三種組織透明化方法在神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用中的比較

黃義源，楊 亮，袁 潔，智 娜，劉育明，張 明，趙湘輝

(1延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院多肽資源藥物研究中心，陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西 延安 716099； 2西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710127； 3空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

近年來，各種神經(jīng)連接介觀圖譜成像技術(shù)不斷發(fā)展成熟，不但為探索神經(jīng)和精神疾病的發(fā)生機(jī)制提供了重要的理論和方法，更成為腦功能成像大數(shù)據(jù)共享和開放式腦科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。其中，基于組織透明化的高分辨顯微成像技術(shù)在探索神經(jīng)連接介觀圖譜特征與神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的關(guān)系中發(fā)揮重要作用[2-3]。組織透明化的方法不但可以在不破壞神經(jīng)纖維間聯(lián)系的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對一定厚度，甚至全腦的單細(xì)胞分辨率介觀尺度成像，還可以與包括免疫熒光化學(xué)在內(nèi)的多種細(xì)胞標(biāo)記方法相匹配，從三維立體的空間層面實(shí)現(xiàn)對腦區(qū)間神經(jīng)聯(lián)接的長程投射和局部微環(huán)路解析[4-5]?，F(xiàn)階段透明化的方法大致可分為三類：溶劑透明技術(shù)、水性超水合技術(shù)和水凝膠包埋技術(shù)[6-7]。不同的方法原理不同，在透明清除時間、熒光保存效果、組織是否形變、是否和免疫熒光技術(shù)兼容、適用組織厚度等方面?zhèn)戎夭煌琜8-10]。本研究以小鼠厚腦片(150 μm)為研究對象，通過對上述要素的比較，探討了基于水凝膠包埋的PACT(passive CLARITY technique)[11-12]、基于尿素透明化技術(shù)改進(jìn)的MACS(MXDA-based Aqueous Clearing System)[13]和基于溶劑透明技術(shù)的Visikol HISTO[14]試劑盒三種方法的優(yōu)勢與缺點(diǎn)，將為相關(guān)領(lǐng)域研究人員選擇操作簡便、兼顧免疫熒光標(biāo)記方法、能處理一定厚度的組織且基本不發(fā)生形變、處理時程較短，而且重復(fù)性好的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物：本研究中所使用的動物在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度24 ℃左右，相對濕度維持在50%左右，照明為12 h光/12 h暗循環(huán)。轉(zhuǎn)基因小鼠品系為CNP-mEGFP[15]，GAD67-GFP[16](RRID:IMSR_JAX:007677),Tir2CreER[17](RRID:IMSR_JAX:030597)和TdTomato[18](RRID:IMSR_JAX:007905)。將Tir2CreER小鼠與TdTomato小鼠交配獲得Tir2CreER-TdTomato轉(zhuǎn)基因鼠，誘導(dǎo)該小鼠表達(dá)Tir2Cre時，按照100 μg/g體質(zhì)量進(jìn)行小鼠腹腔注射Tamaxion(Sigma，#WXBD2299V)，動物灌注取材年齡為出生后第42日(P42)，P37～P39連續(xù)3 d注射Tamaxion。本研究用到的動物年齡在相應(yīng)結(jié)果部分分別介紹，每種實(shí)驗(yàn)用到動物數(shù)量為3只，雌雄不限。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)執(zhí)行(許可證號：20211020)。

主要試劑及儀器：光引發(fā)劑VA-044(WAKO，#V10588)，DABCO(Merck，#8.03456.0100)，Nycodenz(Alere Technologis AS，#10187824)，間苯二甲胺(m-xylylenediamine，MXDA，Tokyo chemical industry，#D0127)，山梨醇(Sigma，#85529)，Visikol HISTO(Abcam，#ab243298)，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS，MP，#MR29129)，PBS(Solarbio，#P1010)，翹板搖床(DlAB，#SK-R330-Pro)，水浴鍋(JULABA，#SW22)。FV3000激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯)。

