超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中的緩瀉劑

◎ 鄧 穎，林森煜，何敏恒，杜偉鋒，張瑞瑞，區(qū)碩俊

（1.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心（廣東），廣東 廣州 511447；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623）

吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁是一類臨床上使用較廣泛的緩瀉劑，可用于患者結(jié)腸鏡檢查的腸道準(zhǔn)備[1-2]。有研究表示，吡沙可啶與鎂鹽、維生素C和西甲硅油等聯(lián)合使用，可提高患者的耐受性，得到較好的腸道準(zhǔn)備質(zhì)量[3-6]。盡管低劑量的吡沙可啶對(duì)腸道準(zhǔn)備是安全有效的[7]，但也有研究表明，大劑量的吡沙可啶可誘發(fā)缺血性結(jié)腸炎[8]。目前，監(jiān)管體系和相關(guān)的法律法規(guī)仍未完善，因此，此類緩瀉劑可能會(huì)被不良商家違法添加至保健食品中，危害消費(fèi)者的健康安全。

目前，已經(jīng)報(bào)道的緩瀉劑測(cè)定方法主要集中于高效液相色譜法[9-11]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-16]，近年也有報(bào)道表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的測(cè)定方法[17]，高效液相色譜法在實(shí)驗(yàn)室中較為常用，但多目標(biāo)物的測(cè)定需要對(duì)每種物質(zhì)進(jìn)行基線分離，且容易受雜質(zhì)峰的干擾。而表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，雖然靈敏度要高于高效液相色譜法，但操作較為煩瑣，而且對(duì)于含量較低的樣品，難以檢出。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，且靈敏度高，對(duì)目標(biāo)物選擇性高。本文建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)保健食品中的3種緩瀉劑進(jìn)行測(cè)定。相比于一般的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能測(cè)定精確分子量，減少假陽(yáng)性的情況，更加高效準(zhǔn)確地對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，為相關(guān)的分析方法開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚?。兌却笥?7.5%，天津阿爾塔公司）；甲酸、乙腈、甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher公司）；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（CNW，分析純，上海安譜公司）；C18固相萃取柱、PSA固相萃取柱和HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，CNW，分析純，上海安譜公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Triple TOF5600+質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；島津LC-30AD液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超 純 水 系 統(tǒng)（法 國(guó)Merck Millipore公司）；4k-15離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；KQ-800DB超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；MS3渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；Heidolph Promax 2020搖床（德國(guó)Heidolph公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-4 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，再用乙腈稀釋至刻度，得到10 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：用乙腈液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，得到各級(jí)濃度為2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1曲線。

1.3.2 前處理方法

減肥茶、片劑樣品直接粉碎，膠囊樣品取出內(nèi)容物混合均勻，待測(cè)。

稱取1.0 g上述樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水，使樣品渦旋分散，再加入10 mL乙腈，渦旋混勻，加入3.0 g無(wú)水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，水平振搖15 min。然后置于離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心5 min。

轉(zhuǎn)移1 mL上清液于試管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 50%甲醇水溶液，渦旋2 min，待固相萃取凈化。將C18固相萃取小柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，將待凈化的樣品加入小柱，3 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，減壓抽干小柱，最后用5 mL甲醇洗脫，洗脫液40 ℃氮吹至近干，1 mL乙腈定容，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜上機(jī)。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進(jìn)樣量為5.0 μL；柱溫為40 ℃；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脫模式：等度洗脫，A∶B=70∶30。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI和APCI復(fù)合源，正離子掃描；一級(jí)TOF-MS掃描質(zhì)量范圍（m/z）：50～1 000 Da；二級(jí)IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍（m/z）：50～1 000 Da。每10個(gè)樣品自動(dòng)校正1次，正離子模式校正液流速為0.5 mL·min-1，氣簾氣（N2）：40 psi，離子源霧化氣（N2）：50 psi，離子源加熱輔助氣（N2）：50 psi，離子源溫度為550 ℃，離子源電壓5 500 V。去簇電壓DP為90 V，碰撞能量CE為（30±15）eV；監(jiān)測(cè)模式：TOF-IDA-MS。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析處理

使用AB SCIEX公司的Analyst TF 1.6軟件采集化合物的母離子和碎片信息，PeakView 2.0和MasterView 2.0軟件定性處理，MultiQuant 3.0軟件定量處理。通過(guò)TOF-MS和IDA-MS過(guò)濾得到響應(yīng)值超過(guò)500 cps的母離子及響應(yīng)值超過(guò)5 000 cps的分子離子所產(chǎn)生碎片的精確分子量。以母離子的精確分子質(zhì)量及其同位素豐度比、二級(jí)碎片的精確分子質(zhì)量及豐度比和色譜保留時(shí)間等信息作為定性依據(jù)，以母離子響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行定量。對(duì)保健食品中的3種緩瀉劑進(jìn)行定性定量分析。吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁的質(zhì)譜參數(shù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流圖見圖1。

