基于AHP-熵權(quán)法優(yōu)選黑順片炮制工藝及生物堿類成分動(dòng)態(tài)變化研究

宮靜雯，季 德#，徐瑞杰，李 昱，薛 蓉，屈凌蕓，毛春芹, 2，高 波，郭志俊，胡 雨，陸兔林, 2*，張科衛(wèi)*

·藥劑與工藝·

基于AHP-熵權(quán)法優(yōu)選黑順片炮制工藝及生物堿類成分動(dòng)態(tài)變化研究

宮靜雯1，季 德1#，徐瑞杰1，李 昱1，薛 蓉1，屈凌蕓1，毛春芹1, 2，高 波3，郭志俊3，胡 雨4，陸兔林1, 2*，張科衛(wèi)1*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，江蘇 南京 210023 3. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110 4. 安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 235000

采用主觀評(píng)價(jià)層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法優(yōu)選黑順片炮制工藝，探究炮制過程中生物堿類成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。采用外觀性狀、水溶性浸出物、苯甲酰新烏頭原堿含量、苯甲酰烏頭原堿含量、苯甲酰次烏頭原堿含量、雙酯型生物堿總量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，基于單因素考察結(jié)果，以煮制時(shí)間、水漂次數(shù)、蒸制時(shí)間、干燥溫度為主要因素建立正交實(shí)驗(yàn)，通過AHP-熵權(quán)法優(yōu)選黑順片最佳炮制工藝參數(shù)。采用HPLC法對各炮制環(huán)節(jié)的附子進(jìn)行含量測定，分析比較6種酯型生物堿的含量變化。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%以上的膽巴溶液中浸泡能達(dá)到防腐的目的，且浸泡20 d以上附子的質(zhì)量相對穩(wěn)定。黑順片炮制的最佳工藝條件為煮制時(shí)間8 min，水漂次數(shù)4次，蒸制時(shí)間3 h，干燥溫度60 ℃；炮制過程中雙酯型生物堿總量逐漸降低，泡膽和漂洗過程單酯型生物堿含量降低，煮制和蒸制過程單酯型生物堿含量升高。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的黑順片炮制工藝合理、穩(wěn)定、可行，炮制過程中各環(huán)節(jié)對酯型生物堿類成分均有不同程度的影響，可為進(jìn)一步探討黑順片的現(xiàn)代炮制方法提供參考。

黑順片；主觀評(píng)價(jià)層次分析-熵權(quán)法；炮制工藝；含量測定；成分變化；苯甲酰新烏頭原堿；苯甲酰烏頭原堿；苯甲酰次烏頭原堿；新烏頭堿；次烏頭堿；烏頭堿

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Debx.的子根的加工品，辛、甘，大熱，有毒。具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛等功效[1-2]，被譽(yù)為“回陽救逆第一品藥”。黑順片作為附子炮制品之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛等功效[3-4]。目前《中國藥典》2020年版以及各地方炮制規(guī)范中尚未規(guī)定具體的黑順片炮制工藝參數(shù)，在現(xiàn)代實(shí)際加工中，常出現(xiàn)加工過程不統(tǒng)一造成市場上流通的黑順片質(zhì)量參差不齊，炮制不及或過度的現(xiàn)象，對臨床用藥造成一定的安全隱患，亟待通過科學(xué)的方法，實(shí)現(xiàn)工藝過程規(guī)范化和工藝參數(shù)客觀化。附子的藥效與毒性并存，化學(xué)成分復(fù)雜，主要的生物活性成分為單酯型生物堿和雙酯型生物堿[5-6]，且雙酯型生物堿的毒性遠(yuǎn)高于單酯型生物堿[7]，而炮制后雙酯型生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，部分雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿，達(dá)到“增效減毒”的目的[8]。但由于黑順片的炮制工藝環(huán)節(jié)眾多，目前各炮制環(huán)節(jié)對附子中生物堿類成分的轉(zhuǎn)化和流失的影響尚未明確。本研究采用主觀評(píng)價(jià)層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）結(jié)合客觀評(píng)價(jià)熵權(quán)法優(yōu)選黑順片的炮制工藝參數(shù)，采用HPLC法對黑順片關(guān)鍵炮制節(jié)點(diǎn)的樣品進(jìn)行含量測定，分析6種酯型生物堿的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，厘清炮制工藝對生物堿類成分的影響，為進(jìn)一步對黑順片炮制過程的質(zhì)量變化和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；KQ-500B型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；RE-200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，南京科爾儀器設(shè)備有限公司；H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；MS-105D型電子天平，梅特勒-托利多公司；FA1104N型電子天平，上海菁海儀器有限公司。

