初級纖毛相關(guān)信號通路在小鼠腭發(fā)育中的機制研究進展

廉舒博陳玨蓉何 葦

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科,貴州 遵義 563000)

初級纖毛是以微管為基礎(chǔ)的天線狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞器,在進化上十分保守,是細(xì)胞外信號(如生長因子、激素、光、機械刺激、氣味和發(fā)育形態(tài)等)的傳感器[1]。 有研究報道Hedgehog(Hh)、Wnt、PDGFα 和Ca2+通道等信號受體定位于纖毛膜上[2-4],并對機械應(yīng)力等多種刺激以及來自細(xì)胞外環(huán)境的各種信號分子作出反應(yīng)[5-6]。 初級纖毛的功能或結(jié)構(gòu)缺陷可導(dǎo)致相關(guān)信號通路發(fā)揮異常,而引起一系列的疾病,稱為纖毛相關(guān)疾病[7]。 有研究表明腭的生長發(fā)育和融合受Sonic Hedgehog(Shh)、Wnt、FGF 及TGF等多種信號通路調(diào)節(jié)[8-11],其信號傳導(dǎo)異常可導(dǎo)致胚胎多種器官發(fā)育障礙,其中包括腭的發(fā)育。 本文對腭發(fā)育機制中相關(guān)的初級纖毛及相關(guān)信號通路作一綜述,以期為先天性腭裂發(fā)生的防治提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 初級纖毛的結(jié)構(gòu)與功能

初級纖毛(primary cilia,PC)是根據(jù)細(xì)胞周期和發(fā)育規(guī)律進行組裝和拆卸的動態(tài)細(xì)胞器,與細(xì)胞的分化狀態(tài)和微環(huán)境密切相關(guān)。 PC 由9 對微管組成的中央軸突組成,由基底體成核,并被富含特定信號受體的雙層脂膜和離子通道所包圍,基底體結(jié)構(gòu)來源于細(xì)胞分裂后的中心粒[12]。 在基底和纖毛之間有一個被稱為纖毛過渡區(qū)(transiton zone, TZ)的區(qū)域,它包含特殊的門控結(jié)構(gòu),如Y-連接,它與基底體過渡纖維一起,控制纖毛蛋白的進出,從而有助于細(xì)胞器的區(qū)域化[13]。 除了TZ 和基底體過渡纖維的門控外,纖毛的組成和功能也受到主動轉(zhuǎn)運機制的調(diào)節(jié),包括針對特定受體或信號分子的囊泡運輸途徑[14], 以及纖毛內(nèi)運輸系統(tǒng)( intraflagellar transport, IFT),它上下拉動軸絲微管,介導(dǎo)特定的纖毛蛋白進入或離開細(xì)胞器[15]。

由于初級纖毛缺乏合成其組裝、維持及轉(zhuǎn)運所需的蛋白質(zhì)的能力,所以需要依賴于IFT[16]。 IFT是由多蛋白復(fù)合體(稱為IFT 蛋白)沿軸絲介導(dǎo)的雙向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。 IFT 蛋白根據(jù)生化特性及運輸方向不同分為IFT-A 復(fù)合體IFT-B 復(fù)合體。 IFT-B 復(fù)合體介導(dǎo)的纖毛蛋白從纖毛基底部運輸?shù)嚼w毛頂部的運輸稱為順向轉(zhuǎn)運[17]。 IFT-B 復(fù)合體包含了16種 蛋 白 質(zhì)(IFT20、 IFT22、 IFT25、 IFT27、 IFT38、IFT46、IFT52、IFT54、IFT56、 IFT57、 IFT70、 IFT74、IFT80、IFT81、IFT88 和IFT172),其中,IFT88 是IFTB 復(fù)合物的核心組件[18]。 順向轉(zhuǎn)運還依賴于異源三聚體驅(qū)動蛋白-2 蛋白(heterotrimeric kinesin-2 protein, kinesin-2),該蛋白由驅(qū)動蛋白-3A(kinesin like protein 3A,KIF3A)和驅(qū)動蛋白-3B(kinesin like protein 3B,KIF3B)以及一個附屬亞基運動相關(guān)蛋白(kinesin-associated protein,KAP)組成。 從纖毛頂端到基底部的運輸稱為逆向轉(zhuǎn)運,是由Dynein-2 和IFT 復(fù)合體A 介導(dǎo)的[16-17]。 IFT-A 復(fù)合體由6 種蛋白組成,包括IFT43、IFT121、IFT122、IFT139、IFT140和IFT144,其中,IFT122 是IFT-A 復(fù)合體的中心樞紐[19-20]。 由于PC 自身需依靠IFT 蛋白介導(dǎo)相關(guān)信號分子蛋白的轉(zhuǎn)運,IFT 系統(tǒng)的任何蛋白成分的缺失都會導(dǎo)致初級纖毛結(jié)構(gòu)、功能及相關(guān)信號通路的異常,從而引起纖毛相關(guān)疾病[7,21]。