表1 吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁的碎片參數(shù)表

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流圖

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

實(shí)驗(yàn)前期對(duì)提取劑進(jìn)行了初步的篩選，分別使用乙腈和甲醇對(duì)樣品進(jìn)行提取，比較了各自的回收率。結(jié)果顯示，乙腈和甲醇回收率相當(dāng)，均在85%～100%。但是使用乙腈提取，可通過(guò)鹽析分層去除水溶性雜質(zhì)，對(duì)儀器和色譜柱有一定的保護(hù)作用，同時(shí)也可以減少雜質(zhì)在質(zhì)譜中對(duì)目標(biāo)物離子化的影響，降低基質(zhì)效應(yīng)。乙腈和甲醇的回收率見圖2。

圖2 不同溶劑對(duì)回收率的影響圖

2.2 提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了搖床、超聲和渦旋振蕩3種提取方式，在同樣提取15 min的情況下，渦旋振蕩和搖床的提取方式效率最高，回收率均在85%以上。超聲回收率只有60%～70%。其原因可能是超聲過(guò)程中，樣品和溶液的接觸部分少，溶液整體濃度不均勻所導(dǎo)致的，同時(shí)加入無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉之后，由于體系中離子強(qiáng)度加大，導(dǎo)致乙腈和水之間的氫鍵斷裂，從而分層，進(jìn)一步導(dǎo)致樣品提取不均勻，最終回收率較低。同時(shí)，考慮到日常的批量處理，最終選擇搖床作為提取方式。

2.3 固相萃取柱的選擇

由于直接提取的方式會(huì)令提取液中含有較多的雜質(zhì)，影響分析結(jié)果。因此實(shí)驗(yàn)采用固相萃取的凈化方式對(duì)提取液進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)選擇了HLB、PSA和C18固相萃取柱進(jìn)行凈化，以3種目標(biāo)物的回收率為評(píng)判依據(jù)，選擇回收率最高的固相萃取柱。結(jié)果顯示，HLB、PSA和C18固相萃取柱對(duì)吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁的回收率差別不大，回收率最高的為C18固相萃取柱。在4 mL洗脫液的條件下，基本回收率在85%以上，穩(wěn)妥起見用5 mL洗脫。詳細(xì)結(jié)果見圖3。

圖3 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響圖

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為得到響應(yīng)較高且較穩(wěn)定的母離子，分別對(duì)3種緩瀉劑的ESI正負(fù)模式進(jìn)行掃描測(cè)定。結(jié)果顯示，3種緩瀉劑在ESI負(fù)模式的條件下，響應(yīng)遠(yuǎn)低于正模式。因此選擇正模式進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)不同離子加合后的母離子響應(yīng)做了對(duì)比。由于3種化合物均含有N原子，因此在+H的情況下，母離子響應(yīng)均較高。各離子化模式峰面積見表2。

表2 不同離子化模式下的母離子峰面積表

2.5 線性關(guān)系和檢出限

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，按照1.3.3和1.3.4的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定后分別以濃度（μg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（cps）為縱坐標(biāo)進(jìn)行一次方程擬合，得到3種目標(biāo)物的線性方程，相關(guān)系數(shù)均大于0.998 9，說(shuō)明線性關(guān)系良好。另外，進(jìn)行低濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以3倍和10倍信噪比確定方法檢出限和定量限。其中3種目標(biāo)物的檢出限為7.0～20 μg·kg-1，定量限為20～50 μg·kg-1，滿足一般樣品的含量測(cè)定要求，結(jié)果見表3。

表3 線性方程、檢出限和定量限表

2.6 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)化后的方法的回收率和相對(duì)標(biāo)對(duì)偏差是否符合檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)3種緩瀉劑呈陰性的減肥茶進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分別對(duì)3種緩瀉劑定量限的不同倍數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加，平均回收率在84.6%～95.3%。每個(gè)水平處理6個(gè)平行樣品，并在同一日內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)回收率結(jié)果，計(jì)算出6個(gè)平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果在3.63%～6.22%，說(shuō)明方法整體精密度較高，重復(fù)性好。具體結(jié)果見表4。

表4 不同水平的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

使用建立的方法檢測(cè)了30個(gè)市售樣品，其中包括15個(gè)減肥茶和15個(gè)壓片糖果，結(jié)果為：一個(gè)壓片糖果檢出雙醋酚丁，含量為0.21 mg·kg-1。

3 結(jié)論

本文使用了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)保健食品中的吡沙可啶、脫乙酰吡沙可啶和雙醋酚丁3種緩瀉劑進(jìn)行測(cè)定，以C18固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，效果較好；在優(yōu)化的色譜條件下，3種緩瀉劑在3 min內(nèi)完成出峰，峰型良好；結(jié)合高分辨質(zhì)譜，測(cè)定目標(biāo)物碎片的精確分子量，減少了假陽(yáng)性的可能；通過(guò)對(duì)不同離子加合得到的母離子進(jìn)行測(cè)定，選擇了響應(yīng)最優(yōu)的母離子；方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，方法回收率好，重現(xiàn)性高，線性方程和檢出限、定量限均可滿足測(cè)定的要求。