黃盼盼,顧 喬,曾小康
(浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,浙江 杭州 310003)
膿毒癥的有效治療仍然是重癥監(jiān)護室(intensive care unit,ICU)的主要挑戰(zhàn)之一,其死亡率約為30%[1]。流行病學研究表明,近年來膿毒癥的發(fā)病率不斷上升,死亡率卻在下降。根據(jù)2016年歐洲危重病學會指定的19位國際專家合作修訂的膿毒癥的定義和診斷標準,即“膿毒癥-3”[2]標準定義,膿毒癥是由宿主對感染反應失調(diào)引起的威脅生命的器官功能紊亂。膿毒癥的發(fā)生與多種因素有關,包括血流動力學改變、腎血流量減少、微血栓形成、內(nèi)毒素和炎癥因子的影響及細胞凋亡等[3]。
急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是與膿毒癥或膿毒癥休克相關的最常見的器官功能障礙之一,其死亡率高達60%[4-5]。AKI指的是腎臟功能突然下降(大部分是可逆的),導致許多廢物的滯留和細胞外容量的失調(diào)。根據(jù)血清肌酐水平的升高水平和尿量的減少情況,改善全球腎臟病預后組織(Kidney Disease: Improving Global Outcomes,KDIGO)的分類標準被廣泛用于診斷AKI。然而,這些參數(shù)的變化并不能反映腎臟損傷的程度,因此需要更多敏感和特異的實驗室生物標志物來早期診斷和預測AKI。肌動蛋白是一種球狀蛋白(Mr約為2 000),以單體/球狀和聚合/絲狀的形式存在,可能是一種針對膿毒癥相關AKI(sepsis-associated acute kidney injury,saAKI)有潛力的生物標志物[6]。在急性組織損傷中,釋放的細胞外肌動蛋白被發(fā)現(xiàn)在血液循環(huán)中具有高毒性,因為它具有自發(fā)的聚合傾向,對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生不利的影響[7]。凝膠素和Gc-球蛋白是所謂的肌動蛋白清道夫系統(tǒng)中最重要的蛋白,它們負責結合和解聚循環(huán)中的細胞外肌動蛋白,使這些蛋白復合物在尿液中出現(xiàn)的可能性減小[8]。然而,有研究表明,在持續(xù)AKI的腎移植患者的尿液中可以檢測到肌動蛋白[9]。本研究對saAKI患者尿液中的肌動蛋白進行定量檢測,以驗證其作為saAKI中血清肌酐補充診斷生物標志物的可行性。
選取2020年1月至2021年12月在我院急性確診的膿毒癥患者或saAKI患者入組。納入標準:①病理診斷符合“膿毒癥-3”[2]以及KDIGO的AKI臨床指南標準[10];②出現(xiàn)器官功能障礙跡象,表現(xiàn)為序貫性器官功能衰竭評分(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)增加(>2分)、血清降鈣素原(procalcitonin,PCT)水平升高(>2 μg/L)和微生物學感染;③血清肌酐水平升高(過去7 d從基線增加≥1.5倍或48 h內(nèi)增加≥26.5 μmol/L)或尿量減少[<0.5 mL/(kg·h),持續(xù)6 h]的患者被認定患有AKI。排除標準:①納入前3個月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素者,長期使用免疫抑制劑、免疫功能嚴重低下者;②既往有慢性腎病、腎移植史或終末期腎臟病患者;③合并間質(zhì)性腎炎、腎小球腎炎患者;④妊娠期、哺乳期及經(jīng)期患者;⑤合并血液系統(tǒng)傳染性疾病及惡性腫瘤患者。另選取同時期在我院門診中心體檢,并愿意加入實驗的健康人群作為對照組,其排除標準為患有急性炎癥[超敏C-反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)>5 mg/L]、傳染病或腎臟疾病者。最終納入膿毒癥患者共65例,其中saAKI組45(男13,女32)例,非AKI膿毒癥組20(男8,女12)例。對照組25(男11,女14)例。三組對象的平均年齡、收縮壓、舒張壓、心率和BMI差異無統(tǒng)計學意義(表1)。本研究經(jīng)浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審查和批準(ZJUL20190845LC),所有患者或其家屬均簽署書面知情同意書。
表1 三組入組人群基本情況統(tǒng)計結果