2 腭的發(fā)育過程

腭的發(fā)育過程是顱面部形態(tài)發(fā)生的重要事件。從宏觀角度來看,腭由原發(fā)腭和繼發(fā)腭融合而成,原發(fā)腭來自中鼻突,并最終形成前牙區(qū)的硬腭。 繼發(fā)腭來自左右兩個上頜突,并向中線方向生長,但由于舌發(fā)育較快,且?guī)缀醭錆M了原始口腔,因此繼發(fā)腭在舌兩側(cè)垂直向下生長;由于下頜骨的長度和寬度的增加以及頭顱因發(fā)育而向上抬高等因素,舌的形態(tài)變得扁平且位置逐漸下降,繼發(fā)腭向水平方向轉(zhuǎn)動并向中線生長;繼發(fā)腭已經(jīng)達到舌面上方的水平位置,繼發(fā)腭繼續(xù)向兩個腭突交匯的中線方向快速生長,在兩者中線處接觸,最終發(fā)生融合。 在腭發(fā)育的過程中,即腭突的生長、上抬、附著、融合中的任何一個過程發(fā)生異常,都會引起腭裂發(fā)生[22-23]。

3 相關(guān)信號通路

3.1 Hedgehog 信號通路

Hedgehog 家族分泌的信號分子對于許多生物體的正常胚胎發(fā)育至關(guān)重要。 在哺乳動物中,Shh在胚胎內(nèi)許多區(qū)域的發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,包括腭部發(fā)育。 哺乳動物有3 種Hh 同源蛋白,分別為Sonic Hedgehog (Shh)、Desert Hedgehog(Dhh)以及Indian Hedgehog(Ihh)[2,24]。 Shh 和Ihh 在許多組織中都具有重要功能,有時是重疊的功能,其中Shh信號通路與腭發(fā)育的關(guān)系最為密切。 Shh 信號通路可通過調(diào)節(jié)腭胚突上皮-間充質(zhì)之間的交互作用,從而對雙側(cè)腭突的發(fā)育產(chǎn)生重要影響[25]。

免疫定位實驗表明,Shh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多核心成分大多定位在初級纖毛上,并隨著配體的不同作用而改變其分布[24]。 Shh 信號通路涉及與跨膜受體(patched 1,Ptch1)的結(jié)合,在沒有Shh 信號的情況下,Ptch1 抑制跨膜平滑蛋白(smoothened protein,Smo)進入PC, Smo 是一種7 次跨膜蛋白,其結(jié)構(gòu)類似于G 蛋白偶聯(lián)受體;當(dāng)Shh 配體存在并與Ptch1結(jié)合時, 可將Ptch1 移出PC 并解除對Smo 的抑制,激活的Smo 進入初級纖毛并通過抑制融合抑制因子(suppressor of fused,Sufu)激活Gli 家族轉(zhuǎn)錄因子(包括Gli1、Gli2、Gli3)以調(diào)控Hedgehog 下游靶基因的表達[26-27]。 驅(qū)動蛋白家族成員KIF7 是纖毛中Gli 蛋白運輸?shù)淖罴押蜻x物,是Shh 信號通路的核心成分。 在沒有Shh 配體的情況下,KIF7 定位于初級纖毛的基部,并與Gli2 和Gli3 相互作用,是Gli3 在Hedgehog 反應(yīng)中定位于纖毛所必需的。

