ALPPS 動(dòng)物模型構(gòu)建及相關(guān)研究的新進(jìn)展

陳 穴陳 耿

(陸軍軍醫(yī)大學(xué) 大坪醫(yī)院肝膽外科,重慶 400042)

肝切除術(shù)是首選的肝癌根治性治療手段。 但我國(guó)肝癌患者的手術(shù)切除率僅有15%~25%。 相當(dāng)部分患者因切除腫瘤后剩余的功能性肝組織體積(future liver remnant, FLR)過小而被迫放棄手術(shù)切除。 對(duì)于正常肝,FLR 必須大于25%;而對(duì)于硬化肝,FLR 至少要求高于40%。 故FLR 不足是目前制約肝外科發(fā)展的“阿喀琉斯之踵”[1]。 傳統(tǒng)的促進(jìn)FLR 增生的手段主要是門靜脈栓塞(portal vein embolization, PVE),但其效果非常有限。 近年來(lái),有學(xué)者先后報(bào)道了聯(lián)合肝分隔和門靜脈結(jié)扎的二步肝切除術(shù)(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS),促進(jìn)FLR 增生的速度和幅度遠(yuǎn)優(yōu)于PVE[2]。 目前對(duì)ALPPS 促進(jìn)余肝快速增生的機(jī)制并不十分清楚[3]。 鑒于此,在動(dòng)物模型上復(fù)制ALPPS,有助于深入研究其加速肝再生的分子機(jī)制,具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 ALPPS 動(dòng)物模型的現(xiàn)狀

當(dāng)前關(guān)于ALPPS 動(dòng)物模型的構(gòu)建已經(jīng)取得了諸多進(jìn)展(表1)。 一般認(rèn)為,理想的ALPPS 動(dòng)物模型必須具備如下條件:(1)預(yù)留肝葉必須有獨(dú)立的血液流入道(門靜脈和肝動(dòng)脈)和流出道(肝靜脈);(2)預(yù)留肝葉和待切除肝葉之間必須充分劈離,以防二者之間出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)[4]。

1.1 大動(dòng)物ALPPS 模型

既往研究顯示豬與人的肝在解剖學(xué)和生理學(xué)上有許多相似之處,因此長(zhǎng)期被用于實(shí)驗(yàn)外科研究[27-30]。 豬肝的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單,血管鑄型研究發(fā)現(xiàn),豬肝是高度分葉的,肝實(shí)質(zhì)能做到完全離斷,肝靜脈和下腔靜脈很近,被尾狀葉包裹。 豬行ALPPS 后FLR 增生非常顯著[21]。 但由于動(dòng)物體積大,手術(shù)及麻醉操作復(fù)雜,成本較高,因而較少使用。 羊也可以用于構(gòu)建ALPPS 動(dòng)物模型[4],但羊是一種反芻動(dòng)物,它的胃腸道在進(jìn)食后容易產(chǎn)氣,不僅會(huì)導(dǎo)致胃膨脹,還會(huì)讓肝門區(qū)域的游離變得困難。 羊的血管壁很薄,在離斷肝實(shí)質(zhì)的過程中容易出血,因此操作需要非常精細(xì)。

1.2 中型動(dòng)物ALPPS 模型

兔作為中等大小的動(dòng)物,也被廣泛用于肝再生研究,是肝部分切除、門靜脈結(jié)扎(portal vein ligation, PVL)或PVE 動(dòng)物模型的理想選擇。 有學(xué)者對(duì)兔的不同門靜脈分支進(jìn)行結(jié)扎并結(jié)合肝實(shí)質(zhì)分隔,結(jié)果均能促進(jìn)肝再生,但由于兔肝的解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,使得對(duì)其行ALPPS 極其困難,實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的死亡率較高[16]。 所以兔作為ALPPS 動(dòng)物模型的穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步提高。

1.3 小動(dòng)物ALPPS 模型

小動(dòng)物(大/小鼠)是一個(gè)很好的選擇,因?yàn)檫@些動(dòng)物很容易飼養(yǎng)和管理,且價(jià)格便宜。 從生理上講,它們生理代謝更快,解剖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,手術(shù)操作更容易,并且很容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[31];同時(shí)對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行基因改造、誘發(fā)急性/慢性疾病、制作腫瘤模型也比較容易,且人類肝再生及腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因在大鼠及小鼠中都可以找到對(duì)應(yīng)的同源基因,因此來(lái)自大、小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論可能同樣適用于大動(dòng)物或者人類[32]。 另一個(gè)好處是,雖然小鼠和大鼠肝的解剖結(jié)構(gòu)與人類有很大不同,但是中葉具有與人類肝相似的門脈結(jié)構(gòu),加上其強(qiáng)大的再生能力,完全能夠滿足ALPPS 動(dòng)物模型的要求。

1.4 特殊類型的ALPPS 動(dòng)物模型

我國(guó)是肝炎大國(guó),每年新發(fā)的肝癌病例中,大部分伴有不同程度的肝炎后肝硬化[33]。 考慮到肝硬化對(duì)肝再生有明顯的影響,建立肝硬化ALPPS 動(dòng)物模型非常有必要。 目前大多用四氯化碳、硫代乙酰胺制作肝硬化模型。 有研究發(fā)現(xiàn)肝硬化時(shí)ALPPS 誘導(dǎo)的肝再生效果明顯減弱,且具有較高的死亡率,并且再生啟動(dòng)較晚,且持續(xù)的時(shí)間比正常大鼠要長(zhǎng),可能與肝實(shí)質(zhì)離斷后肝內(nèi)門體分流減少有關(guān)[24,34]。