1.2 材料

對照品苯甲酰新烏頭原堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.36%，批號(hào)19062701）、苯甲酰烏頭原堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.75%，批號(hào)20092906）、苯甲酰次烏頭原堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.23%，批號(hào)20091402）、新烏頭堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.84%，批號(hào)20091403）、次烏頭堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.50%，批號(hào)20062404）、烏頭堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.46%，批號(hào)20092804）均購自南京金益柏生物科技有限公司；甲醇，色譜純，批號(hào)20201103，購自永華化學(xué)股份有限公司；乙腈（批號(hào)JA113030）、四氫呋喃（批號(hào)l1083001023），色譜純，購自默克股份兩合公司；乙酸銨，批號(hào)20201210，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸，批號(hào)1801101，購自上海申博化工有限公司。附子，批號(hào)20210629，購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭.Debx.的子根的加工品；附子炮制用膽巴，批號(hào)202106032產(chǎn)品符合川食藥監(jiān)注［2012］9號(hào)，購自四川金卓筒化工科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 黑順片炮制工藝研究

2.1.1 黑順片的炮制方法 取泥附子，按大小分別洗凈，浸入膽巴的水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，水浸漂，縱切成厚度約0.5 cm的附子片，再用水浸漂，用調(diào)色液（紅糖水菜油混合溶液）使附片染成濃茶色，取出，蒸至出現(xiàn)油面、光澤后，烘至半干，再曬干或繼續(xù)烘干，習(xí)稱“黑順片”[1]。

2.1.2 外觀性狀評(píng)分 參照《中國藥典》2020年版一部黑順片項(xiàng)下的性狀描述，選擇色澤、質(zhì)地、氣味3個(gè)指標(biāo)為考察對象，對制得的黑順片各批次樣品外觀性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 黑順片外觀性狀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.1.3 水溶性浸出物的測定 臨床中，黑順片常以水煎為主入藥，以水溶性浸出物為指標(biāo)，按《中國藥典》2020年版[1]浸出物測定法四部通則（通則2201）水溶性浸出物測定，按干燥品計(jì)算水溶性浸出物含量。

2.1.4 單酯型生物堿含量測定

（1）色譜條件：色譜柱為Purospher?Star LP RP18endcapped（250 mm×4.6 mm，5 μm），參照《中國藥典》2020年版[1]附子項(xiàng)下含量測定方法，以乙腈-四氫呋喃（25∶15）為流動(dòng)相A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1升加冰醋酸0.5 mL）為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序：0～48 min，15%～26% A；48～49 min，26%～35% A；49～58 min，35% A；58～65 min，35%～15% A；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量10 μL；混合對照品和黑順片樣品在235 nm波長下的色譜圖見圖1。

（2）供試品溶液的制備：取黑順片粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-醋酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-醋酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?二氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1-苯甲酰新烏頭原堿 2-苯甲酰烏頭原堿 3-苯甲酰次烏頭原堿 4-新烏頭堿 5-次烏頭堿 6-烏頭堿

