4000 V（負(fù)離子模式）。

（3）數(shù)據(jù)處理：使用Progenesis QI軟件將質(zhì)譜原始導(dǎo)入，進(jìn)行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，同時創(chuàng)建樣品中相應(yīng)中藥代謝庫，利用百趣生物（www.biotree.cn）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對含有MS數(shù)據(jù)的峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

（4）化學(xué)模式識別：采用SIMCA V16.0.2軟件建模，分別對生柴胡與鱉血柴胡成分相對含量值進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），以觀測各組樣本之間的總體差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。進(jìn)一步通過正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA），濾過與分類變量不相關(guān)的正交變量，并對非正交變量和正交變量分別分析，從而獲取更加可靠的組間差異與實驗組的相關(guān)程度信息。通過2（的累積模型變化）和2（累積的預(yù)測變化）預(yù)測模型可靠性。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP＞1并結(jié)合檢驗的＜0.05來尋找差異性表達(dá)代謝物。

2.2.2 鱉血柴胡潛在藥效影響成分的解熱作用及中醫(yī)性效相關(guān)性分析 通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索顯著差異成分對應(yīng)的Canonical SMILES（線性結(jié)構(gòu)表達(dá)式）信息，輸入FAFdrugs4（http://fafdrugs4.mti.univ-paris-diderot.fr），以ADMET[吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）、排泄（excretion）、毒性（toxicity）]參數(shù)預(yù)測潛在藥效影響成分。將篩選出的潛在藥效影響成分信息導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0（http://www.metaboanalyst.ca/）網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路預(yù)測分析。將潛在藥效影響成分Canonical SMILES信息導(dǎo)入STITCH（http://stitch.embl.de/）、SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）和SEA（http://sea.bkslab.org）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物靶點預(yù)測。通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫，以fever為關(guān)鍵詞，檢索發(fā)熱的疾病靶點。通過基奧數(shù)據(jù)庫（https://www.omicshare.com）取成分與疾病交集靶點，導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/）、String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）、SymMap數(shù)據(jù)庫（http://www.symmap.org）進(jìn)行生物定位、生物功能信息富集及關(guān)聯(lián)中醫(yī)證候信息分析，并通過Cytoscape_v3.6.0軟件將結(jié)果可視化。

2.3 鱉血柴胡“清肝退熱”作用的內(nèi)在效應(yīng)機制分析

2.3.1 藥物制備 分別精密稱取生柴胡和鱉血柴胡，各加適量蒸餾水浸泡30 min，煎煮提取2次，每次水沸后煎煮5 min，濾過，合并濾液，濃縮至0.1 g/mL，備用。阿司匹林腸溶片粉碎后，用適量蒸餾水充分?jǐn)嚢枞芙獬?.02 g/mL的混懸液，備用。

2.3.2 各組大鼠肛溫測定 將電子溫度計探頭上涂抹適量的液體石蠟，探入大鼠肛門測量肛溫，2次/d，連續(xù)3 d，篩除體溫≥38 ℃、溫度變化≥0.5 ℃的大鼠。將合格大鼠隨機分為對照組、模型組、阿司匹林（0.18 g/kg）組、生柴胡（0.9 g/kg）組及鱉血柴胡（0.9 g/kg）組，每組8只，雌雄各半。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7 d。實驗第7天，每間隔0.5 h測定體溫1次，取3次平均值作為正常體溫，給藥30 min后，除對照組外，各組大鼠sc 2,4-二硝基苯酚（28 mg/kg）復(fù)制發(fā)熱模型[16]，并在造模后30、60、90、150、180 min分別監(jiān)測并記錄各組大鼠體溫，計算每個時間段與正常體溫的體溫差（?）。

2.3.3 各組大鼠解熱藥效學(xué)指標(biāo)測定 體溫測試完畢，各組大鼠ip 1 mL 0.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉，股動脈取血，3000 r/min離心15 min，低溫靜置15 min后，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

取血后迅速斷頭取腦，去除小腦及腦干后，稱定質(zhì)量，在冰浴下剝離大鼠下丘腦及腦腹中隔區(qū)腦組織，并在冰水浴中制成10%的勻漿，3000 r/min離心15 min，低溫靜置15 min后，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測下丘腦中cAMP和腦腹中隔區(qū)AVP含量。

