淺析PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

◎ 許競(jìng)思

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350000）

隨著人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，食品安全問題在人們心中的關(guān)注度不斷提升，這在一定程度上促進(jìn)了我國食品安全檢查部門在工作上的調(diào)整與發(fā)展。采用更加先進(jìn)的技術(shù)進(jìn)行食品安全檢測(cè)，能夠進(jìn)一步保證食品質(zhì)量，確保消費(fèi)者能夠購買到放心的食品。相對(duì)于其他微生物檢測(cè)技術(shù)，PCR檢測(cè)技術(shù)依靠其高精準(zhǔn)性和高效率等特點(diǎn)脫穎而出，在一定程度上給食品檢測(cè)部門的食品微生物檢測(cè)工作帶來了巨大便利。通過該技術(shù)的應(yīng)用，能夠在更短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出食品中的致病菌情況，例如某地出現(xiàn)食物中毒群體事件，通過PCR檢測(cè)技術(shù)快速檢出食物中的病原微生物種類，及時(shí)為患者的救治提供方向；并且PCR檢測(cè)技術(shù)能夠通過實(shí)驗(yàn)的方式推斷出食品在生產(chǎn)后階段內(nèi)微生物的繁殖速度與最大繁殖量，能夠在具有預(yù)見性的基礎(chǔ)上對(duì)食品安全進(jìn)行有效檢查。

1 PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測(cè)中的作用

1.1 PCR技術(shù)原理

PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)的原理可簡(jiǎn)要概括為：經(jīng)高溫變形、低溫退火及中溫延伸等3步不同環(huán)節(jié)反復(fù)操作，從而檢測(cè)微生物的核酸序列，通過利用單個(gè)核酸分子序列完成復(fù)制，達(dá)到擴(kuò)增的目的。具體分析PCR技術(shù)的應(yīng)用原理，需根據(jù)溫度不同整合信息，即高溫變形[1]。被檢測(cè)食品微生物處于雙鏈狀態(tài)的DNA序列于溫度高達(dá)94 ℃狀況下變性，成功解鏈，以雙鏈形式存在，低溫退火。55 ℃下，被檢測(cè)微生物特異性引物與處于單鏈狀態(tài)的DNA進(jìn)行融合，中溫延伸。72 ℃下，需以被檢測(cè)微生物引物的引導(dǎo)延伸為條件進(jìn)行復(fù)制，檢測(cè)微生物的DNA序列。以上所述3點(diǎn)，PCR的應(yīng)用需反復(fù)操作，直至獲取足量被檢測(cè)微生物的DNA序列，以達(dá)到PCR技術(shù)檢測(cè)要求。

1.2 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)是食品進(jìn)行微生物檢測(cè)中的主要技術(shù)手段，其主要依靠的是熒光傳遞技術(shù)對(duì)微生物基因進(jìn)行標(biāo)記，并通過記錄不同時(shí)間內(nèi)被標(biāo)記DNA的數(shù)量，檢測(cè)微生物的繁殖能力。在該技術(shù)的具體實(shí)施中，主要是依賴受體發(fā)色團(tuán)之間的偶極—負(fù)極之間的相互影響與相互聯(lián)系實(shí)現(xiàn)的，并結(jié)合能量進(jìn)行轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行檢測(cè)，供體發(fā)色基因-受體發(fā)色基因會(huì)表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的熒光，并且熒光的強(qiáng)度與DNA的產(chǎn)生數(shù)量呈正比關(guān)系[2]。所以在進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)的過程中，可以將該技術(shù)應(yīng)用其中，通過記錄靶序列初始濃度，檢測(cè)反應(yīng)過程中熒光實(shí)際濃度來得到所需要的檢測(cè)結(jié)果。在該檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用中，能夠?qū)κ称分兴械奈⑸镞M(jìn)行基因標(biāo)記和基因復(fù)制，即使食品中含有的微生物數(shù)量較少，同樣可以通過標(biāo)記與記錄初始濃度的方式進(jìn)行食品微生物檢測(cè)。該檢測(cè)方式具有自動(dòng)化高，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，適用于我國當(dāng)前的食品環(huán)境市場(chǎng)。因此，該檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際檢測(cè)中得到諸多應(yīng)用，有著極高的發(fā)展與普及速度。