免疫熒光染色使用的抗體見表1。

1.2 方法

1.2.1 灌注固定及組織樣品準(zhǔn)備 將所有實(shí)驗(yàn)小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉(0.008 mg/kg)深度麻醉，先后經(jīng)冰冷的1×PBS(配方見1.2.2)和冰冷的40 g/L多聚甲醛(KH2PO415.6 g/L，NaOH 4 g/L配置)固定液心臟灌注，斷頭后去除頭部皮膚與顱骨，小心取出鼠腦，并置于4 ℃冰箱固定過夜。次日將樣品放置在含0.001 g/L疊氮鈉的PBS中備用。將固定好的樣品進(jìn)行適當(dāng)修整，用502膠水固定在震動切片機(jī)上，進(jìn)行冠狀面腦片的制備。切片時刀片速度和振幅根據(jù)腦組織的固定程度進(jìn)行調(diào)整，保證腦片可以完整而順利地切下。

1.2.2 組織透明試劑的配制 PACT透明化方案參考文獻(xiàn)[11-12]配置相關(guān)試劑：A4PO水凝膠單體溶液[20 mL丙烯酰胺溶液(400 g/L)，10 mL 20×PBS母液(Na2HPO4529.2 g/L，NaH2PO42.66 g/L，NaCl 40 g/L，KCl 1.8 g/L)，170 mL dH2O定容至200 mL，pH 7.5，在使用前先加入終濃度0.025 g/L的光引發(fā)劑]；80 g/L SDS溶液(SDS粉末8 g溶于100 mL 1×PBS，pH 7.5)；折射率匹配溶液(refractive index matching solution，RIMS)[40 g Nycodenz，30 mL PB (KH2PO42.72 g/L，0.64 g/L)，5 mg疊氮鈉，50 μL Tween 20，1 g DABCO，溶解后即為50 mL溶液]。

MACS透明化方案參考文獻(xiàn)[13]配置相關(guān)試劑：MACS-R0(200 mL/L MXDA，150 g/L山梨醇，去離子水溶解)；MACS-R1(400 mL/L MXDA，300 g/L山梨醇，1×PBS溶解)；MACS-R2(400 mL/L MXDA，500 g/L山梨醇，去離子水溶解)。

Visikol HISTO透明化方案所需配制的試劑根據(jù)制造商提供的說明書進(jìn)行操作。Visikol HISTO提供的洗滌緩沖液為10倍濃度，使用前將其用去離子水稀釋至1倍，調(diào)至pH 7.4。對于含有內(nèi)源熒光蛋白的樣品，利用1×PBS(pH 7.4)制備300、500 mL/L的乙醇溶液，利用去離子水制備700、900 mL/L的乙醇溶液；對于不含內(nèi)源熒光蛋白的樣品，在1×PBS中稀釋制備500 mL/L甲醇溶液，利用去離子水制備700、900 mL/L甲醇溶液。

1.2.3 組織透明化步驟 在利用PACT方法處理厚腦片時，先將固定清洗好的樣本轉(zhuǎn)移至含有A4PO溶液的5 mL離心管中，液體量為組織體積的兩倍并保證沒過樣品，4 ℃靜置過夜。第2日，將離心管取出并在37 ℃水浴中孵育4～5 h，聚合組織-水凝膠基質(zhì)。以PBS多次充分清洗組織，完全除去多余的水凝膠單體。將清洗好的樣品放入SDS中(根據(jù)樣品厚度和大小，在20～80 g/L范圍內(nèi)選擇適應(yīng)濃度的SDS)，37 ℃輕微搖晃，直到組織肉眼可見透明時棄去SDS溶液，用1×PBS充分清洗樣品，完全除去多余的SDS。通常厚度為200 μm的腦片需要2～4 h達(dá)到完全透明。將組織保存在含0.001 g/L疊氮鈉的1×PBS中，以待進(jìn)行后續(xù)染色或成像。

MACS組織透明化方案的步驟如下：將固定清洗好的樣品依次在MACS-R0、MACS-R1、MACS-R2溶液于室溫中輕微搖晃孵育，達(dá)到完全透明的處理時間根據(jù)組織的厚度確定。通常厚度為200 μm的腦片需要0.5～1 h達(dá)到完全透明。值得注意的是，為了更好地保存內(nèi)源熒光信號，透明化處理期間的溫度應(yīng)保持在30 ℃以下。

