海南虎刺枝葉中化學(xué)成分及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性研究

藍(lán) 創(chuàng)，謝 珍，石倪霏，符永泉，熊舒葒，劉艷萍, 2, 3，付艷輝, 2, 3

海南虎刺枝葉中化學(xué)成分及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性研究

藍(lán) 創(chuàng)1，謝 珍1，石倪霏1，符永泉1，熊舒葒1，劉艷萍1, 2, 3*，付艷輝1, 2, 3*

1. 海南師范大學(xué) 熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571126 2. 海南師范大學(xué) 南藥資源產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究海南省工程研究中心, 海南 ?？?571126 3. 海南師范大學(xué) 南藥資源產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究海口市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571126

研究茜草科虎刺屬植物海南虎刺枝葉中的化學(xué)成分及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。綜合運(yùn)用硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜以及制備型HPLC等色譜技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)分離和純化，根據(jù)分離得到化合物的理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)，并通過(guò)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；采用MTS法通過(guò)對(duì)分離得到化合物的體外抑制滑膜細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行測(cè)試以評(píng)價(jià)其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。從海南虎刺枝葉的甲醇提取物中分離得到了18個(gè)化合物，分別鑒定為naucleidinal（1）、1,2,3,4-tetrahydronorharman-1-one（2）、19--methyl-3,14-dihydroangustoline（3）、latifoliamide B（4）、latifoliamide D（5）、bacilsubteramide A（6）、vinmajine I（7）、naucleofficine D（8）、1-甲氧甲酰-β-咔巴啉（9）、naphthisoxazol A（10）、1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone（11）、rubiadin-1-methyl ether（12）、1,3,6-trihydroxy-2-methoxymethyl-9,10-anthraquinone（13）、3,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl- 9,10-anthra quinone（14）、7-羥基色原酮（15）、5,7-二羥基色原酮（16）、6,4?-dihydroxy-3?-methoxyaurone（17）和farnisin（18）?？诡愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，化合物11～14、17和18對(duì)滑膜成纖維MH7A細(xì)胞增殖抑制活性的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為（8.93±0.09）～（152.58±0.32）μmol/L。所有化合物均為首次從虎刺屬植物中分離得到?；衔?1～14、17和18表現(xiàn)出了較為顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。

海南虎刺；naucleidinal；rubiadin-1-methyl ether；farnisin；抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性

茜草科（Rubiaceae）虎刺屬C. F. Gaertn.植物全世界有13種和2變種，集中分布于亞洲東部。分布我國(guó)的虎刺屬植物有11種，分布于西南部至東南部[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明虎刺屬植物的提取物具有多樣的生物活性如抗炎、抗腫瘤、抗瘧以及神經(jīng)保護(hù)等[2-6]。由于虎刺屬植物分布的地域獨(dú)特性和特有性，關(guān)于虎刺屬植物中的化學(xué)成分及其生物活性的研究報(bào)道極為罕見(jiàn)。截至目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一共從該屬植物中僅分離鑒定了18個(gè)化合物，主要為蒽醌類化合物[7-9]。在海南分布的虎刺屬植物僅有1種，即為海南虎刺(Lo) Lo ex Y. Z. Ruan。海南虎刺為海南特有植物，為黎族民間藥用植物，具有祛風(fēng)利濕、活血止痛的功效，常用于感染和炎癥性疾病的治療，藥用歷史悠久，療效顯著[1]。截至目前，未見(jiàn)任何關(guān)于海南虎刺中化學(xué)成分及其藥理活性的研究報(bào)道，為了闡明海南虎刺的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)為了更合理地開(kāi)發(fā)利用該植物資源，充分發(fā)揮其藥用價(jià)值，本研究對(duì)海南虎刺枝葉的甲醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離得到了18個(gè)化合物，分別鑒定為naucleidinal（1）、1,2,3,4- tetrahydronorharman-1-one（2）、19--methyl-3,14- dihydroangustoline（3）、latifoliamide B（4）、latifoliamide D（5）、bacilsubteramide A（6）、vinmajine I（7）、naucleofficine D（8）、1-甲氧甲酰-β-咔巴啉（1-carbomethoxy-β-carboline，9）、naphthisoxazol A（10）、1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone（11）、rubiadin-1-methyl ether（12）、1,3,6- trihydroxy-2-methoxy methyl-9,10-anthraquinone（13）、3,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl-9,10- anthraquinone（14）、7-羥基色原酮（7-hydroxy chromone，15）、5,7-二羥基色原酮（5,7-dihydroxy chromone，16）、6,4?-dihydroxy-3?-methoxyaurone（17）和farnisin（18）。所有化合物均為首次從虎刺屬植物中分離得到。此外，采用MTS法通過(guò)對(duì)分離鑒定化合物的體外抑制滑膜細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)了化合物1～18的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性。結(jié)果表明化合物11～14、17和18表現(xiàn)出較為顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，對(duì)滑膜成纖維MH7A細(xì)胞增殖抑制活性的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為（8.93±0.09）～（152.58±0.32）μmol/L