取血后迅速分別收集對照組、模型組、生柴胡組、鱉血柴胡組大鼠肝臟組織，暫存于液氮中，之后轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱保存，用于代謝組學(xué)分析。

2.3.4 鱉血柴胡炮制前后解熱作用肝臟代謝組學(xué)分析

（1）檢測方法：Agilent 7890型氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-5MS型毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為氦氣；進(jìn)樣量1 μL；以Splitless Mode分流；體積流量1.0 mL/min；吹掃體積流量3.0 mL/min；柱箱升溫程序為50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至310 ℃，保持8 min；前進(jìn)樣口溫度和傳輸線溫度均為280 ℃；離子源溫度250 ℃；電離電壓?70 eV；掃描范圍/50～500，掃描速率12.5 spectra/s；溶劑延遲時間6.25 min。

（2）數(shù)據(jù)處理：使用Chroma TOF V4.3x軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析，使用LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行定性（包括質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配），最后，將質(zhì)控樣本中檢出率＜50%或RSD＞30%的峰去除。

（3）化學(xué)模式識別：同“2.2.1（4）”項。

（4）代謝途徑和功能分析：將篩選出的差異代謝標(biāo)志物，導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0（http://www. metaboanalyst.ca/）網(wǎng)站進(jìn)行代謝途徑預(yù)測。

3 結(jié)果

3.1 鱉血柴胡“清肝退熱”作用的物質(zhì)基礎(chǔ)機制分析

3.1.1 鱉血柴胡炮制前后化學(xué)成分UHPLC-QTOF/MS分析 共提取5898個峰，經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后5893個峰被保留。如圖1-A所示，在無監(jiān)督的PCA得分圖中，樣本均有明顯的聚類趨勢。為進(jìn)一步評價炮制前后成分差異，對生柴胡和鱉血柴胡進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA分析，正、負(fù)離子模式下，2組樣本數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)有效區(qū)分度，組間存在顯著差異。正、負(fù)離子模式下分別篩選出48種和52種代謝物，以火山圖的形式進(jìn)行可視化（圖1-B），組間層次聚類分析共篩選37個顯著差異成分，以熱力圖進(jìn)行可視化（圖1-C）。柴胡皂苷是柴胡最主要的藥效成分，其中《中國藥典》2020年版規(guī)定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于0.30%。但在本研究中未檢測到柴胡皂苷a，可能與其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在提取或放置過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化有關(guān)[17-18]。

3.1.2 鱉血柴胡潛在藥效影響成分的解熱作用及中醫(yī)性效相關(guān)性分析

（1）鱉血柴胡潛在藥效影響成分篩選及其代謝通路預(yù)測：本研究側(cè)重探究藥效變化趨勢，故以ADMET參數(shù)預(yù)測對藥效具有影響的成分。分別將差異成分的Canonical SMILES（線性結(jié)構(gòu)表達(dá)式）輸入FAFdrugs4數(shù)據(jù)庫，共篩選出20個鱉血柴胡潛在藥效影響成分，主要為脂肪酸類和木脂素類，但柴胡皂苷d未通過篩選，可能與其具有一定的肝毒性相關(guān)[19]，UHPLC-QTOF/MS分析數(shù)據(jù)見表2。這些成分主要對苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝等代謝途徑具有潛在影響（圖2）。

（2）鱉血柴胡潛在藥效影響成分與解熱作用的生物效應(yīng)相關(guān)性分析：如圖3所示，共獲取鱉血柴胡潛在藥效影響成分的382個靶點及7640個發(fā)熱的疾病靶點，二者的交集靶點有282個。將282個交集靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物定位及生物功能信息富集分析，靶點主要定位在肝臟和免疫系統(tǒng)相關(guān)組織，與蛋白磷酸化、炎癥、免疫、內(nèi)分泌及激素的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)。將282個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析，并將結(jié)果輸入Cytoscape_v3.6.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以度值、中心度值、接近中心度值為參照，篩選排名前10的靶點作為關(guān)鍵靶點，依次為熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，HSP90AA1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、GTP酶HRAS（GTPase HRas，HRAS）、磷脂酰肌醇4（phosphatidylinositol 4，PIK3CA）、有絲分裂原激活蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK3、酪氨酸蛋白激酶Lck（tyrosine-protein kinase Lck，LCK）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、酪氨酸蛋白激酶Fyn（tyrosine-protein kinase Fyn，F(xiàn)YN）、Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1）。