Visikol組織透明化方案的步驟參照說明書進(jìn)行：對于含有內(nèi)源性熒光的樣本，將固定清洗好的腦片，依次在300 mL/L乙醇/PBS、500 mL/L乙醇/PBS、700 mL/L乙醇/去離子水、900 mL/L乙醇/去離子水、無水乙醇中室溫輕晃孵育15 min，脫水之后可進(jìn)行成像前準(zhǔn)備。對于需要進(jìn)行免疫組化標(biāo)記的樣本，先將樣品在Visikol HISTO通透緩沖液中過夜室溫孵育，以增強(qiáng)組織透過性，之后將樣本依次在1×PBS、500 mL/L甲醇/PBS、800 mL/L甲醇/去離子水，以及無水甲醇中室溫輕晃孵育15 min。脫水處理后再依次經(jīng)過200 mL/L DMSO/甲醇、800 mL/L甲醇/去離子水、500 mL/L甲醇/PBS、PBS，以及PBST(含有2 mL/L Triton X-100的1×PBS)中孵育，以便進(jìn)行后續(xù)染色。

1.2.4 透明化樣本的免疫熒光染色標(biāo)記和小分子熒光標(biāo)簽標(biāo)記 PACT透明化方案處理過的組織，先用封閉液(50 mL/L驢血清，5 mL/L Triton X-100，0.001 g/L疊氮鈉，1×PBS配置)室溫輕搖孵育2 h；再以一抗(封閉液配置)室溫輕搖孵育24～48 h(時間根據(jù)樣品的動物年齡和染色效果調(diào)整)；用1×PBS多次充分清洗組織，再以二抗(1×PBS配置)室溫輕搖孵育24～48 h；以1×PBS多次充分清洗，最后以核染料DAPI(1∶1 000)室溫輕搖孵育2 h；最后用PBS充分清洗并保存于4 ℃，等待進(jìn)行成像前的準(zhǔn)備。

上述MACS透明化方案處理后的腦片樣品，先用500 mL/L MXDA/PBS溶液室溫孵育10～15 min，并以1×PBS多次充分清洗。再用上述封閉液在37 ℃孵育2 h，然后以一抗(封閉液配置)室溫孵育48 h；用PBST多次充分清洗；再以二抗(封閉液配置)室溫孵育24 h。最后用PBST多次充分清洗保存于4 ℃的PBS中，等待進(jìn)行成像前的準(zhǔn)備。

將上述Visikol透明化方案處理后的樣品，按照說明書步驟置入Visikol HISTO滲透緩沖液室溫輕晃孵育30 min，然后置入Visikol HISTO封閉液于37 ℃封閉2 h，隨后一抗(Visikol HISTO抗體稀釋液稀釋)37 ℃孵育48 h；用Visikol HISTO洗滌緩沖液清洗5次，并以二抗(Visikol HISTO抗體稀釋液稀釋)37 ℃孵育24 h。再次充分清洗后，以DAPI室溫孵育30 min襯染核，并最后清洗樣品10次。在染色完成后將樣品依次置入500 mL/L的甲醇/PBS，800 mL/L的甲醇/去離子水，以及無水甲醇中處理10～15 min使樣品脫水，之后進(jìn)行成像前的準(zhǔn)備。

標(biāo)記血管時，用PBS稀釋的Isolectin B4染料，直接代替上述染色步驟的抗體孵育過程即可，室溫處理24 h。

1.2.5 成像前折射率(refractive index，RI)匹配與顯微成像 將上述PACT透明化方案處理并做了熒光標(biāo)記的組織，浸入RIMS溶液(RI=1.44～1.46)中，直到組織重新透明并達(dá)到RI匹配即可成像觀察(200 μm腦片，通常0.5 h即可透明)；將上述MACS方案處理并做了熒光標(biāo)記的組織，浸入MACS-R2溶液中(RI=1.52)以達(dá)到RI匹配。將上述進(jìn)行Visikol透明化方案處理并做了熒光標(biāo)記的組織，浸入Visikol HISTO-1(RI=1.5)或Visikol HISTO-2溶液(RI=1.53，用于厚度>200 μm的樣品，如全腦、胚胎、厚腦片等，可強(qiáng)化透明效果)進(jìn)行成像。