1 儀器與材料

Bruker AV-400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）；Finnigan LCQ Advantange MAX型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；UltiMate 3000制備型HPLC儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent1200分析型HPLC儀（美國(guó)Agilent Technologies有限公司）；Waters XBridge C18分析型HPLC色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司）和Waters XBridge C18制備型HPLC色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司）；Sepacore型中低壓制備色譜（瑞士Buchi公司）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；反相硅膠色譜材料（德國(guó)Merck公司）；Sephadex LH-20凝膠（美國(guó)Amersham Blosclences公司）；薄層硅膠GF254和柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；XPR105DR/AC電子天平（瑞士METTLER TOLEDO儀器有限公司）；YOKO-ZX型紫外分析暗箱（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；HERAcell 240i型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司）；OLYM PUS-IX70型生物倒置顯微鏡（日本Olympus株式會(huì)社）；BHC-1300B2型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Tecan Infinite Pro型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan集團(tuán)公司）；F12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清和雙抗（美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司）；噻唑藍(lán)（德國(guó)Merck公司）；MH7A細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）細(xì)胞庫(kù)，購(gòu)自于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。所用試劑均為色譜純或分析純?cè)噭ㄎ麟]化工股份有限公司）。甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644；批號(hào)036141008）。

海南虎刺枝葉于2018年11月采集于海南省昌江黎族自治縣霸王嶺國(guó)家森林公園，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為茜草科虎刺屬植物海南虎刺(Lo) Lo ex Y. Z. Ruan的枝葉，憑證標(biāo)本（HNDAHA20181102）保存于海南師范大學(xué)南藥資源產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究海南省工程研究中心植物標(biāo)本室。

