不同食用菌菌絲體的培養(yǎng)與儲藏

◎ 林 虹

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528400）

食用菌（Edible fungi）是可供食用的大型真菌通稱，俗稱菇、菌，多屬擔(dān)子菌亞門。食用菌不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富，而且具有較高的藥用價值[1]。隨著食品研究從營養(yǎng)型的傳統(tǒng)食品向生理調(diào)節(jié)型的功能食品的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)了許多菌絲型保健品，食用真菌成為人們關(guān)注的焦點。因此，真菌菌絲的研究對于真菌生產(chǎn)與菌絲產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。溫度可以影響食用菌菌絲生長，在一定溫度范圍內(nèi)，食用菌的生長速度隨著溫度的升高而成對數(shù)生長[2]。而超過最適溫度后，隨著溫度的升高生長速度反而會急劇下降。不同食用菌最適生長條件、生長形態(tài)、最適儲藏條件不一，本文以虎松茸、黑牛肝菌、草菇、竹蓀菌4 種食用菌菌絲體的培養(yǎng)及儲藏為例進(jìn)行闡述。

1 材料與方法

1.1 食用菌的選擇

為確保菌種活力，食用菌的選擇上尤為講究，以農(nóng)場新鮮采摘的為佳，挑選生命力旺盛的新鮮食用菌子實體作為菌種來源。

本試驗采用農(nóng)場新鮮采摘的虎松茸、黑牛肝菌、草菇、竹蓀菌，選取生長旺盛期的食用菌，采摘時注意菌蓋不能破損。以草菇為例，子實體發(fā)育可分為針頭期、鈕期、卵形期、伸長期和成熟期，應(yīng)選擇伸長期的子實體，具體成熟標(biāo)志是菌膜已破，菌蓋尚未完全開展，內(nèi)卷明顯，形成“銅鑼邊”。摘菇時大拇指和食指捏緊菇柄的基部，先左右旋轉(zhuǎn)，然后再輕輕向上拔起，要注意連同整個底端一同挖出，否則會造成斷裂，容易感染細(xì)菌，并且保存時間較短[3]。

1.2 培養(yǎng)基的選擇

在基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上結(jié)合文獻(xiàn)資料方法[4-5]，采用正交試驗設(shè)計，反復(fù)試驗，摸索適宜的食用菌菌絲體培養(yǎng)基。經(jīng)過試驗確認(rèn)可以采用下述培養(yǎng)基，交替培養(yǎng)，確保菌種活力。

（1）母種培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g、蛋白胨25 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg 和水1 L。容器選擇玻璃試管或培養(yǎng)皿，試管的規(guī)格18 mm×180 mm 或20 mm×200 mm。棉塞要使用梳棉或化纖棉，不應(yīng)使用脫脂棉，也可使用硅膠塞代替棉塞。另外化學(xué)試劑類原料如硫酸鎂、磷酸二氫鉀，要使用化學(xué)純或以上級別的試劑[6]。

（2）PDA 培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水至1 L，pH 值自然。使用大型針筒注射器將配制好的培養(yǎng)基分裝于每一根試管中，注意試管口保持潔凈、干燥，并用膠塞或棉塞封口。于120 ℃，0.13 kPa，滅菌25 min 后置于超凈工作臺，待其冷卻制備成試管斜面，備用。為檢查培養(yǎng)基滅菌效果，應(yīng)隨機(jī)抽取3%～5%的試管，直接置于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，若無微生物生長則為滅菌合格。

1.3 接種培養(yǎng)

接種前將新鮮采摘的食用菌菌柄基部泥土處理干凈，并用酒精棉快速擦拭食用菌表層。在超凈工作臺，用滅菌刀片劃開食用菌頂端，挑取頂端中心位置生長旺盛部分的子實體于母種培養(yǎng)基，建議單次挑取芝麻大小顆粒為宜，一根管建議接種1～2 顆子實體，置于適宜的培養(yǎng)條件培養(yǎng)（表1）。

表1 食用菌培養(yǎng)條件表

培養(yǎng)過程及時查看菌絲生長情況并記錄，記錄內(nèi)容包括溫度、菌絲生長速度、菌絲形態(tài)、完成培養(yǎng)時間等，并對關(guān)鍵點進(jìn)行拍照、鏡檢。菌絲體的觀察方法分為宏觀觀察和微觀觀察，其中宏觀觀察是菌絲萌發(fā)后每隔3 d 進(jìn)行拍照記錄，對其菌落形態(tài)特征進(jìn)行宏觀觀察，記錄菌絲生長情況，直至滿皿；微觀觀察是挑取成熟期菌落的菌絲，壓片后置于顯微鏡下觀察，拍照[6]。