本研究中成像系統(tǒng)使用的是配備了30倍硅油物鏡(UPLSA030XS，NA 1.05，WD 0.8 mm)的奧林巴斯FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡，硅油介質(zhì)的RI接近透明化組織(RI=1.406)，從而實(shí)現(xiàn)大體積的生物體高分辨率三維成像。成像時選用1 024×1 024分辨率，掃描速度為2～4 μs/pixel，Z軸掃描步進(jìn)根據(jù)成像信號選取系統(tǒng)的最佳值。成像時，汞燈強(qiáng)度可適當(dāng)下調(diào)至50%，激光功率應(yīng)不超過4%以減少光毒性，防止熒光淬滅。

2 結(jié)果

2.1 透明化處理時間及效果比較

根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)比較，利用厚腦片(150 μm)進(jìn)行三種方案透明化處理過程中，PACT方法所需時間最長，2 d左右，Visikol次之，需約2 h，MACS所需時間最短，需約1 h(圖1A)；但三種方法透明化效果基本一致(圖1B)。在組織形變方面， Visikol處理后的組織由于完全脫水，在完成透明化后相較于原組織會產(chǎn)生一定的收縮；MACS方法在透明化過程中會使得組織膨脹，并且不會在RI匹配后恢復(fù)；PACT在組織處理過程中，即SDS洗脫組織內(nèi)的脂質(zhì)時，也會引起組織膨脹，但在浸入RIMS后，組織會再次收縮，大小可恢復(fù)到透明前的形態(tài)(圖1B)。在處理后組織的完整性方面，PACT透明化后的厚腦片會變得柔軟易碎；而MACS處理后的組織雖然柔軟但具有韌性，且有一定的抗拉扯性；Visikol處理過的厚鼠腦切片變得堅硬，且不易破損。

A：三種不同透明化方法流程簡圖；B：三種不同透明化方法對150 μm厚腦片的透明化效果圖。標(biāo)尺為5 mm。圖1 三種不同透明化方法流程簡圖和透明化效果圖

2.2 組織內(nèi)源性熒光樣本的透明化成像結(jié)果

在對動物年齡為P42的三種帶有內(nèi)源性熒光的轉(zhuǎn)基因小鼠腦片樣品的透明化處理中，發(fā)現(xiàn)CNP-mEGFP標(biāo)記的髓鞘結(jié)構(gòu)、GAD67-GFP標(biāo)記的中間神經(jīng)元、Tir2CreER-TdTomato標(biāo)記的血管結(jié)構(gòu)，在經(jīng)PACT和MACS的方法處理后均保存較好，并未引起明顯的熒光淬滅(圖2)。對于GAD67-GFP樣品，PACT方法的熒光信號清晰，且背景干凈。相反的，盡管說明書提到Visikol試劑可以用于內(nèi)源性熒光樣本的處理，但我們在三種內(nèi)源性熒光樣本中均未看到較好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，透明化后均失去原熒光信號的形態(tài)，甚至出現(xiàn)類似血管樣的非特異熒光著色。根據(jù)說明書提示，我們縮短了脫水過程的時間，并且在4 ℃低溫條件下孵育Visikol HISTO-1溶液進(jìn)行RI匹配，但仍然沒有改變熒光信號消失淬滅的情況(結(jié)果未顯示)。

2.3 免疫熒光染色樣本的透明化成像結(jié)果

2.3.1 核型抗原的免疫熒光染色 選用了少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系標(biāo)記物Olig2作為核型抗原的代表，在對P35的小鼠厚腦片進(jìn)行三種透明化處理方法結(jié)合免疫熒光染色后，均較好地完成抗原的標(biāo)記(圖3)；而Visikol方法的信噪比更高。同時，與其他兩種透明化方法相比，Visikol方法染色中雖然抗體能夠較好地穿透整個組織，但會出現(xiàn)著色不均勻的情況：一側(cè)的熒光信號和背景略高于另一側(cè)。