IFT 蛋白對于物質(zhì)轉(zhuǎn)運進出初級纖毛是必不可少的,這些組分的突變可導(dǎo)致纖毛缺陷和人類疾病[7]。 KIF3A 是IFT 系統(tǒng)的重要組成部分,Yuan等[28]采用組織學(xué)方法研究KIF3A 缺失對腭部的影響,并用不同的轉(zhuǎn)基因報告菌株研究KIF3A 基因缺失對Hedgehog 和Wnt 信號的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)KIF3A 缺失導(dǎo)致了神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cells, NCCs)對Hedgehog 信號無反應(yīng),對Wnt 信號高反應(yīng)。 這種異常的分子信號導(dǎo)致了細(xì)胞增殖異常,并出現(xiàn)繼發(fā)性腭裂。 在缺乏KIF7 的胚胎中,Shh 信號通路異常,且Gli2 和Gli3 在纖毛中幾乎檢測不到[29-30]。 由于正常的Shh 功能需要初級纖毛和發(fā)生在該細(xì)胞器內(nèi)的Gli 蛋白轉(zhuǎn)錄活性的精細(xì)調(diào)控,而這一過程依賴于正常的IFT。 因此,IFT 中任何蛋白的缺失均可影響初級纖毛結(jié)構(gòu)或功能,導(dǎo)致Shh信號傳導(dǎo)失敗,從而影響胚胎內(nèi)正常組織器官的發(fā)育[7]。

IFT88 是初級纖毛的組裝和功能所必需的核心蛋白,介導(dǎo)關(guān)鍵發(fā)育信號通路的活性。 Tian 等[31]發(fā)現(xiàn)在IFT88fl/fl小鼠NCCs 中特異性去除IFT88,可導(dǎo)致腭發(fā)育早期神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖減少,以及腭突間充質(zhì)細(xì)胞Shh 信號通路下調(diào),隨后在NCCs 衍生的腭突間充質(zhì)細(xì)胞中失去初級纖毛,從而引起嚴(yán)重的顱面缺陷,包括雙側(cè)唇腭裂和舌發(fā)育不全。 最近,有研究揭示IFT122 是IFT-A 的中心樞紐[20]。 國內(nèi)有學(xué)者為闡明IFT122 對PC、Shh 信號通路以及小鼠胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞(mouse embryo palatal mesenchymal cells, mEPMCs) 增殖的影響,采用RNAi 技術(shù)敲減了PC 中IFT122 的表達觀察PC 的生長情況;并檢測Smo、Gli3、細(xì)胞增殖標(biāo)志物(PCNA)和細(xì)胞周期因子(Cyclin D1)的表達變化以及mEPMCs 的數(shù)量變化;結(jié)果顯示缺乏IFT122 組中PC 的發(fā)生率降低且長度變短,并且Gli3、Smo、Cyclin D1 及PCNA 的表達低于IFT122 正常組,同時,缺乏IFT122 組中mEPMCs 的數(shù)量增長速度減緩。 該研究表明IFT122 通過介導(dǎo)Shh 信號通路參與調(diào)控mEPMCs 增殖,同時也間接反映了PC 及其介導(dǎo)的Shh 信號通路在小鼠腭部發(fā)育中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[32]。