2 PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的測(cè)定方法

PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中有著十分出眾的表現(xiàn)，并且應(yīng)用范圍廣泛。例如，在食品檢測(cè)中最常見的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等，都能夠通過PCR檢測(cè)方式進(jìn)行有效檢測(cè)。以金黃色葡萄球菌為例，其在水果、蔬菜中繁殖速度很快，如果水果、蔬菜存放時(shí)間較久，則果蔬的表面很容易繁殖大量的金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物腸毒素對(duì)人體的損傷很大，嚴(yán)重的情況下會(huì)導(dǎo)致食用者出現(xiàn)食物中毒情況。因此，在對(duì)食品檢查的過程中，就需要對(duì)類似菌進(jìn)行科學(xué)檢查，排除其給人體造成的威脅隱患。本文所研究的PCR技術(shù)，就能夠?qū)Ρ粰z測(cè)食物樣品中的相關(guān)物質(zhì)及微量元素進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)精準(zhǔn)度極高，食品生產(chǎn)企業(yè)采用該技術(shù)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，能夠有效避免這些不合格的食品流入市場(chǎng)[3]。在具體檢測(cè)中，其主要的檢測(cè)手段是對(duì)特定蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并且通過對(duì)蛋白的檢測(cè)，間接獲得被檢測(cè)微生物的含量。PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用十分廣泛，能夠針對(duì)不同被檢測(cè)菌展開有效檢測(cè)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)法

常規(guī)PCR檢測(cè)法是進(jìn)行食品微生物檢測(cè)中最常用的檢測(cè)手段，其主要是針對(duì)測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)的DNA模板和與其反應(yīng)的引物進(jìn)行混合。在檢測(cè)的過程中，在混合后的混合物內(nèi)加入一定量的聚合酶就能夠制作成最基本的檢測(cè)樣本。在后期的檢測(cè)中，還需要在特定的溫度與反應(yīng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)反應(yīng)。在適合的溫度下，添加了聚合酶的混合物會(huì)在聚合酶的作用下促使目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行基于電腦模板序列下的擴(kuò)增，在經(jīng)過多個(gè)周期后，模板DNA片段可以不斷地復(fù)制與擴(kuò)增。在實(shí)際檢測(cè)工作開展中，測(cè)定物上特定DNA能夠反映出被檢測(cè)食物在特定時(shí)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)生的物生物種類與數(shù)量。常規(guī)的檢測(cè)手段主要是利用了DNA的復(fù)制能力與擴(kuò)增能力，將潛在的、少量的微生物群形成可觀的微生物群，實(shí)現(xiàn)基本的食品微生物檢測(cè)。

2.2 多重PCR檢測(cè)法

多重PCR檢測(cè)法是基于常規(guī)檢測(cè)方法上進(jìn)行改變與創(chuàng)新形成的檢測(cè)方法。常規(guī)檢測(cè)方法采用的是單引物的方式進(jìn)行檢測(cè)，而多重PCR檢測(cè)手段則是采用多個(gè)DNA引物進(jìn)行檢測(cè)。例如，在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)，需要加入兩個(gè)或兩個(gè)以上的反應(yīng)引物，這些反應(yīng)引物同樣需要在聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。由于在反應(yīng)前加入了多個(gè)DNA引物，再通過聚合酶反應(yīng)后，能夠得到多個(gè)不同的DNA反應(yīng)片段。因此，多重PCR檢測(cè)方式能夠針對(duì)微生物的多個(gè)致病因子進(jìn)行分析與測(cè)定，可以大幅度提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率與效率。相比較常規(guī)PCR檢測(cè)法而言，其所分析出的致病因子更多，可以避免檢測(cè)過程中出現(xiàn)被檢測(cè)菌遺漏的情況，是提高檢測(cè)嚴(yán)謹(jǐn)性的有效方法。因此，在當(dāng)前食品微生物檢測(cè)中，除了對(duì)具有針對(duì)性的致病菌進(jìn)行檢測(cè)以外，大多數(shù)情況下會(huì)采用多重PCR檢測(cè)法進(jìn)行食品微生物檢測(cè)，能夠在最大程度上降低檢測(cè)內(nèi)容遺漏的情況發(fā)生，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確率。并且該檢測(cè)法能夠減少樣本的投入量，在一定程度上還具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，在檢測(cè)過程中可以直接對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 PR-PCR檢測(cè)法

PR-PCR檢測(cè)是PCR檢測(cè)法的一種變形，其與常規(guī)檢測(cè)法存在一定的區(qū)別，但是在食品微生物檢測(cè)工作中卻具有一定的優(yōu)勢(shì)。該方法的檢測(cè)原理主要是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用01igo（dT）或隨機(jī)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。該檢測(cè)法與常規(guī)檢測(cè)法的區(qū)別在于將檢測(cè)目標(biāo)中的一條RNA先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到與之互補(bǔ)的DNA，并以此目標(biāo)為基礎(chǔ)進(jìn)行后期的復(fù)制和擴(kuò)增。在該技術(shù)實(shí)施中，需要重點(diǎn)注意的是所逆轉(zhuǎn)錄的DNA模板必須是完整的，并且不含有蛋白質(zhì)或者是其他雜質(zhì)，這條基因鏈必須完整。在后期的微生物檢測(cè)工作開展中，可以用于微生物檢測(cè)的定量分析，如將熒光技術(shù)與數(shù)字技術(shù)結(jié)合的PCR檢測(cè)，通過將所測(cè)定目標(biāo)中的微生物進(jìn)行定量的方式進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，能夠確保檢測(cè)過程具有較高的靈敏性，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。在實(shí)際食品微生物檢測(cè)工作開展中，運(yùn)用PR-PCR檢測(cè)法，能夠具有針對(duì)性地檢測(cè)微生物，可以確保檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度更高。