A-PCA和OPLS-DA分析 B-差異成分分析火山圖 C-顯著差異成分分析熱圖，紅色表示該物質(zhì)含量相對高表達(dá)，藍(lán)色表示該物質(zhì)含量相對低表達(dá)，9-oxo-10E,12Z,15Z-octadecatrienoic acid和icariside F2（淫羊藿次苷F2）為正、負(fù)離子模式下均檢測到的成分

表2 鱉血柴胡潛在藥效影響成分

淫羊藿次苷F2為正、負(fù)離子模式下均檢測到的潛在藥效影響成分

icariside F2 is detected in both positive and negative ion modes

A-離子流圖 B-潛在藥效影響成分的代謝途徑分析

A-鱉血柴胡與發(fā)熱病癥交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 B-關(guān)鍵靶點的篩選網(wǎng)絡(luò)圖 C-交集靶點生物定位的富集分析 D-交集靶點的生物功能的富集分析 E-關(guān)鍵靶點的排序

（3）鱉血柴胡潛在藥效影響成分的解熱作用關(guān)鍵靶點的中醫(yī)證候信息關(guān)聯(lián)分析：將關(guān)鍵靶點輸入SymMap數(shù)據(jù)庫檢索靶點關(guān)聯(lián)中醫(yī)證候信息，再導(dǎo)入到Cytoscape_v 3.6.0軟件分析預(yù)測鱉血柴胡與中醫(yī)證候的關(guān)聯(lián)屬性并可視化，如圖4所示，鱉血柴胡潛在藥效影響成分的解熱作用關(guān)鍵靶點的中醫(yī)歸經(jīng)顯著定位在肝經(jīng)，與風(fēng)熱、火熱、濕熱、血熱等熱證之證候相關(guān)性高。

3.2 鱉血柴胡“清肝退熱”作用的內(nèi)在效應(yīng)機制分析

3.2.1 鱉血柴胡對2,4-二硝基酚所致發(fā)熱大鼠的解熱藥效學(xué)分析 如圖5所示，與模型組比較，生柴胡和鱉血柴胡均能明顯降低發(fā)熱大鼠的體溫（＜0.05）；相較于生柴胡，鱉血柴胡的解熱作用相對緩慢，但對持續(xù)性高熱的作用相對顯著。與模型組比較，生柴胡顯著降低發(fā)熱大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平（＜0.01），降低下丘腦cAMP水平（＜0.01）；鱉血柴胡能顯著降低發(fā)熱大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平（＜0.01），降低下丘腦cAMP和腦腹中隔區(qū)AVP水平（＜0.01），鱉血柴胡的效果相對顯著。

A-“成分-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò) B-關(guān)鍵靶點與中醫(yī)證候關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，紅色為靶點，藍(lán)色為中醫(yī)證候，黃色為歸經(jīng)；顏色越深，圖形越大則網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度越高

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.2.2 鱉血柴胡解熱作用的肝臟代謝組學(xué)分析

（1）各組大鼠肝臟差異代謝物篩選和多元統(tǒng)計分析：以解熱藥效數(shù)據(jù)為依據(jù)，每組取4只大鼠肝臟組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析，并設(shè)3個質(zhì)控組。如圖6所示，共提取818個峰，經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后781個峰被保留，整體輪廓存在一定的差異。在無監(jiān)督的PCA得分圖中，樣本均有明顯的聚類趨勢，為進(jìn)一步評價藥效差異，對對照組、模型組、生柴胡組、鱉血柴胡組進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA分析，樣本數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)有效區(qū)分度，組間存在顯著差異。

A-各組大鼠肝臟組織樣本的GC-MS總離子流圖 B-PCA分析 C-OPLS-DA分析

（2）各組大鼠肝臟組織差異代謝物鑒定及通路分析：采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP＞1，并結(jié)合檢驗的＜0.05來尋找差異代謝物，以火山圖的形式進(jìn)行可視化。進(jìn)一步將各組差異代謝物按照定量值計算歐式距離矩陣，分別進(jìn)行組間層次聚類分析，篩選顯著差異代謝物，以熱圖進(jìn)行可視化。如圖7-A所示，模型組與對照組有35個顯著差異代謝物，為發(fā)熱大鼠肝臟生物標(biāo)志物；生柴胡與模型組有59個顯著差異代謝物，其中11個為發(fā)熱大鼠肝臟生物標(biāo)志物；鱉血柴胡與模型組有55個顯著差異代謝物，其中19個為發(fā)熱大鼠肝臟生物標(biāo)志物；生柴胡與鱉血柴胡具有共同回調(diào)的9個發(fā)熱大鼠肝臟生物標(biāo)志物。