MACS、PACT、Visikol三種方法下Olig2免疫熒光染色XY平面(左)及Z軸(右)成像結(jié)果。標(biāo)尺為150 μm。圖3 核型抗原Olig2的免疫熒光染色結(jié)果

2.3.2 胞質(zhì)抗原的免疫熒光染色 對于以成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CC1為例的胞質(zhì)抗原的免疫熒光染色，在對P35的小鼠厚腦片進(jìn)行三種透明化處理方法結(jié)合免疫熒光染色后，三種透明化方法均可在一定厚度下較好地實(shí)現(xiàn)抗原標(biāo)記(圖4)，但MACS方法標(biāo)記的細(xì)胞染色信號更加均勻。雖然Visikol方法處理后的免疫熒光染色信噪比較好，但仍會出現(xiàn)上述著色不均勻的情況。

MACS、PACT、Visikol三種方法下CC1的染色XY平面(左)及Z軸(右)成像結(jié)果。標(biāo)尺為150 μm。圖4 胞質(zhì)抗原CC1的免疫熒光染色結(jié)果

2.3.3 胞膜抗原的免疫熒光染色 以高表達(dá)于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞膜的受體分子PDGFRα為例，在對P7的小鼠厚腦片進(jìn)行三種透明化處理方法結(jié)合免疫熒光染色，PACT和MACS方法均可標(biāo)記抗原分子，但是信號主要以胞體為主，細(xì)胞突起的精細(xì)結(jié)構(gòu)并不能很好地被標(biāo)記上(圖5)；PACT方法標(biāo)記的PDGFRα信號明顯弱于MACS方法，但兩種方法處理后抗體穿透效果較好。經(jīng)Visikol方法處理后，可以看到較完整的包括突起分支的PDGFRα陽性細(xì)胞形態(tài)，但抗體穿透效果并不理想：150 μm的小鼠腦切片，只有50 μm左右的厚度可以進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。

MACS、PACT、Visikol三種方法下PDGFRα的染色XY平面(左)及Z軸(右)成像結(jié)果。標(biāo)尺為150 μm。圖5 胞膜抗原PDGFRα的免疫熒光染色結(jié)果

2.3.4 MACS方法對免疫熒光染色中不同熒光素的選擇性 在MACS透明化方法結(jié)合免疫熒光染色的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在以O(shè)lig2、CC1為抗原，對P35的小鼠厚腦片進(jìn)行染色，以及在以Iba1為抗原，對P7的小鼠厚腦片染色，若使用Alexa FluorTM488標(biāo)記的二抗處理后，經(jīng)激光器激發(fā)將導(dǎo)致熒光信號顯著淬滅，無法對其進(jìn)行成像(圖6)。而相同抗原經(jīng)Alexa FluorTM594標(biāo)記的二抗處理后，經(jīng)594 nm激發(fā)波長可以較好地保持熒光信號，并未出現(xiàn)淬滅現(xiàn)象。這種對免疫熒光染色二抗的熒光素選擇性的現(xiàn)象在另外兩種透明化方法中并未見到(結(jié)果未顯示)。

A：以Alexa FluorTM 488二抗標(biāo)記Olig2(綠色)，以Alexa FluorTM 594二抗標(biāo)記CC1(紅色)的成像結(jié)果；B：以Alexa FluorTM 488二抗標(biāo)記CC1(綠色)，以Alexa FluorTM 594二抗標(biāo)記Olig2(紅色)的成像結(jié)果；C：以Alexa FluorTM 488二抗標(biāo)記Iba-1的成像結(jié)果；D：以Alexa FluorTM 594二抗標(biāo)記Iba-1的成像結(jié)果。標(biāo)尺為80 μm。圖6 MACS方法處理后免疫熒光染色中不同熒光素的染色結(jié)果