（3）對照品溶液的制備：取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）溶液制備成分別含苯甲酰新烏頭原堿70.490 μg/mL、苯甲酰烏頭原堿15.015 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿14.970 μg/mL的混合對照品溶液。

（4）含量測定：取按“2.1.4（2）”項(xiàng)下方法制備的各黑順片供試品溶液，采用“2.1.4（1）”項(xiàng)下色譜條件測定各成分的峰面積，按干燥品計(jì)算3個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.1.5 雙酯型生物堿含量測定

（1）色譜條件：同“2.1.4（1）”項(xiàng)下色譜條件。

（2）供試品溶液的制備：同“2.1.4（2）”項(xiàng)下。

（3）對照品溶液的制備：取新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品適量，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）溶液，制備成分別含新烏頭堿14.730 μg/mL、次烏頭堿14.610 μg/mL、烏頭堿6.961 μg/mL的混合對照品溶液。

（4）含量測定：取按“2.1.4（2）”項(xiàng)下方法制備的各黑順片供試品溶液，采用“2.1.5（1）”項(xiàng)下色譜條件測定各成分的峰面積，計(jì)算雙酯型生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.1.6 AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合評(píng)分

（1）AHP確定權(quán)重系數(shù)（W）：層次分析法是1種將復(fù)雜事件系統(tǒng)化和層次化的分析方法，其優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)主觀經(jīng)驗(yàn)判斷各指標(biāo)先后順序，建立目標(biāo)-指標(biāo)-方案層次結(jié)構(gòu)模型。通過兩兩對比的方法確定因素相對于目標(biāo)的重要性程度，建立每一層次因素的判斷矩陣，求得合理有效的W[9]，可適合中藥多指標(biāo)綜合評(píng)分中W的確定。根據(jù)文獻(xiàn)研究[10-12]中各指標(biāo)的重要程度，將各指標(biāo)W予以量化。《中國藥典》2020年版中規(guī)定，3種單酯型生物堿總量下限和雙酯型生物堿的總量上限，雙酯型生物堿是附子及黑順片的毒性成分，同時(shí)是強(qiáng)心、抗炎鎮(zhèn)痛的藥效成分[5-6]，炮制過程中要避免加工過度導(dǎo)致雙酯型生物堿完全消失。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正交工藝的各組合中雙酯型生物堿含量均符合《中國藥典》2020年版的規(guī)定。由于3種雙酯型生物堿含量較低，以雙酯型生物堿總量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)并優(yōu)先排序，3種單酯型生物堿分別作為評(píng)價(jià)指標(biāo)賦予相同W。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)研究[9-11]中以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各指標(biāo)的重要程度，將各指標(biāo)W予以量化，確定各指標(biāo)優(yōu)先順序：雙酯型生物堿總量＞苯甲酰新烏頭原堿含量＝苯甲酰烏頭原堿含量＝苯甲酰次烏頭原堿含量＞水溶性浸出物＞外觀性狀，并賦予各項(xiàng)指標(biāo)的相對評(píng)分，指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣見表2，根據(jù)冪法計(jì)算各指標(biāo)的W。得到W后需對矩陣進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，得到一致性檢驗(yàn)參數(shù)max＝6.0，一致性指標(biāo)（consistency index，CI）＝0.0，隨機(jī)一致性比率（consistency ratio，CR）＝0.0＜0.1，表明該矩陣具有一致性。

表2 6項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)成對比較優(yōu)先判斷矩陣及Wj

（2）熵權(quán)法確定W：熵權(quán)法相對主觀賦權(quán)法具有較高的可信度和精確度，且算法簡單，是1種客觀賦權(quán)法[13]。將第個(gè)試驗(yàn)的個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)利用離差標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)（Y），計(jì)算概率矩陣（P）。按下列公式計(jì)算指標(biāo)信息熵（H）及熵權(quán)系數(shù)（W）。

Y＝(X－min)/(max－min)