將發(fā)熱大鼠肝臟代謝生物標(biāo)志物、生柴胡與鱉血柴胡共同回調(diào)9個生物標(biāo)志物及鱉血柴胡自有10個生物標(biāo)志物分別導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析。如圖7-B所示，發(fā)熱大鼠的肝臟代謝標(biāo)志物主要涉及嘌呤代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成、檸檬酸循環(huán)等代謝途徑，與之相比生柴胡與鱉血柴胡均能影響嘌呤代謝和脂肪酸相關(guān)代謝途徑發(fā)揮解熱作用，鱉血柴胡除了影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成等代謝途徑外，還影響半乳糖代謝、氮代謝、維生素B6代謝達(dá)到解熱的目的。

A-模型組與對照組差異代謝物火山圖 B-生柴胡組與模型組差異代謝物火山圖 C-鱉血柴胡組與模型組差異代謝物火山圖 D-生柴胡組與鱉血組差異代謝物火山圖 E-各組大鼠肝臟代謝標(biāo)志物熱圖，淺藍(lán)色框為生柴胡與鱉血柴胡共同具有回調(diào)的9個生物標(biāo)志物，深藍(lán)色框為鱉血柴胡區(qū)別于生柴胡顯著影響的10個生物標(biāo)志物 F-模型組影響代謝通路 G-生柴胡與鱉血柴胡共同影響代謝通路 H-鱉血柴胡影響代謝通路

4 討論

柴胡主入肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱之功效，為中醫(yī)解表退熱常用藥材[1]。鱉血柴胡是柴胡的一種特殊炮制品，據(jù)記載其可增強柴胡清肝退熱之效[3]。本研究以代謝組學(xué)技術(shù)為主要的研究策略，闡釋了其中的“物質(zhì)-效應(yīng)”變化機制，為其合理推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

首先以中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)（UHPLC-QTOF-MS）對鱉血柴胡炮制前后內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化（即化學(xué)成分變化）進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果顯示鱉血柴胡炮制前后的化學(xué)成分發(fā)生了變化，雖然種類未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但相對定量值存在變化。化學(xué)成分是中藥藥性和藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[20]，所以用鱉血炮制后柴胡的物質(zhì)基礎(chǔ)的確發(fā)生了改變，這將引起藥性和藥效的變化，于是本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對此進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)合ADMET信息分析共篩選出20個潛在藥效影響成分，這些成分主要對苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝等肝臟代謝途徑[21]具有影響。20個潛在藥效影響成分與發(fā)熱病證具有282個交集靶點，生物功能分析顯示這些靶點主要定位在肝臟和免疫器官，并與蛋白磷酸化、炎癥、內(nèi)分泌及激素調(diào)節(jié)等生物效應(yīng)相關(guān)。發(fā)熱的發(fā)病機制是外源性致熱原侵入機體，激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放內(nèi)源性致熱原，進(jìn)而直接或間接通過血-腦脊液屏障作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，最終引起發(fā)熱反應(yīng)，而內(nèi)生致熱原主要為IL-1β、IL-6及TNF等炎癥細(xì)胞因子[22]。進(jìn)一步的“成分-靶點-中醫(yī)證候”的生物信息關(guān)聯(lián)分析顯示，鱉血柴胡生物效應(yīng)更側(cè)重影響肝經(jīng)，顯著關(guān)聯(lián)風(fēng)熱、火熱、濕熱、血熱等熱證，反映與“清肝退熱”功效具有證素相關(guān)性。由此可見，炮制引起物質(zhì)基礎(chǔ)變化與鱉血柴胡“清肝退熱”作用具有潛在的相關(guān)性。