3 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用到食物、水源的檢測(cè)中，其在微生物檢測(cè)中占有重要的地位。

3.1 用于食品致病菌的檢測(cè)

傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)手段十分落后，不僅檢測(cè)過程煩瑣，而且檢測(cè)的準(zhǔn)確率難以得到保障。在傳統(tǒng)的檢測(cè)手段下進(jìn)行食品微生物檢測(cè)，需要對(duì)被檢測(cè)的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，當(dāng)其數(shù)量在樣品中達(dá)到可檢測(cè)水平后才能夠進(jìn)行微生物分離，并對(duì)微生物的形態(tài)特征等進(jìn)行鑒定。該種檢測(cè)模式不僅需要人工培養(yǎng)微生物，在培養(yǎng)的過程中還容易出現(xiàn)各種突發(fā)情況，導(dǎo)致所培養(yǎng)的微生物并不能夠用于檢測(cè)。但相比之下，PCR檢測(cè)方式就有著較大的突破，PCR檢測(cè)方式能夠針對(duì)細(xì)菌中的編碼rRNA進(jìn)行擴(kuò)增和復(fù)制，通過擴(kuò)增方式得到所需要的DNA片段，并通過片段檢測(cè)的方式，能夠高效便捷地獲得致病菌的存在情況[4]。另外，PCR檢測(cè)方式還能夠?qū)⑷斯o法培養(yǎng)的或培養(yǎng)效果較差的微生物，采用擴(kuò)增的方式獲取DNA片段，彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)手段中的諸多不足。

3.2 用于生活飲用水中指示細(xì)菌的檢測(cè)

水質(zhì)是影響人們健康的又一重要影響因素，除了食物安全以外，水質(zhì)的檢測(cè)同樣十分重要。水質(zhì)的檢測(cè)是以檢測(cè)大腸桿菌和人類糞便中污染的大腸桿菌為檢測(cè)指標(biāo)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法煩瑣，需花費(fèi)幾天的時(shí)間。若根據(jù)大腸桿菌能夠利用β-半乳糖苷酶，采用明確的底物進(jìn)行檢測(cè)，則可以更加迅速地檢測(cè)到大腸桿菌。然而有一些大腸桿菌品系并不表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶，因此偶爾也會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)失敗[5]。而PCR技術(shù)為檢測(cè)β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸苷酶基因提供了一個(gè)更加靈敏和特異性更強(qiáng)的方法，并且在檢測(cè)的過程中還能夠通過擴(kuò)增的方式對(duì)多種大腸桿菌的類型進(jìn)行檢測(cè)，可以在更短的時(shí)間內(nèi)完成更高質(zhì)量的檢測(cè)。

3.3 用于乳酸菌的檢測(cè)與鑒定

以雙歧桿菌為例，P.KAUFMANN等人比較了雙歧桿菌現(xiàn)有的32個(gè)種及相關(guān)種的16S rRNA基因序列后，發(fā)現(xiàn)在其1 412～1 432位的寡核苷酸堿基序列（21個(gè)）在所有的雙歧桿菌中相同，能作為雙歧桿菌屬特異的寡核苷酸片斷，可用其作為PCR的引物來擴(kuò)增雙歧桿菌16S rRNA的基因片斷。而模板DNA通過簡(jiǎn)單的SDS裂解菌體細(xì)胞，而后用蛋白酶K去除蛋白即可獲得。在此條件下，所有的雙歧桿菌可由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生典型的1.35 kb的核苷酸片斷，而其他細(xì)菌則不產(chǎn)生此帶，故以此作為檢測(cè)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳酸菌種類及數(shù)量的檢測(cè)與鑒定。

4 PCR技術(shù)的發(fā)展方向

PCR技術(shù)在目前主要應(yīng)用于食品中微生物的檢測(cè)，在后期的發(fā)展中，PCR技術(shù)主要朝著3個(gè)方向發(fā)展，分別是不斷完善與提高DNA的模板純度、解決檢測(cè)中假陽性問題和與數(shù)字技術(shù)進(jìn)行緊密結(jié)合。PCR技術(shù)在未來的發(fā)展中，會(huì)主要以上述3個(gè)發(fā)展方向?yàn)橹鳎⑶以诤笃跁?huì)充分與數(shù)字技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)更高效的食品微生物檢測(cè)。

5 結(jié)語

食物微生物檢測(cè)直接影響到食品安全，目前使用的PCR檢測(cè)技術(shù)，在進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)中有著一定的優(yōu)勢(shì)。在后期的發(fā)展中，該技術(shù)也會(huì)在食品微生物檢測(cè)中逐漸普及與覆蓋，并且會(huì)與數(shù)字技術(shù)進(jìn)行緊密結(jié)合，促進(jìn)食品衛(wèi)生檢測(cè)的高質(zhì)量發(fā)展。