H＝?PlnP，＝1/lnW＝(1－H)/(1－H)，0≤W≤1，W＝1

由公式可知，信息熵越小，熵權(quán)系數(shù)越大，即X值相差越大，表明該指標(biāo)傳遞的信息量越多，作用越大，其權(quán)重越大。各指標(biāo)的H和W計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 6個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的Ht和Wt

（3）AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合評(píng)分：AHP法屬于主觀賦值法，在根據(jù)決策者意圖確定權(quán)重方面比客觀賦權(quán)法（熵權(quán)法）具有更大的優(yōu)勢，但存在主觀因素對整個(gè)過程影響較大的問題；采用熵權(quán)法有著客觀優(yōu)勢，但不能反映出參與決策者對不同指標(biāo)重視程度。因此，采用AHP和熵權(quán)法相結(jié)合的組合賦權(quán)方法，能夠彌補(bǔ)單一賦權(quán)帶來的不足[14-15]。按照下列公式計(jì)算指標(biāo)的復(fù)合權(quán)重系數(shù)（Z）。外觀性狀、水溶性浸出物、苯甲酰新烏頭原堿含量、苯甲酰烏頭原堿含量、苯甲酰次烏頭原堿含量、雙酯型生物堿總量的Z分別為0.037、0.085、0.122、0.110、0.200、0.447。根據(jù)Z，得到綜合評(píng)分（）。

＝0.037×100×(外觀性狀/外觀性狀最大值)＋0.085×100×(水溶性浸出物含量/水溶性浸出物含量最大值)＋0.122×100×(苯甲酰新烏頭原堿含量/苯甲酰新烏頭原堿含量最大值)＋0.110×100×(苯甲酰烏頭原堿含量/苯甲酰烏頭原堿含量最大值)＋0.200×100×(苯甲酰次烏頭原堿含量/苯甲酰次烏頭原堿含量最大值)＋0.447×100×(雙酯型生物堿總量/雙酯型生物堿總量最大值)

2.1.7 單因素考察 傳統(tǒng)的黑順片炮制過程中，泡膽、蒸煮等因素都會(huì)影響黑順片中的6種酯型生物堿含量，以性狀、單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量及比值[16]等指標(biāo)，對膽巴質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、煮制時(shí)間、水漂次數(shù)、蒸制時(shí)間、干燥溫度進(jìn)行單因素考察，每個(gè)單因素考察試驗(yàn)平行考察3次，取單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量的均值作為測定結(jié)果。

（1）泡膽工藝：考察附子浸泡的膽巴質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、20%、30%、40%）和浸泡天數(shù)（10、15、20、25、30 d）對附子防腐效果和生物堿含量的影響，結(jié)果見表4，結(jié)果顯示低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽巴溶液（10%、20%）在室溫下分別于7、10 d出現(xiàn)霉菌，因此選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%以上的膽巴溶液進(jìn)行泡膽可達(dá)到防止腐爛的目的；30%、40%膽巴溶液浸泡后單酯型生物堿含量下降趨勢明顯，10 d后趨于穩(wěn)定，降低率達(dá)到92.9%、90.6%；雙酯型生物堿含量20 d后趨于穩(wěn)定，降低率達(dá)到38.7%、39.0%。因此后期實(shí)驗(yàn)均選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的膽巴溶液浸泡20 d的附子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（2）煮制時(shí)間：經(jīng)實(shí)地調(diào)研，選擇煮制時(shí)間為5、10、15、20 min進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，觀察附子性狀特征，測定生物堿含量變化，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，煮制時(shí)間對單酯型和雙酯型生物堿含量的變化影響很小。以《中國藥典》2020年版中規(guī)定的煮制終點(diǎn)“透心”為指標(biāo)，煮制5 min后尚未透心，煮制20 min后藥材“傷水”；煮制10～15 min符合性狀要求。因此，選擇10 min作為最佳煮制時(shí)間。

