即食食品中6種致病菌恒溫?zé)晒饪焖贆z測(cè)方法的建立及應(yīng)用

◎ 黃小真

（福州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 福州 350008）

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌是6 種常見的食源性致病菌，是國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢和食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)判定微生物污染的6 個(gè)重要指標(biāo)項(xiàng)目，2022 版國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則、GB 29921—2021、GB 31607—2021 以及GB 19298—2014 對(duì)即食食品中以上6 種致病菌進(jìn)行了規(guī)定[1-4]。目前這6 種致病菌的檢測(cè)方法還是傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法，步驟煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，完成6 種致病菌的檢測(cè)通常需要3～7 d，不能滿足食品制售企業(yè)和市場(chǎng)監(jiān)督檢驗(yàn)部門快速檢測(cè)的要求，無法及時(shí)評(píng)價(jià)膳食風(fēng)險(xiǎn)。利用PCR技術(shù)同時(shí)快速檢測(cè)即食食品中該6 種致病菌的方法可供參考甚少[5-7]。因此，建立一種可同時(shí)快速檢測(cè)大批量食品中多種致病菌的方法是食品微生物檢測(cè)研究的方向。

本項(xiàng)目針對(duì)即食食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌6 種致病菌，設(shè)計(jì)前增菌方法、選擇Bst 聚合酶及特異性引物，采用一個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增條件，進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn)，同時(shí)將該方法應(yīng)用于市售食品樣品的檢測(cè)，建立一種快速檢測(cè)即食食品中6 種致病菌的恒溫?zé)晒夥?，為食品安全快速檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

沙門氏菌（ATCC14028）、金黃色葡萄球菌（ATCC8538）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、蠟樣芽孢桿菌[CMCC（B）63303]以及銅綠假單胞菌（ATCC27853）6 株標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；12 份市售食品樣品包括包裝飲用水、巴氏鮮奶、什錦谷物粉、瑞士卷、全脂高鈣羊奶粉、冰淇淋、鮮蝦沙拉、涼拌牛肉、生食三文魚魚段、鮮切芒果、檸檬無骨雞爪以及海鮮壽司拼盤。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒；沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌6 種核酸檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自廣州迪奧生物科技有限公司；緩沖蛋白胨水（BPW）、7.5%氯化鈉肉湯、LB1增菌液、3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、SCDLP 增菌液以及營(yíng)養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器

ABI 7500Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；SHP-250 生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Telstar Bio Ⅱ Advance 生物安全柜，泰事達(dá)機(jī)電設(shè)備（上海）有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品預(yù)增菌

在潔凈室中，分別稱取25 g（mL）食品樣品放入盛有225 mL 增菌液的無菌均質(zhì)袋中，以10 000 r·min-1均質(zhì)1 min 后進(jìn)行培養(yǎng)，增菌液和培養(yǎng)條件見表1。

表1 6 種致病菌增菌液和培養(yǎng)條件表

1.4.2 細(xì)菌DNA 模板的制備

將增菌液搖勻，取100 μL 轉(zhuǎn)移至預(yù)裝900 μL DNA提取液的DNA 提取管中，渦旋振蕩混勻，100 ℃條件下熱浴10 min，室溫放置10 min，完成后的上清液即為提取的核酸基因組。10 000 r·min-1離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，可-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 反應(yīng)體系配制

根據(jù)6 種致病菌核酸檢測(cè)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，加入96 孔樣品板中：每個(gè)待檢樣品需反應(yīng)液22 μL，Bst聚合酶1.0 μL，密封液20 μL，DNA模板2 μL，每個(gè)反應(yīng)體系25 μL。

1.4.4 恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)

將配制好的反應(yīng)體系混合后，10 000 r·min-1離心30 s，立即放入ABI 7500Fast 熒光PCR 儀進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇None，設(shè)置反應(yīng)程序，將63 ℃ 15 s、63 ℃ 45 s 作為一個(gè)循環(huán)，于63 ℃ 45 s 處收集熒光信號(hào)，共45 個(gè)循環(huán)。