2 提取與分離

將陰干的海南虎刺枝葉21.8 kg粉碎后用甲醇室溫浸泡提取5次，每次室溫浸泡提取3 d，合并提取液，減壓回收甲醇后得總浸膏2.26 kg。甲醇總浸膏加蒸餾水混懸，依次用石油醚和醋酸乙酯各萃取5次，減壓回收溶劑后得石油醚萃取部位632.8 g和醋酸乙酯萃取部位508.2 g。石油醚萃取部位（630.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯體系為洗脫劑（90∶10～20∶80）進(jìn)行梯度洗脫，得到8個(gè)流分Fr. 1～8。Fr. 4（68.9 g）經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以甲醇-水體系為洗脫劑（60∶40～100∶0）進(jìn)行梯度洗脫，得到9個(gè)亞流分（Fr. 4A～4I）。Fr. 4B（6.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-丙酮體系為洗脫劑（90∶10～50∶50）進(jìn)行梯度洗脫，再經(jīng)制備型HPLC制備（甲醇-水78∶22）得到化合物1（21.2 mg）、7（8.9 mg）、9（11.3 mg）和12（102.8 mg）；Fr. 4C（5.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-丙酮為洗脫劑（85∶15～40∶60）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（丙酮）純化后，再經(jīng)制備型HPLC制備［乙腈-水（73∶17）］得到化合物2（24.6 mg）、10（33.5 mg）、13（72.3 mg）、14（53.8 mg）和16（46.3 mg）；Fr. 5（48.7 g）經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以甲醇-水體系為洗脫劑（60∶40～100∶0）進(jìn)行梯度洗脫，得到6個(gè)亞流分（Fr. 5A～5F）；Fr. 5B（8.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-丙酮（65∶35～25∶75）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化后，再經(jīng)制備型HPLC制備（乙腈-水56∶44）得到化合物3（7.6 mg）、4（86.3 mg）、15（93.4 mg）和17（52.8 mg）；Fr. 5C（7.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮為洗脫劑（75∶25～30∶70）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（丙酮）純化后，再經(jīng)制備型HPLC制備［甲醇-水（63∶37）］得到化合物5（15.8 mg）、6（5.6 mg）、8（35.6 mg）、11（73.9 mg）和18（52.8 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C20H20N2O3，ESI-MS/: 337.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.21 (1H, brs, H-1), 9.58 (1H, d,= 3.8 Hz, H-18), 7.37 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.34 (1H, s, H-17), 7.30 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12), 7.06 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-11), 7.00 (1H, dd,= 8.0, 7.7 Hz, H-10), 5.01 (1H, m, H-5α), 4.79 (1H, m, H-3), 4.10 (1H, m, H-19), 3.01 (1H, m, H-6α), 2.75 (1H, m, H-6β), 2.70 (1H, m, H-5β), 2.68 (1H, m, H-14α), 2.65 (1H, m, H-20), 2.29 (1H, m, H-15), 1.91 (1H, m, H-14β), 1.36 (1H, d,= 1.8 Hz, H-21)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d): 203.0 (C-18), 163.7 (C-22), 150.0 (C-17), 136.1 (C-13), 134.2 (C-2), 126.9 (C-8), 120.9 (C-11), 118.8 (C-10), 117.8 (C-9), 111.6 (C-12), 100.0 (C-16), 107.7 (C-7), 71.1 (C-19), 56.2 (C-20), 52.9 (C-3), 42.8 (C-5), 28.5 (C-14), 27.7 (C-15), 19.9 (C-6), 18.9 (C-21)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[10]，故鑒定化合物1為naucleidinal。

化合物2：白色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀反應(yīng)陽(yáng)性；C11H10N2O，ESI-MS/: 187.0 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.61 (1H, s, -NH), 7.56 (1H, brs, H-2), 7.62 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.40 (1H, d,= 8.0 Hz, H-8), 7.18 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-7), 7.08 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-6), 3.49 (2H, t,= 6.8 Hz, H-3), 2.89 (2H, t,= 6.8 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 162.0 (C-1), 137.1 (C-8a), 127.3 (C-1a), 125.0 (C-5a), 124.1 (C-7), 120.1 (C-5), 119.4 (C-6), 117.9 (C-4a), 112.5 (C-8), 41.2 (C-3), 20.4 (C-4)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[11]，故鑒定化合物2為1,2,3,4- tetrahydronorharman-1-one。

化合物3：淡黃色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C21H21N3O2，ESI-MS/: 348.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.19 (1H, s, H-1), 9.10 (1H, s, H-17), 8.69 (1H, s, H-21), 7.55 (1H, d,= 8.2 Hz, H-9), 7.47 (1H, d,= 8.0 Hz, H-12), 7.22 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-11), 7.11 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-10), 5.15 (1H, d,= 10.2 Hz, H-19), 5.07 (1H, m, H-5β), 4.01 (1H, m, H-14β), 4.79 (1H, m, H-3), 3.38 (3H, s, 18-OCH3), 3.02 (1H, m, H-5α), 2.96 (1H, m, H-6), 2.85 (1H, m, H-14α), 1.55 (1H, m, H-18)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 162.8 (C-22), 150.1 (C-21), 147.9 (C-17), 143.1 (C-15), 136.4 (C-13), 135.0 (C-20), 132.9 (C-2), 126.2 (C-8), 124.3 (C-16), 121.4 (C-11), 118.8 (C-10), 118.0 (C-9), 111.2 (C-12), 107.4 (C-7), 74.3 (C-19), 56.4 (C-3), 50.7 (18-CH3), 38.8 (C-5), 30.0 (C-14), 22.3 (C-6), 20.5 (C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[12]，故鑒定化合物2為19--methyl- 3,14-dihydroangustoline。