（3）水浸漂次數(shù)：確定煮制時(shí)間10 min，設(shè)置24 h內(nèi)水漂次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次，考察水漂次數(shù)對浸泡液中Ca2+含量及黑順片中單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量的影響，結(jié)果見表6。下降率計(jì)算公式為下降率＝(下降前的含量數(shù)值－下降后的數(shù)值)/下降前的數(shù)值。相較第1次漂洗，漂洗2次后浸泡液中Ca2+含量下降13.3%，第3、4、5次下降率，分別為86%、87%、90%，漂洗3～5次均可基本漂盡鹽分；隨著水漂次數(shù)的增加，單酯型生物堿含量和雙酯型生物堿含量均逐漸降低。

表4 泡膽工藝對黑順片中生物堿含量的影響(,n=3)

表5 煮制時(shí)間對黑順片性狀及其生物堿含量的影響(, n = 3)

表6 水漂次數(shù)對浸泡液中Ca2+含量及黑順片中單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量的影響(, n = 3)

“?”未檢出

“?” not detected

（4）蒸制時(shí)間：設(shè)置蒸制時(shí)間分別為2、3、4、5 h，考察蒸制時(shí)間對黑順片中單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量的影響，結(jié)果見表7。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒸制2 h后均符合“油面、有光澤”的性狀要求；蒸制過程中，主要是雙酯型生物堿向單酯型生物堿轉(zhuǎn)化過程，以達(dá)到炮制減毒的目的，且雙酯型生物堿的含量隨蒸制時(shí)間的增加而減小，單酯型生物堿含量先上升后下降。單一比較單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量難以客觀全面反映黑順片質(zhì)量，根據(jù)文獻(xiàn)研究[16]計(jì)算3種單酯型生物堿總含量與3種雙酯型生物堿總含量的比值，比值越大，可認(rèn)為其品質(zhì)也相對更優(yōu)。因此，以單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量比值為指標(biāo)進(jìn)行蒸制時(shí)間的選擇。蒸制2～3 h單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量比值呈上升趨勢，3～5 h呈下降趨勢，在蒸制3 h時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇3 h作為最佳蒸制時(shí)間。

（5）干燥溫度：設(shè)置干燥溫度分別為55、60、65、70、75 ℃，考察干燥溫度對單酯型生物堿與雙酯型生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值的影響，結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，干燥后的黑順片性狀、含量測定及水分等檢查項(xiàng)均符合《中國藥典》2020年版規(guī)定，且不同溫度下酯型生物堿含量差別不大；55～60 ℃時(shí)單酯型生物堿與雙酯型生物堿的含量比呈上升趨勢，60～75 ℃時(shí)含量比逐漸下降，干燥溫度為60 ℃時(shí)含量比最大。因此，選擇60 ℃作為最佳干燥溫度。

表7 蒸制時(shí)間對黑順片中單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量的影響(, n = 3)

表8 干燥溫度對質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值的影響(, n = 3)

2.1.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及復(fù)合評(píng)分結(jié)果分析 取附子藥材9份，每份500 g，浸泡在膽巴水溶液中數(shù)日后，連同浸液煮至透心，撈出，水浸漂，縱切成厚度約為0.5 cm的附子片，再用水浸漂，用調(diào)色液（紅糖水菜油混合溶液）使附片染成濃茶色，取出，蒸至出現(xiàn)油面、光澤后，烘至半干，再曬干或繼續(xù)烘干。根據(jù)文獻(xiàn)研究[17-18]及前期單因素實(shí)驗(yàn)，將煮制時(shí)間（A）分別設(shè)定為8、10、12 min，切片后24 h內(nèi)水浸漂次數(shù)（B）分別設(shè)定為3、4、5次，蒸制時(shí)間（C）分別設(shè)定為2、3、4 h，干燥溫度（D）分別設(shè)定為55、60、65 ℃。按表9進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并測定各項(xiàng)指標(biāo)成分含量，試驗(yàn)結(jié)果見表9，正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果見10，方差分析結(jié)果見表11。