其次，通過大鼠解熱藥效學(xué)實驗對生柴胡與鱉血柴胡的“清肝退熱”作用的效應(yīng)機制進(jìn)行對比分析。2,4-二硝基苯酚為代謝刺激劑，可引起實驗動物體溫顯著上升，一方面通過抑制呼吸與阻止二磷酸腺苷的磷酸化，引起發(fā)熱，另一方面通過刺激巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生致熱細(xì)胞因子[16]，與鱉血柴胡的解熱物質(zhì)基礎(chǔ)機制相符合，因此，本研究以2,4-二硝基苯酚為致熱劑復(fù)制大鼠發(fā)熱模型。研究顯示柴胡解熱作用機制主要與降低血中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量和調(diào)節(jié)下丘腦cAMP及腦腹中隔區(qū)AVP的合成分泌有關(guān)[23]，IL-1β、TNF-α、IL-6是典型的內(nèi)生性致熱原，當(dāng)機體大量分泌時，進(jìn)入血液引起發(fā)熱[24]。IL-6是多種致熱原引起發(fā)熱的重要介質(zhì)，在體內(nèi)防御機制和急性期反應(yīng)中起重要作用，血清中水平可反映組織損傷程度[25]。cAMP是重要的中樞性發(fā)熱正調(diào)節(jié)介質(zhì)，而AVP是一種內(nèi)源性解熱物質(zhì)，為中樞性發(fā)熱負(fù)調(diào)節(jié)介質(zhì)，能顯著抑制致熱性細(xì)胞因子的致熱效應(yīng)[26]。因此，本研究除了體溫監(jiān)測外，還以血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量及下丘腦cAMP的含量和腦腹中隔區(qū)AVP的含量為解熱效應(yīng)的生化標(biāo)志物，對藥效學(xué)進(jìn)行評價。結(jié)果顯示，生柴胡與鱉血柴胡均可減低發(fā)熱大鼠的體溫，而鱉血柴胡起效相對緩慢，對持續(xù)性高熱效果較生柴胡更為顯著。生柴胡與鱉血柴胡均可降低發(fā)熱大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量及下丘腦cAMP的含量和腦腹中隔區(qū)AVP的含量，鱉血柴胡的綜合效應(yīng)更為顯著。

以物質(zhì)基礎(chǔ)機制分析結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)一步通過肝臟代謝組學(xué)分析探索內(nèi)在的效應(yīng)機制。與生柴胡相比較，鱉血柴胡回調(diào)的發(fā)熱大鼠的肝臟代謝標(biāo)志物種類更多。生柴胡與鱉血柴胡均能通過回調(diào)肝臟組織中黃嘌呤、軟脂酸、甲基丙二酸、5-(4-羥基丁基)-1-乙內(nèi)酰脲、-半乳糖醛酸2、α--氨基葡萄糖1-磷酸酯、4-羥基丁酸酯、2-脫氧赤蘚糖醇、1-單棕櫚酸甘油酯而顯著影響嘌呤代謝和脂肪酸代謝。嘌呤的最終代謝產(chǎn)物為尿酸，尿酸鹽結(jié)晶可使單核細(xì)胞釋放TNF-α與IL-1β引起血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)抗炎與促炎平衡[27]，炎癥可以引起脂質(zhì)代謝紊亂，而脂質(zhì)代謝失衡也可誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[28]，說明鱉血柴胡與生柴胡具有相似的解熱機制，均能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以解熱。發(fā)熱具有防御和損害雙重作用，一定程度的發(fā)熱可以清除機體內(nèi)的病原體，然而持續(xù)高熱會導(dǎo)致機體內(nèi)糖類、脂肪及蛋白質(zhì)過度損耗，造成器官組織損傷[29]，故而，鱉血柴胡與生柴胡還具有防止發(fā)熱中脂肪過度損耗而引起肝臟損傷的保護作用。而鱉血柴胡還能顯著回調(diào)泛酸、單硬脂酸甘油酯、馬來酰亞胺、二十四烷酸、吡喃果糖-5-葡糖苷1、谷酰胺1、雄酮1、4-吡啶氧酸、3,6-脫水-半乳糖4、3,6-脫水--半乳糖，又能顯著影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、泛酸和輔酶a生物合成、類固醇生物合成、半乳糖代謝、氮素代謝、維生素B6代謝等途徑。高熱患者蛋白質(zhì)分解代謝加強，尿素氮明顯增高，呈負(fù)氮平衡；蛋白質(zhì)分解加強可為肝臟提供大量游離氨基酸，用于急性期反應(yīng)蛋白的合成和組織的修復(fù)[30]。其中維生素B6別名吡哆醛、吡哆醇，是輔酶的重要組成成分，參與糖、蛋白質(zhì)、脂肪的正常代謝[31]。以上結(jié)果說明，鱉血柴胡還能防止持續(xù)高熱導(dǎo)致的肝臟糖類及蛋白質(zhì)過度損耗，而具有更顯著的解熱及肝臟損傷保護的作用優(yōu)勢。由此可見，炮制引起藥效學(xué)變化與鱉血柴胡“清肝退熱”作用亦存在密切的相關(guān)性。