化合物4：淡黃色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C21H24N2O3，ESI-MS/: 353.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.22 (1H, s, H-1), 7.50 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.29 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12), 7.15 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-10), 7.10 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-11), 5.68 (1H, q,= 7.2 Hz, H-19), 5.06 (1H, dd,= 4.8, 3.8 Hz, H-3), 5.01 (1H, s, H-21), 4.87 (1H, m, H-5α), 4.19 (1H, d,= 11.8 Hz, H-17α), 3.68 (1H, d,= 11.8 Hz, H-17β), 2.87 (1H, m, H-5β), 2.81 (1H, m, H-6α), 2.74 (1H, dd,=10.2, 4.8 Hz, H-15), 2.68 (1H, m, H-6β), 2.63 (1H, m, H-14α), 2.58 (1H, m, H-14β), 1.72 (1H, d,= 7.2 Hz, H-18), 1.51 (3H, s, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 161.7 (C-22), 137.9 (C-2), 136.2 (C-13), 135.2 (C-20), 127.1 (C-8), 126.9 (C-19), 120.6 (C-11), 118.8 (C-10), 116.8 (C-7), 111.6 (C-12), 106.7 (C-9), 73.6 (C-21), 69.5 (C-16), 54.3 (C-3), 39.8 (C-5), 35.9 (C-15), 26.4 (C-14), 20.9 (C-18), 20.5 (C-6), 19.6 (C-1′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[13]，故鑒定化合物4為latifoliamide B。

化合物5：淡黃色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C19H17N3O，ESI-MS/: 304.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.78 (1H, s, H-1), 9.23 (1H, s, H-17), 8.69 (1H, s, H-21), 7.40 (1H, d,= 8.2 Hz, H-9), 7.29 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-12), 7.05 (1H, dd,= 7.8 Hz, H-10), 7.01 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-11), 5.21 (1H, dd,= 4.8, 3.6 Hz, H-3), 4.81 (1H, m, H-5α), 3.29 (1H, m, H-14α), 2.98 (1H, m, H-14β), 2.95 (1H, m, H-5β), 2.89 (1H, m, H-6α), 2.68 (1H, m, H-6β), 2.17 (1H, s, H-19)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 165.9 (C-22), 150.8 (C-17), 148.1 (C-21), 138.6 (C-15), 134.9 (C-20), 134.3 (C-13), 126.8 (C-8), 126.6 (C-2), 119.3 (C-16), 118.3 (C-11), 117.5 (C-10), 116.3 (C-9), 114.3 (C-12), 111.2 (C-7), 53.5 (C-3), 42.1 (C-5), 28.6 (C-14), 20.2 (C-6), 18.1 (C-19)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[13]，故鑒定化合物5為latifoliamide D。

化合物6：白色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C12H14N2O3，ESI-MS/: 235.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.29 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.23 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-7), 7.06 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-6), 6.89 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 3.09 (2H, dt,= 8.2, 4.2 Hz, H-11), 2.08 (2H, dt,= 8.2, 4.2 Hz, H-10), 1.78 (3H, s, H-2′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 182.0 (C-2), 172.9 (C-1′), 142.8 (C-9), 132.6 (C-4), 130.8 (C-7), 125.3 (C-5), 124.0 (C-6), 111.6 (C-8), 76.6 (C-3), 38.0 (C-10), 35.6 (C-11), 22.6 (C-2′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[14]，故鑒定化合物6為bacilsubteramide A。