1.4 儲藏條件確認(rèn)

菌絲體培養(yǎng)完成后，需要檢查試管塞是否潔凈、干燥，若不是則及時更換，并纏繞封口膜，做好防護(hù)后置于適宜的條件下儲存保藏。要求參考《食用菌菌種通用技術(shù)要求》（NY/T 1742—2009）[7]、《草菇菌種》（GB/T 23599—2009）[8]、《暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種》（DB53/T 491—2013）[9]等標(biāo)準(zhǔn)，定期復(fù)蘇或重新培養(yǎng)。

菌種保藏目前常用的保藏方法為液氮超低溫保藏、冷凍干燥保藏、石蠟油封藏、試管傳代保藏等。前兩種方法效果良好，但對于技術(shù)、設(shè)備及資金要求較高，不適合企業(yè)生產(chǎn)；后兩種方法操作相對簡便，價格低廉，但由于轉(zhuǎn)管次數(shù)過多，極易造成菌種退化，給生產(chǎn)帶來損失，且占據(jù)的保藏空間較大。短期菌種保藏使用最為廣泛的是繼代培養(yǎng)低溫保藏法，即在繼代培養(yǎng)后室溫存放1～2 個月或者冰箱（4～8 ℃）存放3～4 個月，此類方法需要頻繁轉(zhuǎn)接，因此易被污染和退化。長期保藏一般采用超低溫（液氮）保藏法，這種方法保存時間可長達(dá)8年，但缺點是需要專門的設(shè)備且維護(hù)費用較高[10]。而-20 ℃液體管冷凍保存的方式保藏食用菌菌種這種方法既保證了菌種得到有效的保存，而且價格低廉，占用保藏空間小，同時一臺家庭常用冰箱就可以完成保藏，應(yīng)用簡便、廣泛[11]。

從保藏效果、設(shè)備及資金要求、便捷性等方面綜合評價，本文中4 種食用菌菌種保藏均采用普遍的菌絲體低溫保藏方法，儲藏時可以用牛皮紙、報紙等物品對試管做好避光處理，可以有效延長儲藏時長。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長情況

虎松茸、黑牛肝菌、草菇、竹蓀菌4 種食用菌菌絲體的培養(yǎng)采用母種培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基交替使用。食用菌菌絲形態(tài)特征如表2所示，生長速度最快的是草菇，虎松茸次之，竹蓀菌和黑牛肝菌培養(yǎng)時間較長。

表2 食用菌菌絲形態(tài)特征表

在母種培養(yǎng)基培養(yǎng)下，4 種食用菌菌絲體生長情況如下。①虎松茸菌絲體潔白濃密，菌絲棉絮狀，較短，平貼培養(yǎng)基生長，培養(yǎng)10～15 d 可長滿整個斜面。②黑牛肝菌菌絲體原位凸起生長，前期白色，后逐漸黃綠色，生產(chǎn)速度緩慢，需培養(yǎng)20 d 左右，且菌絲逐漸向培養(yǎng)基內(nèi)部生長。③草菇菌絲體菌絲放射狀、蒼白色至淺灰色，氣生菌絲充滿試管空間，菌絲無倒?fàn)?，隨著菌絲體不斷生長逐漸覆蓋整個試管，生長速度快，5～10 d 即可完成培養(yǎng)。④虎松茸只在接種位置生長，擴(kuò)展性差，難長滿整個斜面，且緊密的粘附在培養(yǎng)基表層，需培養(yǎng)15～20 d。

母種培養(yǎng)后，需采用PDA 培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，馴化菌種，提高活力，培養(yǎng)方法和生長狀態(tài)同母種培養(yǎng)基。

2.2 菌絲體的儲藏

經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，儲藏時間越長，菌種活力下降、受污染風(fēng)險增大，建議儲藏時長控制在60 d 為佳?；⑺扇?、黑牛肝菌、草菇和竹蓀菌4 種菌絲體的儲存條件如表3所示。

表3 菌絲體儲存條件表

3 結(jié)論

經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，虎松茸應(yīng)避光、25 ℃培養(yǎng)，10～15 d 可長滿整個斜面，菌絲體儲藏應(yīng)4 ℃避光；黑牛肝菌應(yīng)避光、31 ℃培養(yǎng)，生產(chǎn)速度緩慢，需培養(yǎng)20 d 左右，菌絲體儲藏應(yīng)4 ℃避光；草菇應(yīng)避光、25 ℃培養(yǎng)，生長速度快，5～10 d 即可完成培養(yǎng)，菌絲體儲藏應(yīng)15～20 ℃避光；竹蓀菌應(yīng)避光、25 ℃培養(yǎng)15～20 d，菌絲體儲藏應(yīng)4 ℃避光。