1.2.1 采樣和樣本處理 本研究按前瞻性、開放、單中心臨床研究方法設計?;颊呷虢M后,在3個時間點(T1,T2和T3)采集血液和尿液樣本。T1:入院后24 h內(nèi);T2:入院后第2日上午;T3:入院后第3日上午。每位膿毒癥患者使用促凝管采集靜脈血5 mL,使用無菌離心管采集尿液6 mL;尿液和凝固的血液樣本經(jīng)1 500g離心10 min后,取上清液檢測。
1.2.2 檢測指標和數(shù)據(jù)分析 血常規(guī)檢測包括血漿總蛋白、血漿白蛋白、肌酸激酶、血漿肌酐、血小板計數(shù);炎癥指標檢測包括白細胞計數(shù)、hs-CRP、PCT;尿常規(guī)檢測包括尿液總蛋白、尿液白蛋白、尿肌酐。以上檢測均在杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科完成。采用自動化免疫比濁法(使用德國Roche診斷醫(yī)療生產(chǎn)的Cobas 8000/c502模塊進行)測定尿液中指標黏蛋白和胱抑素C。尿液肌動蛋白則采用ELISA進行測定,檢測試劑盒(ab240678)購自英國Abcam上海分公司。收集患者的臨床病理信息,與血清和尿液肌動蛋白水平進行比較,并通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評估血清和尿液肌動蛋白作為saAKI診斷指標的有效性。
1.2.3 統(tǒng)計學分析 本研究采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。由于檢測數(shù)據(jù)未能通過正態(tài)分布檢驗,計量資料均采用M(Q1,Q3)表示,組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以n(%)表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
對三組入組人群主要并發(fā)癥發(fā)生率進行比較,結果表明,非AKI膿毒癥組和saAKI組患者并發(fā)心血管病、慢性腎病、肺部疾病和惡性腫瘤的比例顯著高于對照組患者(P<0.05),非AKI膿毒癥組和saAKI組之間則無顯著差異(表2)。臨床血液和尿液指標方面,非AKI膿毒癥組和saAKI組在血漿總蛋白、血漿白蛋白、血漿肌酐、血漿肌酸激酶、白細胞、血小板計數(shù)、C-反應蛋白、降鈣素原、尿液總蛋白、尿液白蛋白、尿液黏蛋白,尿液胱抑素、尿液肌動蛋白和尿液肌動蛋白/肌酐等指標與對照組相比均存在顯著差異(P<0.05)。非AKI膿毒癥組和saAKI組組間則在血漿肌酐、白細胞、血小板計數(shù)、尿液總蛋白、尿液白蛋白、尿液黏蛋白、尿液胱抑素、尿液肌動蛋白、尿液肌動蛋白/肌酐和尿液肌動蛋白/總蛋白等指標上差異顯著,saAKI組上述指標數(shù)值均顯著較高(P<0.05,表3~4)。
表2 三組入組人群主要合并癥比較 [n(%)]
表3 三組入組人群臨床血液指標比較 [M(Q1,Q3)]
表4 三組入組人群臨床尿液指標比較 [M(Q1,Q3)]
非AKI膿毒癥組和saAKI組患者在內(nèi)科并發(fā)癥發(fā)生人數(shù)、手術干預人數(shù)、ICU住院時間、APACHE Ⅱ評分、SAPS Ⅱ評分和SOFA評分方面均存在顯著差異(P<0.05,表5)。saAKI組患者多器官功能障礙綜合征發(fā)病率較高,但兩組差異不顯著。臨床病原體分型方面,兩組也無顯著差異(表6)。
表5 入院原因和臨床診斷評分對比
表6 器官衰竭程度和病原體比較 [n(%)]
在T1、T2和T3三個時間點所有膿毒癥患者中(n=65)的血清肌動蛋白水平與對照組(n=25)比較未發(fā)現(xiàn)顯著差異,但是尿液肌動蛋白水平在3個時間點均存在顯著差異(P<0.01,圖1A);將非AKI膿毒癥組(n=20)和saAKI組(n=45)的檢測數(shù)據(jù)進行比對,發(fā)現(xiàn)兩組間血清肌動蛋白水平無顯著差異,但是尿液肌動蛋白水平在3個時間點均存在顯著差異(P<0.01,圖1B);根據(jù)KDIGO指南分級說明對45例saAKI患者進行了分級,分為AKI-1組(10例),AKI-2組(15例)和AKI-3組(20例),并對其肌動蛋白檢測數(shù)據(jù)進行比對。統(tǒng)計結果表明,各組間尿液肌動蛋白水平存在顯著差異(P<0.01,圖2A);同時,各組間尿液肌動蛋白/肌酐比值也存在顯著差異(P<0.01,圖2B)。
A:3個時間點對照組患者(n=25)和膿毒癥患者(n=65)尿液肌動蛋白水平比較;B:非AKI膿毒癥組(n=20)和saAKI組(n=45)患者尿液肌動蛋白水平比較。 bP<0.01。圖1 膿毒癥患者尿液肌動蛋白水平