化合物7：淡黃色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀反應(yīng)陽(yáng)性；C20H17N3O2，ESI-MS/: 332.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.91 (1H, br s, H-1), 9.19 (1H, s, H-17), 8.75 (1H, s, H-21), 7.60 (1H, d,= 8.2 Hz, H-9), 7.48 (1H, d,= 8.0 Hz, H-12), 7.19 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-11), 7.16 (1H, s, H-14), 7.02 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-10), 5.61 (1H, s, 19-OH), 5.32 (1H, m, H-19), 4.35 (2H, m, H-5), 3.10 (2H, m, H-6), 1.51 (1H, d,= 6.0 Hz, 3H, H-18)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 160.9 (C-22), 148.8 (C-17), 147.2 (C-21), 138.5 (C-15), 138.1 (C-13), 136.2 (C-3), 134.6 (C-20), 127.5 (C-2), 125.1 (C-8), 124.2 (C-11), 119.6 (C-10), 119.3 (C-9), 118.4 (C-16), 114.2 (C-7), 111.6 (C-12), 93.5 (C-14), 63.6 (C-19), 39.9 (C-5), 24.8 (C-18), 18.9 (C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[15]，故鑒定化合物7為vinmajine I。

化合物8：淡黃色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C20H22N2O3，ESI-MS/: 339.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.12 (1H, s, H-1), 7.39 (1H, d,= 8.0 Hz, H-9), 7.29 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12), 7.07 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-11), 7.01 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-10), 6.54 (1H, d,= 4.2 Hz, 17-OH), 5.38 (1H, q,= 7.2 Hz, H-19), 5.27 (1H, t,= 4.2 Hz, H-17), 5.05 (1H, d,= 5.8 Hz, H-3), 4.78 (1H, dd,= 12.8, 5.8 Hz, H-5α), 4.64 (1H, d,= 12.8 Hz, H-21α), 3.67 (1H, d,= 12.8 Hz, H-21β), 3.01 (1H, dd,= 12.8, 4.8 Hz, H-5β), 2.89 (1H, td,= 13.6, 6.8 Hz, H-14α), 2.78 (1H, m, H-6α), 2.69 (1H, m, H-15), 2.58 (1H, dd,= 15.2, 14.6 Hz, H-6β), 2.39 (1H, dd,= 8.2, 5.8 Hz, H-16), 2.25 (1H, d,= 13.6 Hz, H-14β), 1.48 (3H, d,= 7.2 Hz, H-18)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.0 (C-22), 135.6 (C-13), 134.9 (C-2), 134.8 (C-20), 126.9 (C-8), 120.6 (C-11), 119.4 (C-19), 118.6 (C-10), 117.6 (C-9), 111.5 (C-12), 109.0 (C-7), 91.0 (C-17), 60.1 (C-21), 53.7 (C-3), 42.6 (C-5), 46.3 (C-16), 28.5 (C-15), 26.9 (C-14), 20.6 (C-6), 11.7 (C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[16]，故鑒定化合物8為naucleofficine D。

化合物9：白色無(wú)定形粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C13H10N2O2，ESI-MS/: 227.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.39 (1H, d,= 4.8 Hz, H-3), 8.31 (1H, d,= 4.8 Hz, H-4), 8.19 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.68 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-6), 7.56 (1H, d,= 8.0 Hz, H-8), 7.28 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-7), 4.08 (3H, s, 1-COOCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 167.4 (1-COOCH3), 143.4 (C-1), 139.0 (C-3), 138.1 (C-13), 133.8 (C-10), 130.8 (C-12), 130.6 (C-6), 123.0 (C-5), 121.8 (C-7), 121.7 (C-11), 120.1 (C-4), 113.5 (C-8), 52.9 (1-COOCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[17]，故鑒定化合物9為1-甲氧甲酰-β-咔巴啉。

化合物10：白色無(wú)定型粉末，改良碘化鉍鉀顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C11H9NO2，ESI-MS/: 188.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.33 (1H, d,= 7.8 Hz, H-8), 7.21 (1H, s, H-4), 7.09 (1H, dd,= 7.8, 7.6 Hz, H-7), 7.04 (1H, dd,= 8.0, 7.6 Hz, H-6), 3.86 (1H, dd,= 10.0, 4.2 Hz, H-9a), 3.52 (1H, dd,= 14.8, 4.2 Hz, H-9β), 3.15 (1H, dd,= 14.8, 10.0 Hz, H-9α)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 174.5 (C-3), 138.6 (C-8a), 128.6 (C-4a), 125.3 (C-8), 123.0 (C-7), 119.9 (C-6), 119.3 (C-5), 112.5 (C-4), 109.7 (C-3a), 56.8 (C-9a), 28.6 (C-9)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[18]，故鑒定化合物10為naphthisoxazol A。