1.4.5 特異性試驗(yàn)

取實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的6 種致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)活培養(yǎng)，提取相應(yīng)DNA 模板，用恒溫?zé)晒夥z測(cè)，6 種致病菌各自空白增菌液作為陰性對(duì)照，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.4.6 靈敏度試驗(yàn)

按表1前處理增菌方法，將各自菌液10 倍梯度稀釋至10-9，每個(gè)稀釋度取1 mL 進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)。同時(shí)，選擇3個(gè)合適稀釋度（102～104）CFU·mL-1的菌液，各取1 mL進(jìn)行DNA 提取后用恒溫?zé)晒夥z測(cè)，驗(yàn)證該方法的靈敏度。

1.4.7 食品樣品檢測(cè)試驗(yàn)

用恒溫?zé)晒夥ㄍ瑫r(shí)檢測(cè)12 份市售即食食品中的6種致病菌，同時(shí)按照GB 4789 系列國(guó)標(biāo)方法[8-13]進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性和時(shí)效性。采用人工污染樣品方法，分別取經(jīng)過平板計(jì)數(shù)確定濃度為103CFU·mL-1的6 種致病菌純菌菌液1 mL 加入12份市售食品樣品中，用恒溫?zé)晒夥z測(cè)，驗(yàn)證樣品陽(yáng)性檢出率。試驗(yàn)方案見表2、表3。

表2 12 份市售即食食品試驗(yàn)方案表

表3 96 孔樣品板試驗(yàn)方案樣品編號(hào)表

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性

采用恒溫?zé)晒夥▽?duì)6 種致病菌純培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，6 種致病菌均有相對(duì)應(yīng)的特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照均無擴(kuò)增曲線。陰陽(yáng)性結(jié)果準(zhǔn)確率為100%。因此，該試驗(yàn)建立的恒溫?zé)晒夥ㄌ禺愋詮?qiáng)。6 種致病菌恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增圖譜見圖1、表4。

圖1 6 種致病菌恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增圖譜圖

表4 96 孔樣品板試驗(yàn)結(jié)果表（Ct 值）

2.2 方法靈敏度

經(jīng)過營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)確定后，原始純菌菌液經(jīng)過10 倍梯度稀釋后，選取菌液濃度（102～104）CFU·mL-13 個(gè)稀釋度用恒溫?zé)晒夥z測(cè)，該方法檢測(cè)6 種純菌靈敏度均達(dá)到103CFU·mL-1。

2.3 市售食品樣品檢測(cè)

12 份即食食品購(gòu)于超市，有固體樣品、半固體樣品、液體樣品，包括預(yù)包裝食品、散裝速食方便食品和鮮切水果等，分別采用恒溫?zé)晒夥ê蛧?guó)標(biāo)培養(yǎng)法同時(shí)檢測(cè)6 種致病菌。通過恒溫?zé)晒夥ê蛧?guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，12 份樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，12 份人工污染樣品檢出陽(yáng)性菌，恒溫?zé)晒夥ㄅc國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果一致性達(dá)到100%。針對(duì)12 份市售即食食品同時(shí)檢測(cè)6 種致病菌，從樣品制備到檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)報(bào)送，恒溫?zé)晒夥z測(cè)全過程耗時(shí)24 h，國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法檢測(cè)全過程耗時(shí)7 d。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了即食食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌6 種致病菌同時(shí)快速檢測(cè)恒溫?zé)晒夥?，該方法特異性?qiáng)，對(duì)食品基質(zhì)無特殊要求，檢測(cè)靈敏度達(dá)到103CFU·mL-1，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。實(shí)際檢測(cè)工作中遇到的食品樣品復(fù)雜多樣，需要檢測(cè)的目標(biāo)菌種類繁多，該方法基于96 孔樣品板和相同的儀器試驗(yàn)條件，可滿足同時(shí)檢測(cè)不同食品樣品的多種目標(biāo)菌，極大地提高了檢測(cè)效率，可用于食品安全突發(fā)事件應(yīng)急檢測(cè)。