方差結(jié)果顯示，黑順片炮制工藝中各因素對AHP-熵權(quán)法影響程度大小為C＞A＞D＞B，根據(jù)方差分析與直觀分析，最佳炮制工藝為A1B2C2D2，即煮制8 min，24 h內(nèi)水浸漂4次，蒸制3 h，60 ℃干燥7.5 h。

2.2 最佳炮制工藝驗(yàn)證

取附子藥材按大小分別洗凈，浸入膽巴的水溶液中數(shù)日，連同浸液煮制8 min后達(dá)到透心，撈出后水漂，縱切成厚約0.5 cm，24 h內(nèi)水浸漂4次，用調(diào)色液使附片染成濃茶色，取出，蒸制3 h出現(xiàn)油面、光澤后，取出，在60 ℃的溫度下干燥7.5 h，即得。按照優(yōu)選出的黑順片最佳炮制工藝條件平行制備3份樣品，分別測定各指標(biāo)的含量及外觀性狀，RSD值均小于3.0%，說明該工藝合理可行，結(jié)果如表12所示。

表9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表10 正交試驗(yàn)直觀分析

表11 方差分析

2.3 黑順片炮制過程中6種生物堿變化分析

2.3.1 樣品制備 根據(jù)AHP-熵權(quán)法優(yōu)選出的黑順片炮制工藝參數(shù)，分別稱取炮制過程各節(jié)點(diǎn)（生附子、膽附子、煮附子、漂附片、蒸附片、黑順片）樣品干燥打粉。

2.3.2 色譜條件 同“2.1.4（1）”項(xiàng)下色譜條件。

2.3.3 供試品溶液的制備 同“2.1.4（2）”項(xiàng)下。

2.3.4 對照品溶液的制備 精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）溶液制成上述6種成分的混合對照品溶液。

表12 黑順片炮制工藝正交驗(yàn)證結(jié)果

2.3.5 含量測定 取各炮制節(jié)點(diǎn)樣品粉末，按“2.1.4（2）”項(xiàng)下方法制備各樣品對應(yīng)的供試品溶液，采用“2.3.2”項(xiàng)色譜條件測定各成分峰面積，計(jì)算6種酯型生物堿的含量，結(jié)果見表13。

（1）苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量變化規(guī)律：由表13可知，泡膽工藝和漂洗工藝后3種單酯型生物堿含量下降；煮制和蒸制之后，3種單酯型生物堿含量增加。

表13 各炮制節(jié)點(diǎn)附子樣品中6種生物堿成分含量測定結(jié)果(, n = 3)

“?”表示低于檢測限，下表同

“?” means below detection limit, same as below tables

（2）新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量變化規(guī)律：由表13可知，炮制過程中新烏頭堿、次烏頭堿含量呈下降趨勢；烏頭堿含量在煮制后呈下降趨勢。

（3）單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量變化規(guī)律：由表13可知，在黑順片的炮制過程中，生附子單酯型生物堿與雙酯型生物堿含量最高；3種雙酯型生物堿含量變化呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，泡膽和漂洗降低單酯型生物堿含量，煮制和蒸制升高單酯型生物堿含量。泡膽后，單酯型生物堿比生附子降低86.3%，雙酯型生物堿比生附子降低22.0%；煮制后對比膽附子，單酯型生物堿增長54.2%，雙酯型生物堿降低11.6%；清水浸漂后，相比煮附子，單酯型生物堿和雙酯型生物堿分別降低75.3%、88.3%；蒸制后發(fā)現(xiàn)，與上一步驟相比單酯型生物堿增長267.5%，雙酯型生物堿降低85.2%。