化合物11：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C15H10O4，ESI-MS/: 255.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 13.22 (1H, brs, 1-OH), 10.03 (1H, brs, 6-OH), 8.21 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 7.68 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4), 7.63 (1H, d,= 8.0 Hz, H-3), 7.58 (1H, d,= 2.2 Hz, H-5), 7.29 (1H, dd,= 8.2, 2.2 Hz, H-7), 2.28 (3H, s, 2-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 188.9 (C-9), 182.6 (C-10), 164.4 (C-1), 161.5 (C-6), 135.3 (C-3), 132.7 (C-2), 130.8 (C-8), 137.7 (C-9a), 137.2 (C-4a), 127.7 (C-8a), 121.9 (C-7), 119.6 (C-4), 116.0 (C-10a), 113.6 (C-5), 15.8 (2-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[19]，故鑒定化合物11為1,6- dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone。

化合物12：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C16H12O4，ESI-MS/: 269.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.12 (1H, s, 3-OH), 8.16 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 8.10 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 7.91 (1H, dd,= 8.2, 7.8 Hz, H-7), 7.79 (1H, dd,= 8.0, 7.8 Hz, H-6), 7.48 (1H, s, H-4), 3.81 (3H, s, 1-OCH3), 2.16 (3H, s, 2-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.7 (C-10), 179.9 (C-9), 161.5 (C-3), 160.4 (C-1), 134.6 (C-4a), 134.4 (C-7), 133.8 (C-10a), 133.4 (C-6), 131.9 (C-8a), 126.7 (C-8), 125.9 (C-2), 125.8 (C-5), 118.0 (C-9a), 108.9 (C-4), 60.7 (1-OCH3), 8.9 (2-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[20]，故鑒定化合物12為rubiadin-1-methyl ether。

化合物13：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C16H12O6，ESI-MS/: 301.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 13.48 (1H, brs, 1-OH), 9.79 (1H, brs, 3-OH), 8.18 (1H, d,= 8.4 Hz, H-8), 7.58 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5), 7.28 (1H, dd,= 8.2, 2.4 Hz, H-7), 7.25 (1H, s, H-4), 4.72 (2H, s, H2-11), 3.39 (3H, s, 11-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 187.1 (C-9), 182.6 (C-10), 164.2 (C-1), 164.1 (C-3), 163.9 (C-6), 135.5 (C-4a), 130.3 (C-8), 122.2 (C-7), 136.5 (C-10a), 126.5 (C-8a), 117.5 (C-2), 113.4 (C-5), 110.2 (C-9a), 108.4 (C-4), 64.2 (C-11), 58.5 (11-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道波譜數(shù)據(jù)基本一致[21]，故鑒定化合物12為1,3,6-trihydroxy-2- methoxymethyl-9,10-anthraquinone。

化合物14：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C15H10O5，ESI-MS/: 271.1 [M＋H]+1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 8.18 (1H, s, H-1), 7.99 (1H, d,= 8.2 Hz, H-8), 7.52 (1H, s, H-4), 7.43 (1H, d,= 2.3 Hz, H-5), 7.17 (1H, dd,= 8.2, 2.3 Hz, H-7), 4.60 (2H, s, H2-11)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 183.0 (C-10), 180.8 (C-9), 162.8 (C-6), 159.4 (C-3), 136.2 (C-2), 135.3 (C-10a), 133.4 (C-9a), 125.1 (C-4a), 129.7 (C-8), 125.9 (C-1), 125.3 (C-8a), 121.3 (C-7), 112.1 (C-5), 111.2 (C-4), 55.9 (C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[21]，故鑒定化合物14為3,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl- 9,10-anthraquinone。

化合物15：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C9H6O3，ESI-MS/: 163.0 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.01 (1H, d,= 5.8 Hz, H-2), 7.92 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd,= 8.6, 1.9 Hz, H-6), 6.76 (1H, d,= 1.9 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,= 5.8 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 179.6 (C-4), 165.3 (C-7), 159.9 (C-9), 157.6 (C-2), 128.0 (C-5), 118.1 (C-10), 116.7 (C-6), 112.8 (C-3), 103.6 (C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的7-羥基色原酮的波譜數(shù)據(jù)基本一致[22]，故鑒定化合物15為7-羥基色原酮。