綜上所述，鱉血柴胡是柴胡的特色炮制品，但內(nèi)在炮制機制不明確，對其廣泛開發(fā)應(yīng)用造成一定的影響。炮制后化學(xué)成分變化所引起性味、功能的改變，是鱉血炮制增強柴胡清肝退熱功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。鱉血柴胡內(nèi)在關(guān)聯(lián)生物效應(yīng)和藥理綜合效應(yīng)機制與加強柴胡清肝退熱功效的傳統(tǒng)炮制意義相符合，本研究對鱉血柴胡的炮制目的的闡明和合理化應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 293.

[2] 魏·吳普等述, 清·孫星衍, 孫馮翼輯. 神農(nóng)本草經(jīng) (三卷) [M]. 新1版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1963: 27.

[3] 龔千鋒. 中藥炮制學(xué) [M]. 第4版. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2016: 199-201.

[4] 喬欣, 葉耀輝, 馬亞男, 等. 柴胡經(jīng)鱉血炮制后五種皂苷成分變化規(guī)律研究 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2022, 33(1): 111-114.

[5] 劉鵬. 鱉血柴胡背后的用藥地域化與醫(yī)家爭論 [J]. 中藥材, 2020, 43(11): 2821-2824.

[6] 吳皓, 李飛. 中藥炮制學(xué) [M]. 第2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2016: 23.

[7] 蔡寶昌, 秦昆明, 吳皓, 等. 中藥炮制過程化學(xué)機理研究 [J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2012, 24(4): 637-649.

[8] 劉曉, 孫戡平, 秦昆明, 等. 基于UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)研究炮制對白術(shù)芍藥散中化學(xué)成分的影響 [J]. 中草藥, 2022, 53(13): 3920-3928.

[9] 陳文彬, 史毅, 馬亞男, 等. 基于UPLC/Q-TOF-MS/MS分析鱉血柴胡皂苷類化學(xué)成分 [J]. 現(xiàn)代食品科技, 2019, 35(7): 247-253.

[10] 葉耀輝, 張博文, 鄭紅梅, 等. 頂空進(jìn)樣GC-MS分析柴胡不同炮制品的揮發(fā)性成分 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2017, 23(18): 11-14.

[11] 李小寧, 于歡, 龔千鋒, 等. 柴胡總多糖提取工藝優(yōu)化及其不同炮制品中總多糖的含量比較 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2016, 22(14): 27-30.

[12] 許枬, 賈天柱, 周翎. 基于組學(xué)的中藥炮制研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2010, 12(4): 553-557.

[13] Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. Metabonomics: Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data [J]., 1999, 29(11): 1181-1189.

[14] Johnson C H, Ivanisevic J, Siuzdak G. Metabolomics: Beyond biomarkers and towards mechanisms [J]., 2016, 17(7): 451-459.

[15] 寧艷梅, 楊韜. 鱉血柴胡不同比例炮制品解熱鎮(zhèn)痛作用的實驗研究 [J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2014, 31(6): 5-8.

[16] 徐小蓉, 唐進(jìn)法, 張輝, 等. 青黛對2,4-二硝基苯酚誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠模型的解熱活性及潛在機制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(13): 3205-3212.

[17] 陳晶, 傅欣彤, 陳有根, 等. 基于UHPLC-QE Plus-MS/MS法分析柴黃顆粒及柴胡中化學(xué)成分 [J]. 中草藥, 2022, 53(15): 4634-4644.

[18] 郭智, 彭冰, 李宗陽, 等. UPLC-QTof-MS測定不同提取條件下柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的轉(zhuǎn)化規(guī)律 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 26(5): 716-720.

[19] 李芝奇, 范琦琦, 陳美琳, 等. 中藥肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(13): 4082-4095.

[20] 張廷, 崔瑛, 申玲玲, 等. 中藥藥性復(fù)雜性與藥性物質(zhì)研究的思考 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2013, 28(3): 585-587.