2.4 熒光小分子化合物標(biāo)記的透明化成像

在以凝集素Lectin對血管標(biāo)記的小分子探針染色中，雖然三種透明化方法處理后均可實(shí)現(xiàn)對血管的標(biāo)記(圖7)，但是可以看出MACS處理后，標(biāo)記血管的形態(tài)不能完整地展示，出現(xiàn)許多斷裂的信號。而PACT方法處理后標(biāo)記的血管不完全，且標(biāo)記亮度不均一。Visikol方法對Lectin的染色標(biāo)記效果最好，血管形態(tài)完整，未發(fā)生明顯形變，且信噪比較高。

MACS、PACT、Visikol三種方法下Lectin的染色XY平面(左)及Z軸(右)成像結(jié)果。標(biāo)尺為150 μm。圖7 熒光小分子化合物標(biāo)記的透明化成像結(jié)果

3 討論

近年來組織透明化方法介導(dǎo)的三維立體成像技術(shù)已經(jīng)在神經(jīng)科學(xué)研究中受到更多的關(guān)注，特別是針對全腦和小鼠胚胎等較大體積的組織塊，組織透明方法為獲取其中特定細(xì)胞類型和靶蛋白的空間定位信息提供了重要的手段[19-20]。相較于連續(xù)切片后重新整合構(gòu)建的三維成像技術(shù)而言，透明化方法無需特殊設(shè)備，即可簡便開展。此外，除了在較大空間尺度上探討細(xì)胞和靶蛋白的位置信息，比如開展神經(jīng)環(huán)路研究以外，對一定厚度的腦切片進(jìn)行透明化處理并獲得特定空間范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞間相互作用、特定靶蛋白分布等信息，也是透明化技術(shù)的重要應(yīng)用方向[20-21]。而面對不同熒光標(biāo)記方法如何選擇最適透明化方案，是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)應(yīng)用研究面臨的首要問題[22]。

隨著各種組織透明化技術(shù)的發(fā)展，對較厚的組織，甚至全腦進(jìn)行透明化的效果已經(jīng)得到完善，多種方法可以在短時間內(nèi)使組織達(dá)到透明效果，并與內(nèi)源性熒光標(biāo)記方法相適配[23-25]。比如，帶有熒光報告基因的轉(zhuǎn)基因動物，或者腦區(qū)定點(diǎn)注射編碼熒光蛋白的嗜神經(jīng)病毒。這兩種方法在熒光亮度和均一性方面特別適合厚組織或者全腦成像，但在標(biāo)記細(xì)胞類型的廣泛性方面受到一定限制。采用免疫熒光技術(shù)對特定神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物染色的方法基本不受現(xiàn)有熒光轉(zhuǎn)基因動物和熒光病毒的限制，在一定厚度的組織中可以對特定細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)較好的標(biāo)記。但是由于抗體穿透范圍的影響，對更厚或者全腦透明化組織實(shí)現(xiàn)標(biāo)記仍具有一定的技術(shù)困難。因此在觀察神經(jīng)系統(tǒng)腦區(qū)間投射聯(lián)系和解析局部神經(jīng)結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別研究中可以聯(lián)合應(yīng)用上述三種細(xì)胞標(biāo)記策略，實(shí)現(xiàn)對特定靶標(biāo)的三維成像。

透明化技術(shù)的關(guān)鍵是使光透過一定厚度組織樣品時與介質(zhì)的RI相匹配，從而減少光在組織中各個方向的非均勻散射，且通過去除組織中有色物質(zhì)，達(dá)到組織透明的效果。本實(shí)驗(yàn)選用了三種常用的透明化方法，其中PACT透明化技術(shù)是一種水凝膠組織透明化方法，借助丙烯酰胺與組織相互耦聯(lián)形成水凝膠聚合物，之后用SDS對組織進(jìn)行脫脂，使組織達(dá)到初步透明，最后將組織浸入RIMS中達(dá)到RI匹配利于成像[11-12]；MACS組織透明化技術(shù)是在以尿素為基礎(chǔ)的透明化方案基礎(chǔ)上，用MXDA改進(jìn)的一種快速水處理方法，實(shí)現(xiàn)短時間內(nèi)完整組織器官的高度透明化，并表現(xiàn)出對熒光染色的高度相容性[13]。Visikol透明化技術(shù)是VILLANI等[14]在水合氯醛溶液的基礎(chǔ)上，基于一種獨(dú)特的多氯代醇混合物，經(jīng)過光學(xué)和超分子特性的優(yōu)化，使溶液可以滲透進(jìn)組織深處，達(dá)到透明化效果。Visikol溶液中含有甘油，可增加溶液的黏度和溶解度，使其適配于更多的組織樣品。