化合物16：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C9H6O4，ESI-MS/: 179.0 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.02 (1H, d,= 6.3 Hz, H-2), 6.38 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8), 6.23 (1H, d,= 1.8 Hz, H-6), 6.19 (1H, d,= 6.3 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 183.5 (C-4), 166.3 (C-7), 163.6 (C-5), 160.0 (C-9), 157.9 (C-2), 111.7 (C-3), 106.5 (C-10), 99.9 (C-6), 94.8 (C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[23]，故鑒定化合物16為5,7-二羥基色原酮。

化合物17：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C16H12O5，ESI-MS/: 285.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.62 (1H, d,= 8.2 Hz, H-4), 7.48 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2?), 7.38 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6?), 6.90 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5?), 6.73 (1H, s, H-10), 6.69 (1H, d,= 2.0 Hz, H-7), 6.66 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-5), 3.89 (3H, s, 3?-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 184.3 (C-3), 170.0 (C-6), 168.2 (C-8), 150.3 (C-4?), 149.1 (C-3?), 148.0 (C-2), 127.5 (C-4), 127.0 (C-6?), 116.6 (C-5), 125.3 (C-1?), 115.4 (C-2?), 114.7 (C-10), 114.3 (C-5?), 113.9 (C-9), 99.3 (C-7), 56.3 (3?-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[24]，故鑒定化合物17為6,4?-dihydroxy-3?-methoxyaurone。

化合物18：淡黃色無(wú)定形粉末，三氯化鐵顯色反應(yīng)陽(yáng)性；C16H12O5，ESI-MS/: 285.1 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.01 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 7.52 (1H, dd,= 8.0, 2.2 Hz, H-6?), 7.48 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2?), 7.01 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8), 6.93 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5?), 6.89 (1H, dd,= 8.6, 1.8 Hz, H-6), 6.68 (1H, s, H-3), 4.02 (3H, s, 4?-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 180.2 (C-4), 166.0 (C-2), 164.9 (C-7), 159.8 (C-9), 152.0 (C-4?), 149.6 (C-3?), 127.8 (C-5), 123.9 (C-1?), 121.7 (C-6?), 117.3 (C-10), 117.0 (C-5?), 116.5 (C-6), 110.7 (C-2?), 105.6 (C-3), 103.6 (C-8), 56.8 (4?-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)基本一致[25]，故鑒定化合物18為farnisin。

4 抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性評(píng)價(jià)

以MH7A細(xì)胞為活性評(píng)價(jià)細(xì)胞株，采用MTS法對(duì)分離鑒定的18個(gè)化合物的體外抑制MH7A細(xì)胞增殖活性進(jìn)行測(cè)試，以初步評(píng)價(jià)分離得到的18個(gè)化合物的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，研究中以甲氨蝶呤為陽(yáng)性對(duì)照藥物，具體的活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)操作流程和操作方法見(jiàn)本課題組前期研究報(bào)道[26-28]。

活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明蒽醌類化合物11～14以及黃酮類化合物17和18對(duì)MH7A細(xì)胞表現(xiàn)出了較為顯著的生長(zhǎng)抑制活性，對(duì)MH7A細(xì)胞增殖的抑制活性的IC50值為（8.93±0.09）～（152.58±0.32）μmol/L，分離得到的生物堿類化合物和色原酮類類化合物未表現(xiàn)出明顯的抑制滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的活性（IC50＞300.00 μmol/L）。值得一提的是，蒽醌類化合物11～14以及黃酮類化合物17表現(xiàn)出了優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物甲氨蝶呤對(duì)MH7A細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性，提示其具有顯著的體外抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，具體活性評(píng)價(jià)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 部分化合物抑制MH7A細(xì)胞生長(zhǎng)的活性()