[21] Valdivieso F, Gimenez C, Mayor F.inhibition of rat liver phenylalanine hydroxylase by-chlorophenylalanine and esculin. Experimental model of phenylketonuria [J]., 1975, 12(1): 72-78.

[22] Ogoina D. Fever, fever patterns and diseases called fever: A review [J]., 2011, 4(3): 108-124.

[23] 石亮, 張智慧, 李曉宇, 等. 柴胡水提物對大鼠解熱作用機制研究 [J]. 中國藥物警戒, 2016, 13(9): 513-516.

[24] Lisa R L. Molecular biology of thermo regulation invited reviw: Cytokine regulation of fever: Studies using gene knockout mice [J]., 2002, 92(6): 2648-2655.

[25] Sundgren-Andersson A K, Ostlund P, Bartfai T. IL-6 is essential in TNF-alpha-induced fever [J]., 1998, 275(6): R2028-R2034.

[26] Roth J. Endogenous antipyretics [J]., 2006, 371(1/2): 13-24.

[27] 周慧. KCNQ1在尿酸鹽晶體引起單核巨噬細(xì)胞分泌IL-1β中的作用研究 [D]. 青島: 青島大學(xué), 2017.

[28] van der Veen J N, Kennelly J P, Wan S,. The critical role of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine metabolism in health and disease [J]., 2017, 1859(9 Pt B): 1558-1572.

[29] 陳升富, 李曉琳, 王維剛, 等. 中藥解熱作用研究進(jìn)展 [J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2022, 27(3): 334-344.

[30] le Floc'h N, Melchior D, Obled C. Modifications of protein and amino acid metabolism during inflammation and immune system activation [J]., 2004, 87(1): 37-45.

[31] Mascolo E, Verni F. Vitamin B6and diabetes: Relationship and molecular mechanisms [J]., 2020, 21: 3669.

“Substance-effect” mechanism ofprocessed with’s blood on “l(fā)iver-clearing and fever-relieving” based on metabolomics

NING Yan-mei1, 2, REN Yuan1, 2, WU Guo-tai1, 2, WANG Rui-qiong1, 2, DUAN Hai-jing1, 2, ZHANG Jin-bao1, 2, WU Ping-an1, 3, DOU Han-chen1, WANG Rui1

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Gansu Province Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 3. Key Laboratory of Standard and Quality of Chinese Medicine Research of Gansu Province, Lanzhou 730000, China

To explore the changes of “substance-effect” before and after processing of Chaihu () processed with’s blood for the sake of illustrating the effect of processing on its efficiency of “l(fā)iver-clearing and fever-relieving” based on metabolomics.Non-target metabolomics and network pharmacology were used to analyze the correlation between changes of material basis and the effect of “l(fā)iver-clearing and fever-relieving” ofprocessed with’s blood. The antipyretic effect ofprocessed with’s blood was evaluated by 2,4-dinitrophenol-induced fever rats and metabolomics of liver, which in order to interpret the correlation between the pharmacodynamic mechanism and the efficiency of “l(fā)iver-clearing and fever-relieving” ofprocessed with’s blood.The changes of material basis ofprocessed with’s blood before and after processing were focused on affecting the liver meridian in TCM syndromes, which was related to syndrome elements with wind-heat, fire-heat, damp-heat, blood-heat, therefore corresponding efficiency was “l(fā)iver-clearing and fever-relieving”. Antipyretic pharmacodynamics showed thatprocessed with’s blood had a similar effect on, and it had a significant effect on the metabolites in a fever, and it had the advantage of liver damage protection.The metabolomic changes of “substance-effect” show that processing can promote the comprehensive effect of “l(fā)iver-clearing and fever-relieving” ofprocessed with’s blood.

;’s blood; processing; metabolomics; effect; liver-clearing and fever-relieving

R285.5

A

0253 - 2670(2022)24 - 7763 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.014

2022-08-05

甘肅省中醫(yī)藥研究中心2019—2020年度開放課題立項（zyzx-2020-19）；教育部第二批高校思想政治工作精品項目（教思政司函[2019]2號）；第四次全國中藥資源普查甘肅省試點工作中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項（財社[2011]76號）

寧艷梅（1977—），女，博士研究生，副教授，研究方向為中藥藥理與毒理、中藥藥性理論與應(yīng)用。E-mail: Hiningyanmei@qq.com

任 遠(yuǎn)，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥理與毒理研究。E-mail: Leyuan988@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]