A:3個時間點不同AKI分級患者的尿液肌動蛋白水平比較;B:3個時間點不同AKI分級患者的尿液肌動蛋白/肌酐比值比較。AKI-1組n=10;AKI-2組n=15;AKI-3組n=20。 bP<0.01。圖2 不同AKI分級的saAKI患者的尿液肌動蛋白水平比較
通過使用ROC曲線分析評估了T1時間點各檢測指標對saAKI的診斷性能(圖3)。對于區(qū)分saAKI和非AKI的膿毒癥患者,曲線下面積(area under the curve,AUC)值如下:尿液肌動蛋白0.887(P<0.01);血漿肌酐0.865(P<0.01);檢驗截止值如下,尿液肌動蛋白2.67 μg/L(敏感度:85.0%,特異度:81.3%);血漿肌酐121 μmol/L(敏感度:87.5%,特異度:75.2%)。
圖3 區(qū)分AKI的ROC曲線
非AKI膿毒癥和saAKI的早期診斷和有效治療是保證患者成功康復的關鍵[11]。然而,目前使用的生物標志物(膿毒癥相關:PCT、hs-CRP;AKI相關:肌酐、尿量)在膿毒癥和AKI的診斷和預后方面顯示出顯著局限性[12]。本研究檢驗了患者血漿肌動蛋白和尿液肌動蛋白水平作為臨床生物標志物的潛力。
越來越多的證據(jù)表明在各種臨床狀況下(如創(chuàng)傷、急性肝衰竭、心肌梗死、膿毒癥),肌動蛋白清除蛋白酶濃度下降以及血漿肌動蛋白水平升高體現(xiàn)出的診斷價值[13]。由于尿液的采集是無創(chuàng)性的,利用尿液成分進行疾病生物標志物研究是目前的熱門。針對尿液肌動蛋白的研究報道不多,尤其是針對AKI的研究非常少,我們的研究可以認為非常有創(chuàng)新性。
通過ELISA方法,我們精確地對患者血漿和尿液中的肌動蛋白進行了定量檢測。試驗結果表明,在為期3 d的隨訪采樣時間內(nèi),與健康對照組相比,膿毒癥患者的血漿肌動蛋白水平略有升高,但缺乏統(tǒng)計學顯著性,但尿液肌動蛋白水平在3個時間點均存在顯著差異(P<0.01)。同時,在膿毒癥患者和saAKI患者之間,我們也發(fā)現(xiàn)了顯著的尿液肌動蛋白水平差異(P<0.01)。同時,尿液肌動蛋白與AKI患者的分級水平也存在顯著相關性,高分級的AKI患者顯著具有更高的尿液肌動蛋白水平和尿液肌動蛋白/肌酐比值(P<0.01)。ROC曲線分析也表明,尿液肌動蛋白作為saAKI的診斷指標,性能優(yōu)秀(AUC=0.887)。
我們的研究存在部分局限性,由于研究時間有限,我們連續(xù)招募患者的數(shù)量非常有限,整體樣本量較小。此外,3個時間點采樣的時間精確性受到了臨床條件的限制,無法完全統(tǒng)一到精確時間點,在實際的第1日樣本采集中,時間間隔稍有變化(大多在12 h內(nèi)),因為大多數(shù)患者是在晚上或下午晚些時候入院,然后在第2日早上采集第一個樣本。此外,在我們的研究中,為了控制尿流率的變化,新型尿液AKI生物標志物必須歸一到尿肌酐的濃度。然而,越來越多的證據(jù)對尿肌酐正?;贏KI中的重要性提出了質(zhì)疑,因為在AKI急性發(fā)作的情況下,尿肌酐和其他新型尿液AKI生物標志物的排泄率可能受到不同的影響[14-15]。由于肌動蛋白在血液循環(huán)中可與凝膠素或Gc-球蛋白結合,所以正常情況下不會出現(xiàn)在尿液中。然而,由于嚴重的腎小球或腎小管損傷,患者尿液中便可以檢測出肌動蛋白,所以尿液肌動蛋白水平的升高可以提示患者存在嚴重的腎臟損傷[16]。有研究表明,KIM-1或NGAL是AKI中已知的損傷生物標志物,我們的研究表明,尿液肌動蛋白可以也可能被歸入這一范疇。目前我們的試驗證明,與血清肌酐相比,尿液肌動蛋白可能提供有關腎臟損傷程度的更準確信息。此外,包括尿液肌動蛋白和各種損傷生物標志物的多標志物聯(lián)合檢測的方法或許能提供與saAKI有關更準確的診斷信息。
下一步,我們的研究會將采樣時間延長到5~7 d,同時增加入組患者的數(shù)量,特別是需要腎臟替代治療的患者。并將膿毒癥進行進一步的分類,以得出更準確的結論,并且開展其他不同種類的腎臟疾病(如慢性腎臟病、腎小球腎炎)的患者群體的尿液肌動蛋白相關性研究。我們的試驗目前已經(jīng)證明了ELISA的方法用于尿液肌動蛋白的檢測是準確、有效和及時的,在進一步的研究中,我們還將對其他的檢測方法,例如定量熒光法進行嘗試,力圖找到最適合該生物標志物的檢測手段。
綜上所述,在saAKI中,尿液肌動蛋白可作為酸性肌酐的補充診斷生物標志物,而較高的尿液肌動蛋白水平也可以準確地反映AKI的嚴重程度。尿液肌動蛋白水平作為針對膿毒血癥相關AKI的診斷指標,效果顯著,值得進一步深入研究。