5 討論

本研究綜合運(yùn)用多種色譜分離方法和波譜鑒定技術(shù)對(duì)茜草科虎刺屬植物海南虎刺枝葉的甲醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離鑒定了18個(gè)化合物，包括10個(gè)生物堿類化合物、4個(gè)蒽醌類化合物、2個(gè)色原酮類化合物以及2個(gè)黃酮類化合物，所有化合物均為首次從虎刺屬植物中分離得到。通過(guò)對(duì)所有分離得到的化合物1～18的體外抑制MH7A細(xì)胞增殖活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)分離鑒定的蒽醌類化合物11～14以及黃酮類化合物17和18表現(xiàn)出了較為顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，提示蒽醌類化合物以及黃酮類化合物可能是海南虎刺具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究不僅可為新型天然來(lái)源的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新藥的開(kāi)發(fā)提供重要的技術(shù)支撐，而且可為海南特有植物海南虎刺植物資源的合理開(kāi)發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on chemical constituents from stems and leaves ofand their anti-rheumatoid arthritis activities

LAN Chuang1, XIE Zhen1, SHI Ni-fei1, FU Yong-quan1, XIONG Shu-hong1, LIU Yan-ping1, 2, 3, FU Yan-hui1, 2, 3

1. Key Laboratory of Tropical Medicinal Resource Chemistry of Ministry of Education, Hainan Normal University, Haikou 571126, China 2. Engineering Research Center for Industrialization of Southern Medicinal Plants Resources of Hainan Province, Hainan Normal University, Haikou 571126, China 3. Key Laboratory of Southern Medicinal Plants Resources of Haikou City, Hainan Normal University, Haikou 571126, China

To study the chemical constituents in the stems and leaves of Hainanhuci ()and their anti-rheumatoid arthritis activities.The chemical constituents in the stems and leaves ofwere isolated and purified by silica gel, ODS, Sephadex LH-20 gel column chromatographies and preparative HPLC. The chemical structures of all isolates were identified using physicochemical properties, spectroscopic analyses, as well as the comparisons with the reported data in literature. In addition, all isolates were evaluated for their anti-rheumatoid arthritis activities using MTS method,measuring their anti-proliferative effects on synoviocytes.A total of 18 compounds were isolated from the methanol extract of the stems of, which were identified as naucleidinal (1), 1,2,3,4-tetrahydronorharman-1-one (2), 19--methyl-3,14-dihydro angustoline (3), latifoliamide B (4), latifoliamide D (5), bacilsubteramide A (6), vinmajine I (7), naucleofficine D (8), 1-carbomethoxy-β-carboline (9), naphthisoxazol A (10), 1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone (11), rubiadin-1-methyl ether (12), 1,3,6-trihydroxy-2-methoxymethyl-9,10-anthraquinone (13), 3,6-dihydroxy-2-hydroxy methyl-9,10-anthraquinone (14), 7-hydroxychromone (15), 5,7-dihydroxychromone (16), 6,4?-dihydroxy-3?-methoxyaurone (17), and farnisin (18). Compounds 11–14, 17 and 18 displayed the inhibitory effects on the proliferation of MH7A synovial fibroblast cells with the IC50values in range of (8.93 ± 0.09) to (152.58 ± 0.32) μmol/L.All compounds are isolated from the genusfor the first time, and compounds 11–14, 17 and 18 exhibited remarkable anti-rheumatoid arthritis activities.

(Lo) Lo ex Y. Z. Ruan; naucleidinal; rubiadin-1-methyl ether; farnisin; anti-rheumatoid arthritis activities

R284.1

A

0253 - 2670(2022)24 - 7656 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.002

2022-08-16

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（220RC596，222RC655，2019RC198）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21967008）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32070390）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22067005）；海南省重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)（ZDYF2022SHFZ028）；?？谑兄攸c(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020054，2017050）；海南省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S202211658025，S202211658028）；海南師范大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)實(shí)踐項(xiàng)目（HSRS21-037）

藍(lán) 創(chuàng)，男，碩士研究生，主要從事活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用研究工作。E-mail: 05jilunwen@163.com

劉艷萍，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制研究工作。E-mail: liuyanpinghs@163.com

付艷輝，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事天然活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用研究工作。E-mail: fuyanhui80@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]