HPLC法測定食醋中的脫氫乙酸

◎ 李宇棟，李守俊，王浩豪，馬 婷，李亞楠

（晉城市綜合檢驗檢測中心 山西 晉城 048000）

脫氫乙酸鈉是一種食品添加劑，具有抗菌譜廣、相對穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)點，在我國被允許在一定范圍內(nèi)使用于黃油、腌漬蔬菜等12 類食品中[1]。楊德中等[2]對2020—2021年市售的18 個類別1 867 份食品中防腐劑使用情況調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，脫氫乙酸檢出率為9.69%。近幾年國家食品安全監(jiān)督抽檢任務中將食醋中的脫氫乙酸及其鈉鹽（以脫氫乙酸計）作為抽檢對象，而且國家市場監(jiān)管總局于2021年7月要求加強食醋質(zhì)量安全的監(jiān)督管理[3]，因此找出一種能夠準確測定食醋中脫氫乙酸鈉含量的方法十分必要。

目前，脫氫乙酸多依據(jù)《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）進行檢驗，該標準中有氣相色譜法和液相色譜法兩種方法[4]，其中液相色譜法前處理簡便，儀器配置普遍，許多實驗室選擇液相色譜法進行樣品中脫氫乙酸的含量測定。然而此國家標準中的試樣制備與提取部分未對食醋的前處理作出明確規(guī)定，若按照復合調(diào)味料類別進行操作，當稱樣量接近5 g 時，由于液體樣品體積較大，再加入其他溶液，在調(diào)節(jié)pH 值時會出現(xiàn)體積超過定容體積的情況，導致實驗失敗。同時，本實驗室在按照此國家標準中的液相色譜參考條件上機時，脫氫乙酸經(jīng)常出現(xiàn)嚴重的拖尾現(xiàn)象，影響定量。王峰[5]采用CAPCELL PAK MG-C18柱超高效液相色譜法對食品中的脫氫乙酸進行測定，取得了良好的結果。于喆源等[6]通過對流動相pH 值、有機相比例、色譜柱填料等儀器條件進行研究發(fā)現(xiàn)脫氫乙酸在中性或堿性環(huán)境下，烯醇互變后的-O-結構次級保留是造成峰形不對稱和保留時間漂移的主要原因。因此通過使用封尾工藝色譜柱，采用酸性流動相并調(diào)節(jié)有機相比例能夠獲得理想的保留時間和峰形。目前，未有人對食醋中的脫氫乙酸含量的測定作出具體研究，因此本文通過優(yōu)化試驗條件，提出改進方法，旨在找出適合食醋中脫氫乙酸含量測定的檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀：ThermoFisher U3000，配紫外檢測器；色譜柱：ThermoFisher Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；十萬分之一天平：梅特勒XPE205；pH 計：梅特勒FE20；脫氫乙酸標準品：上海安譜璀世標準技術服務有限公司生產(chǎn)，批號：220425，含量99.9%。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備液（1.029 0 mg·mL-1）

精密稱取51.50 mg 脫氫乙酸標準品至50 mL 量瓶中，用5 mL 氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解并用水定容至50 mL，稀釋至刻度搖勻，濃度為1.029 0 mg·mL-1。4 ℃避光保存，有效期為3 個月。

1.2.2 較高濃度標準曲線工作液

分別精確吸取脫氫乙酸標準貯備液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，配制成濃度為1.03 μg·mL-1、10.29 μg·mL-1、51.45 μg·mL-1、102.90 μg·mL-1和205.79 μg·mL-1標準工作液。4 ℃保存，有效期為1 個月。

1.2.3 較低濃度標準曲線工作液（該標準曲線目的為準確測定低加標水平回收率）

準確吸取標準儲備溶液1 mL，用水定容至10 mL，得濃度為102.9 μg·mL-1的標準中間溶液。再分別精確吸取脫氫乙酸標準中間溶液0.05 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL 和1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，配制成濃度為0.51 μg·mL-1、1.03 μg·mL-1、3.09 μg·mL-1、5.14 μg·mL-1、8.23 μg·mL-1和10.29 μg·mL-1標準工作液。

1.3 色譜條件

1.3.1 通用條件

檢測波長：293 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

1.3.2 對比考察條件

第1～2 組：流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨+甲醇=90+10，色譜柱分別為C18未封尾色譜柱和C18封尾色譜柱。

第3～5 組：C18封尾色譜柱，流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨（分別用乙酸調(diào)節(jié)pH 值為7.0、6.0、5.0）+甲醇=90+10。

第6～8 組：C18封尾色譜柱，流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH=5）+甲醇分別為90+10、85+15、75+25。

1.4 樣品處理

1.4.1 第1 組

樣品置于50 mL 離心管中，加入約10 mL 水，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH 值至7.5，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。取20 mL 上清液用10%的甲酸溶液調(diào)pH 值至5，定容到25 mL，供高效液相色譜測定。