3 討論

附子中單酯型生物堿藥效活性較強(qiáng)，雙酯型生物堿是活性成分兼毒性成分[19-20]，需炮制后入藥。傳統(tǒng)的黑順片炮制工藝加工步驟繁瑣，多炮制工序?qū)ι飰A類成分的變化都均有不同程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)，泡膽時(shí)間和泡膽質(zhì)量分?jǐn)?shù)都對附子質(zhì)量有一定的影響。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽巴溶液下，雙酯型生物堿在浸泡10 d時(shí)呈升高趨勢，浸泡15 d時(shí)逐漸下降，在浸泡20 d時(shí)含量基本穩(wěn)定。根據(jù)文獻(xiàn)研究[21-22]，推測在膽巴浸泡的濕熱環(huán)境下，附子酯型生物堿成分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易發(fā)生轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致雙酯型生物堿成分含量異常。新鮮的附子易腐爛，產(chǎn)地采收加工時(shí)需膽巴浸泡防腐保鮮。但膽巴中所含大量鈣、鎂等金屬離子，對人體消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)有一定毒性和刺激作用，需在后續(xù)工藝中漂洗去膽。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，泡膽和漂洗工藝均導(dǎo)致單酯型生物堿和雙酯型生物堿流失嚴(yán)重，經(jīng)膽巴炮制后的附子常溫清水沖洗也會(huì)導(dǎo)致附子中的有效成分流失；且隨著漂洗次數(shù)的增多，膽巴殘留量和酯型生物堿含量也逐漸降低。文獻(xiàn)研究[23-25]發(fā)現(xiàn)，以無膽炮制工藝也能夠較好的保留有效成分、降低毒性成分，“去毒存性”能力較好。在解決附子產(chǎn)地加工防腐問題的前提下，沒有膽巴浸泡的黑順片炮制工藝可以進(jìn)行更好的推廣，從而提升黑順片在臨床應(yīng)用的藥效。通過產(chǎn)地調(diào)研及文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，膽巴浸泡的主要原因是防止新鮮附子的腐爛。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮的附子在質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的膽巴溶液浸泡20 d能夠達(dá)到較好的防腐效果，能夠?qū)?shí)際生產(chǎn)中膽巴用量及浸泡時(shí)間起到一定的指導(dǎo)作用，有效規(guī)范黑順片泡膽過程，保證黑順片炮制規(guī)范，質(zhì)量可控，便于后期運(yùn)用在加工生產(chǎn)中。

在煮制和蒸制過程中單酯型生物堿含量上升，原因可能是在加熱條件下雙酯型生物堿易水解為低毒或無毒的單酯型生物堿或醇胺型生物堿；而在雙酯型生物堿含量較低的情況下，單酯型生物堿含量蒸制后仍舊提升顯著，與譚茂蘭等[26]基于酯型生物堿含量變化選擇蒸制附片的研究發(fā)現(xiàn)相同，說明單酯型生物堿的不完全來自于雙酯型生物堿，也可能有其他的轉(zhuǎn)化途徑。后續(xù)可通過UPLC-Q-TOF-MS分析對比蒸制前后的化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步挖掘單酯型生物堿的生成途徑。研究表明，蒸制工藝在黑順片的炮制工藝中是關(guān)鍵一環(huán)，葉強(qiáng)等[27]研究發(fā)現(xiàn)蒸制工藝能夠提高附子中酯型生物堿的含量，但蒸制時(shí)間過長也可能造成生物堿成分的流失，因此選擇合適的蒸制工藝參數(shù)對附子的炮制能夠起到更優(yōu)的效果。