3.2 Wnt 信號通路

Wnt 信號通路是腭部組織發(fā)育的重要通路之一。 有研究表明,Wnt 信號通路的幾個核心成分均定位于初級纖毛,初級纖毛可參與調(diào)控Wnt 信號通路[33-34]。 根據(jù)分子機制的不同,Wnt 信號傳導(dǎo)通路主要分為兩種:Wnt/β-catenin 信號通路和Wnt/PCP信號通路。 在Wnt/β-catenin 信號通路中,Wnt 配體與Frizzled(FZD)受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL receptor related protein,LRP)輔助受體的結(jié)合而被激活,LRP 受體隨后被酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α, CK1α)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β) 磷 酸 化, 并 激 活Dishevelled(Dsh/Dvl)蛋白質(zhì)以抑制GSK3 破壞復(fù)合物的活性,促進細(xì)胞質(zhì)β-catenin 的穩(wěn)定,從而進入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達,影響細(xì)胞的增殖、分化和存活[35]。 Wnt-PCP 信號通路主要調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、遷移和定向細(xì)胞分裂,并依賴于大量受體組合和下游信號事件[35]。

盡管有研究表明初級纖毛在調(diào)節(jié)Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用,但其在Wnt 信號中的作用仍存在爭議。 小鼠胚胎缺乏纖毛微管-驅(qū)動蛋白KIF3A,可導(dǎo)致Wnt/β-catenin 信號的異常激活,并且,在缺乏關(guān)鍵纖毛發(fā)生基因(KIF3A、IFT 88 或OFD1)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中,初級纖毛的丟失與Wnt3a 配體的異常有關(guān)[36]。 這些發(fā)現(xiàn)支持了初級纖毛抑制Wnt/β-catenin 信號的觀點。 另一項研究表明,具有KIF3A、IFT88、IFT72 突變的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞表現(xiàn) 出 正 常 的Wnt/β-catenin 信 號 活 性[37]。 Tian等[31]發(fā)現(xiàn),在Wnt1Cre-IFT88fl/fl小鼠腭突間充質(zhì)中,纖毛細(xì)胞的比例及纖毛長度減少,Wnt 信號活性升高,這表明初級纖毛對Wnt 信號通路起著抑制作用。 該研究還發(fā)現(xiàn),在Wnt1Cre-IFT88fl/fl小鼠中,Axin2 在小鼠腭突間充質(zhì)口腔側(cè)的表達水平升高,這提示在腭裂發(fā)生過程中,IFT88 介導(dǎo)的纖毛缺陷也可能影響典型的Wnt 信號通路。 非典型的Wnt信號相關(guān)分子在腭皺褶發(fā)育過程中表現(xiàn)出動態(tài)的時空表達模式。 在IFT88 突變小鼠中,ROR2 的表達下調(diào)。 這表明初級纖毛參與了腭皺紋發(fā)育過程中非典型的Wnt 信號的調(diào)節(jié)[38]。 此外,Yuan 等[28]發(fā)現(xiàn)PC 所調(diào)控的Wnt 信號和Hedgehog 通路可共同介導(dǎo)小鼠胚胎腭突上皮與間充質(zhì)之間相互作用。該研究發(fā)現(xiàn)KIF3A 缺失可導(dǎo)致小鼠胚胎腭突間充質(zhì)中同一區(qū)域的Wnt 信號異常增高以及Hedgehog信號異常降低,這種異常的分子信號導(dǎo)致了異常的細(xì)胞增殖,進而影響小鼠腭突上皮/間充質(zhì)的轉(zhuǎn)換,從而引起腭部畸形。