我們選用了150 μm的厚腦片作為研究對象，這相比普通免疫熒光的常規(guī)厚度(冰凍切片通常12～14 μm，漂片通常30 μm)擴(kuò)大了5～10倍的空間范圍，不但可以觀察到完整的細(xì)胞形態(tài)，還可以更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞數(shù)量等統(tǒng)計相關(guān)信息。從透明化效果來看，上述三種方法沒有明顯差別，但是PACT透明化方法所需時間最長，而MACS方法對樣本完整性的保存更好。在內(nèi)源性熒光樣本的處理方面，PACT和MACS方法對熒光的保存明顯優(yōu)于Visikol方法，這可能與Visikol方法預(yù)處理時，需在不同梯度的甲醇/乙醇中處理樣本，導(dǎo)致其內(nèi)源熒光發(fā)生淬滅有關(guān)。但是在利用抗體或者小分子化合物標(biāo)記特定靶蛋白的熒光標(biāo)記過程中，我們觀察到PACT方法與胞核和胞質(zhì)抗原標(biāo)記均能較好兼容，而胞膜抗原信號較弱，這可能與透明處理中使用到SDS對脂膜上的抗原造成一定程度的損害有關(guān)。MACS方法對于三種類型的抗原均能均勻著色且能很好地展示；但值得注意的一點(diǎn)是，該方法與免疫熒光染色中488 nm激發(fā)波長的熒光二抗不能兼容，綠色熒光不易保持，極易淬滅,而內(nèi)源性488 nm激發(fā)波長的熒光并不受到影響。盡管目前我們對導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因還不清楚，但在今后的應(yīng)用中需要特別注意避免。與上述兩種方法相比，Visikol方法在染色均勻性方面存在明顯不足，特別是在胞質(zhì)和胞膜抗原著色方面。這可能與組織處理后影響抗體穿透力有關(guān)，也可能與增大了組織黏度，不利于抗體分子擴(kuò)散有關(guān)。針對這種情況，在今后的實(shí)驗(yàn)中我們考慮延長抗體孵育時間，增加抗體孵育時的濃度，以期改善染色效果。

在利用偶聯(lián)有熒光素的凝集素Lectin標(biāo)記血管這類連續(xù)結(jié)構(gòu)時，Visikol方法表現(xiàn)最好，無論血管的連續(xù)性，還是標(biāo)記信號的均勻程度均優(yōu)于其他兩種方法，可見該方法對小分子化合物的標(biāo)記效果好于抗體等大分子的標(biāo)記。PACT方法處理后，部分血管標(biāo)記不充分；而MACS方法出現(xiàn)標(biāo)記的血管有斷裂的情況。這可能與MACS方法在透明化處理過程中組織發(fā)生膨脹，導(dǎo)致微觀形態(tài)被破環(huán)有關(guān)。

總之，通過本研究我們針對厚腦片的相關(guān)三維成像研究提出了不同熒光來源最適合的透明化方案及注意事項(xiàng)。這些經(jīng)驗(yàn)可以指導(dǎo)神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷修復(fù)、神經(jīng)退行性疾病等神經(jīng)科學(xué)多方面的應(yīng)用與研究，為相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員提供實(shí)用性幫助。在今后更多類型的抗原標(biāo)記和樣本處理過程中，我們將探討新的透明化方法以改進(jìn)目前存在缺陷的部分染色標(biāo)記結(jié)果，并優(yōu)化已有透明化方法的應(yīng)用方案。