目前，膽巴浸泡為現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中收載的黑順片炮制步驟，且由于采收期、生產(chǎn)設(shè)備及要求的限制，附子防腐問題尚未得到很好地解決，黑順片產(chǎn)地加工仍需要泡膽儲(chǔ)存。傳統(tǒng)的黑順片炮制工藝沒有明確統(tǒng)一的工藝參數(shù)，影響臨床用藥的安全性和有效性。如何以最優(yōu)化的炮制工藝在減毒的同時(shí)保證有效性是黑順片炮制工藝必須面對的問題。本研究以3種單酯型生物堿含量和雙酯型生物堿總量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合AHP-熵權(quán)法實(shí)現(xiàn)主客觀內(nèi)在統(tǒng)一，削弱主觀評(píng)價(jià)的隨機(jī)性和客觀評(píng)價(jià)的局限性[28]，優(yōu)選出的黑順片炮制工藝，既能夠符合《中國藥典》2020年版中對于黑順片含量測定的要求，又在降低毒性的前提下保留雙酯型生物堿成分。同時(shí)采用HPLC法測定黑順片炮制工藝中各關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，探討6種酯型生物堿成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，分析各炮制工藝對酯型生物堿類含量的影響，以期為后續(xù)現(xiàn)代炮制工藝的優(yōu)化和改進(jìn)提供理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of processing technology of Heishunpian based on AHP-entropy weight method and study on dynamic changes of alkaloids

GONG Jing-wen1, JI De1, XU Rui-jie1, LI Yu1, XUE Rong1, QU Ling-yun1, MAO Chun-qin1, 2, GAO Bo3, GUO Zhi-jun3, HU Yu4, LU Tu-lin1, 2, ZHANG Ke-wei1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Provincial Engineering Research Center of TCM External Medication Development and Application, Nanjing 210023, China 3. China Resources Sanjiu Medical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518110, China 4. Anhui Huarun Jinchan Pharmaceutical Co., Ltd., Huaibei 235000, China

The subjective evaluation analytical hierarchy process (AHP) and entropy weight method were used to optimize the concoction process of Heishunpian and investigate the dynamic changes of alkaloid components during the concoction process.Appearance properties, water-soluble extracts, content of benzoylmesaconine, content of benzoyl aconitine, content of benzoylhypacoitine, and total amount of diester diterpenoid alkaloids were used as evaluation indicators. Based on the results of single factor investigation, an orthogonal experiment was established with cooking time, water bleaching times, steaming time and drying temperature as the main factors. The content of aconite in each processing link was determined by HPLC, and the content changes of six ester alkaloids were analyzed and compared.The soaking in brine solution with a concentration of more than 20% can achieve the purpose of antisepsis, and the quality of aconite soaked for more than 20 days was relatively stable. The optimum process conditions for processing Heishunpian were as follows: cooking time 8 min, water bleaching times 4 times, steaming time 3 h, and drying temperature 60 ℃; During the processing, the total amount of diester alkaloids gradually decreased, the content of monoester alkaloids decreased during soaking and rinsing, and the content of monoester alkaloids increased during cooking and steaming.The processing technology of Heishunpian obtained by the experimental optimization is reasonable, stable and feasible. Each link in the processing process has different degrees of effect on the components of ester alkaloids, which can provide a reference for further discussion of modern processing methods of Heishunpian.

Heishunpian; subjective evaluationAHP-entropy method; processing technology; content determination; composition change;benzoylmesaconine; benzoylaconitine; benzoylhypacoitine; mesaconitine; hypaconitine; aconitine

R283.1

A

0253 - 2670(2022)24 - 7686 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.006

2022-05-26

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中藥飲片質(zhì)量識(shí)別關(guān)鍵技術(shù)研究”項(xiàng)目資助（2018YFC1707000）；2021年度康緣中藥學(xué)院創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目“黑順片炮制工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”（kyxysc18）

宮靜雯（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail: a18848986602@163.com

陸兔林，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥中藥炮制與飲片質(zhì)量研究。Tel: 13951636763 E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

張科衛(wèi)，博士，副教授，主要從事中藥炮制與飲片質(zhì)量研究。E-mail: kewei@njucm.edu.cn

#共同第一作者：季 德，博士，副教授，主要從事中藥炮制與飲片質(zhì)量研究。E-mail: de.ji@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]