1.4.2 第2 組

樣品依據(jù)第1 組方法定容到25 mL 后。取5 mL過已活化的C18固相萃取柱，用5 mL 水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液2 mL，渦旋混合，過0.45 μm 有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.5 精密度和準確度

選用基質(zhì)空白食醋樣品5 g，分別加入0.25 mL、0.50 mL 濃度為102.9 μg·mL-1的標準使用液、0.25 mL濃度為1.029 mg·mL-1的標準儲備液，形成含量為0.005 g·kg-1、0.010 g·kg-1、0.050 g·kg-13 個加標水平，按照優(yōu)化后的前處理方法及上機條件進行測定，平行處理6 組，考察方法的準確度、精密度。

2 結果與分析

2.1 色譜柱對脫氫乙酸峰形的影響

《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）規(guī)定，在檢驗食品中的脫氫乙酸時使用C18反相色譜柱，但在試驗過程中往往會出現(xiàn)拖尾峰。為考察色譜柱對脫氫乙酸峰形的影響，使用第1～2 組色譜條件，上機測定濃度為10.29 μg·mL-1的脫氫乙酸標準溶液，結果如圖1所示。由圖1可知，采用C18未封尾色譜柱，峰不對稱度2.08；采用C18封尾色譜柱，不對稱度0.56，未封尾的色譜柱由于其表面未鍵合的硅羥基與脫氫乙酸的C-O-結構發(fā)生次級保留而出現(xiàn)峰形拖尾，而且拖尾因子還會隨著上機濃度的增加而增大。因此，在實驗室對脫氫乙酸進行檢驗時，宜采用封尾工藝色譜柱以得到穩(wěn)定的色譜響應。

圖1 色譜柱對脫氫乙酸峰形的影響圖

2.2 流動相對脫氫乙酸峰形及保留時間的影響

圖2為采用封尾工藝C18色譜柱，脫氫乙酸上機濃度為50 μg·mL-1時，不同pH 值流動相（第3～5 組色譜條件）對峰形和保留時間的影響。由圖2可知，隨著流動相pH 值變低，峰形的對稱性得到顯著改善，但同時脫氫乙酸的保留時間也逐漸增長。

圖2 流動相pH 值對峰形及保留時間的影響圖

圖3為采用封尾工藝C18柱，流動相中的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液用乙酸調(diào)節(jié)pH=5.0，不同比例有機相（第6～8 組）對保留時間的影響，甲醇比例是10%、15%、25%分別對應的保留時間為50.730 min、31.155 min、14.530 min。由圖3可知，隨著甲醇有機相比例的升高，保留時間逐漸縮短。因此為了得到良好的峰形并且縮短檢測時間，0.02 mol·L-1乙酸銨（pH=5）+甲酸=25+75 更適合脫氫乙酸的分析。

圖3 不同流動相比例對保留時間的影響圖

2.3 固相萃取對樣品中脫氫乙酸峰形的影響

圖4是同一市售食醋是否通過固相萃取凈化處理的色譜圖。由圖4可知，部分食醋在脫氫乙酸保留時間附近會出現(xiàn)雜質(zhì)峰，若出現(xiàn)雜質(zhì)峰不易分離的情況，可使用固相萃取柱凈化的方式除去雜峰。

圖4 固相萃取凈化對色譜峰的影響圖

2.4 標準曲線線性、精密度、準確度和方法檢出限、方法定量限

經(jīng)過上述實驗，確定高效液相色譜法測定食醋中脫氫乙酸含量的最佳色譜條件為0.02 mol·L-1乙酸銨（乙酸調(diào)節(jié)pH=5.0）+甲醇=75+25 為流動相，使用封尾工藝的C18色譜柱，在293 nm 下對經(jīng)過C18固相萃取小柱凈化處理后的樣品上機測定。

使用1.2 配制的標準曲線工作溶液，采用上述色譜條件，以濃度為X軸、峰面積為Y軸繪制標準曲線，回歸方程為0.51～10.29 μg·mL-1，Y=0.553 9X-0.089，r=0.999 5；1.03～205.79 μg·mL-1，Y=0.558X+0.128，r=0.999 9。在該條件下，取樣品5.0 g 兩份，分別加入10 μg 和25 μg 脫氫乙酸標準品。按照樣品處理方法處理后上機，信噪比分別為9.3 和13.2，符合國家標準《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）對檢出限、定量限的規(guī)定。由表1可知，該方法的回收率及RSD 值均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的相關要求，說明該方法可在不同水平準確測定食醋樣品中脫氫乙酸的含量。

表1 回收率及重復性考察結果表

續(xù)表1

3 結論

通過試驗分析證明，在測定食醋中脫氫乙酸含量過程中，采用封尾工藝C18色譜柱，0.02 mmol·L-1乙酸銨（乙酸調(diào)節(jié)pH=5）+甲醇=75+25 流動相體系，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為293 nm 的色譜條件，可以縮短脫氫乙酸的出峰時間，獲得穩(wěn)定的峰形，使用C18固相萃取小柱進行前處理的方法，可以準確檢驗食醋中的脫氫乙酸含量。