3.3 Shh 信號通路

有文獻報道,Shh 通過Smo 向腭突間充質(zhì)傳遞信號,并通過正反饋環(huán)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子10(fibroblast growth factor 10,Fgf10)的表達,以調(diào)控腭部上皮和間質(zhì)的增殖[39]。 Shh 信號在腭間充質(zhì)中激活或維持幾種轉(zhuǎn)錄因子,包括Foxf1、Foxf2、Bmp2和OSR2。 OSR2 是mEPMCs 增殖的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子,其在mEPMCs 中的表達還依賴于Pax9 轉(zhuǎn)錄因子的功能。 在OSR2 和Pax9 缺失的胚胎中可出現(xiàn)非綜合征性腭裂,并且Fgf10 在發(fā)育中的腭間充質(zhì)中的表達顯著減少,表明這些轉(zhuǎn)錄因子通過Shh 和Fgf10信號通路在基因調(diào)控腭發(fā)育網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用[40]。值得注意的是,最近的遺傳研究揭示了一種新的Shh-Foxf1/2-Fgf18-Shh 分子回路,即Foxf1 和Foxf2是Shh 和FGF 之間腭部調(diào)控反饋環(huán)的一個重要部分,Shh 依賴Foxf1/2 激活Fgf18,Fgf18 反饋調(diào)節(jié)Shh 的表達,這對腭突的生長發(fā)育至關(guān)重要。Foxf2-/-小鼠胚胎可異位激活腭突間充質(zhì)特定區(qū)域Fgf18 的表達并使腭上皮對應(yīng)區(qū)域的Shh 表達異常,從而導(dǎo)致腭突生長障礙[41]。

Msx1 激活腭突間充質(zhì)中的Bmp4,并向上皮發(fā)出信號,激活Shh 信號通路,隨后,Shh 反過來向腭突間充質(zhì)發(fā)出信號,激活Bmp2,控制腭突間充質(zhì)細(xì)胞的增殖,并積極調(diào)節(jié)Msx1 和Bmp4[42]。 因此,Msx1 基因敲除的小鼠表現(xiàn)出腭裂表型以及腭部Bmp2 和Shh 表達異常,而補充Bmp4 可以恢復(fù)Bmp2 和Shh 的表達[43]。 有學(xué)者研究利用Hedgehog信號功能增強的小鼠模型K14-Cre-R26SmoM2,揭示Shh 信號在腭部融合過程中腭部上皮中的作用,詳細(xì)的組織學(xué)分析顯示,新生(出生后第0.5 天)K14-Cre-R26SmoM2 小鼠出生后不久死亡,并表現(xiàn)出嚴(yán)重的腭部融合缺損,其原發(fā)腭突未能與繼發(fā)腭突融合,鼻中隔也未能與腭突融合,中線前后部有一條半透明的條帶,而且繼發(fā)腭前部有持續(xù)性的正中嵴上皮細(xì)胞(medial edge epithelium,MEE),以及分隔腭骨的薄薄的上皮條索,阻礙了雙側(cè)腭突沿中線的融合。 這些數(shù)據(jù)表明,在腭部發(fā)生過程中,MEE 特別需要下調(diào)Shh 信號,以確保正常的腭部融合[44]。

上述研究表明與小鼠腭發(fā)育相關(guān)的很多信號因子均與Shh 信號通路有交互作用,而Shh 信號的傳導(dǎo)依賴于PC,故可間接反映這些信號因子在小鼠腭突中的傳遞也與PC 有密切聯(lián)系。

4 總結(jié)與展望

隨著對初級纖毛的Hedgehog 信號通路和Wnt信號通路影響認(rèn)識的不斷加深,初級纖毛及相關(guān)信號通路調(diào)控腭裂發(fā)生的機制已逐漸成為焦點研究領(lǐng)域。 目前,雖然部分研究已經(jīng)明確Hedgehog 信號通路及非經(jīng)典Wnt 信號通路依賴于纖毛參與腭部發(fā)育過程中細(xì)胞增殖、存活、遷移等的調(diào)控,然而,初級纖毛與Wnt 信號通路的關(guān)系仍存在爭議,且腭裂發(fā)生的每一步的作用和作用機制,我們還遠未完全了解。 腭發(fā)育中的其它重要信號通路如Notch、TGF-β 與纖毛的關(guān)系尚不明確,Hedgehog 信號通路與其他信號通路之間是否存在串?dāng)_尚不清楚。 我們還需更多的研究來闡明這種初級纖毛及相關(guān)信號通路在腭發(fā)育中的復(fù)雜機制,從而為理解腭裂的發(fā)病機制提供重要依據(jù)。