通過高脂飼料喂養(yǎng)SD 大鼠建立非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠模型,發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)飼料喂養(yǎng)的大鼠相比,NAFLD大鼠FLR 的增長(zhǎng)率、Ki-67(+)肝細(xì)胞和CD68(+)肝巨噬細(xì)胞(kupffer cell)細(xì)胞減少,但術(shù)后血清中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平較對(duì)照組明顯升高。 提示炎癥性脂肪變性延緩了ALPPS 手術(shù)誘導(dǎo)的肝再生,但其機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步研究[22]。

2 大/小鼠ALPPS 模型建立的要點(diǎn)

從解剖學(xué)上看,大/小鼠的肝都有明顯的分葉,通常由4 個(gè)主要的肝葉組成,分別稱為右側(cè)葉、中葉、左側(cè)葉和尾狀葉。 每個(gè)葉都有自己獨(dú)立的門靜脈、肝動(dòng)脈和膽管系統(tǒng)。 4 個(gè)葉都通過單獨(dú)的肝靜脈與下腔靜脈相連。 其中肝中葉分別由左、右門脈供血,左右兩側(cè)的動(dòng)脈供應(yīng)和膽管結(jié)構(gòu)各不相同,該葉的流出道由左、右、中3 條肝靜脈組成,人肝的情況也是如此。 因此選擇切開肝中葉最能模擬人類肝的劈離。 在制作大/小鼠ALPPS 模型時(shí),通往右、左、尾狀葉的門靜脈分支必須結(jié)扎,只留下中葉門靜脈灌注(圖1)[13,35]。 由于肝右中葉約占肝總體積的20%,與臨床上行ALPPS 前的PVL 相近[23],因此建立模型時(shí)通常將肝右中葉作為預(yù)留肝。 實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)在研究門靜脈血流和壓力變化、肝組織灌注和氧合等生理機(jī)制方面,大鼠模型優(yōu)于小鼠模型,大鼠模型不需要切除左外側(cè)葉和膽囊,從而避免了對(duì)相關(guān)研究結(jié)果的潛在影響。

圖1 結(jié)扎右側(cè)葉、左中葉、尾狀葉及左外側(cè)葉的門靜脈分支Figure 1 Ligation of portal vein branches of RL, LML, CL and LLL

大/小鼠ALPPS 一期術(shù)中,除了行PVL 外,還需要沿著肝中葉缺血線劈開(圖2、3),這也是該模型的重點(diǎn)與難點(diǎn)。 正確估算肝實(shí)質(zhì)劈離的深度相當(dāng)困難,下腔靜脈一旦損傷就難以止血,靠近下腔靜脈的肝后部分劈開可減少并發(fā)癥的發(fā)生。 多項(xiàng)研究表明,保持與下腔靜脈的最小距離約為5 mm,可以避免左、中肝靜脈的損傷,從而避免大出血[4,13,17]。 在離斷肝實(shí)質(zhì)時(shí),可以采用4-0 絲線結(jié)扎斷面血管,也可以壓迫止血、電凝止血,也可采用生物止血材料。

圖2 肝中葉缺血線(白色箭頭)Figure 2 Middle lobe ischemia line(white arrow)

部分學(xué)者在動(dòng)物模型中進(jìn)行了二期手術(shù)切除的嘗 試[5,9,12-13,20-25,36]。 與 人 類 不 同, 大/小 鼠

ALPPS 術(shù)后肝的增生更為迅速。 有研究發(fā)現(xiàn)大鼠ALPPS 一期術(shù)后2 d FLR 即可增加153%,術(shù)后4 d可以增加260%[7]。 當(dāng)然,由于手術(shù)方式不同,不同的研究報(bào)道的大/小鼠ALPPS 術(shù)后FLR 增生幅度差異較大,例如有研究發(fā)現(xiàn)ALPPS 一期術(shù)后7 d FLR 僅增生了68%[15]。 不過,大部分研究選擇的一、二期手術(shù)間隔時(shí)間一般為2~7 d。 需要指出的是,兩次手術(shù)間隔時(shí)間越長(zhǎng),腹腔粘連情況越明顯,第二期手術(shù)也難度越大。

圖3 肝左、右中葉橫截面Figure 3 Cross section of left and right middle lobe

3 基于ALPPS 動(dòng)物模型的相關(guān)研究

3.1 肝加速再生觸發(fā)機(jī)制的研究

Kawaguchi 等[15]建立了大鼠ALPPS 靜脈淤血模型(ALPPS+左肝靜脈結(jié)扎),發(fā)現(xiàn)淤血組FLR 的增生較單純ALPPS 組更為明顯,Ki-67 陽(yáng)性肝細(xì)胞的數(shù)量也大于ALPPS 組,提示肝劈開后的肝實(shí)質(zhì)淤血對(duì)于ALPPS 術(shù)后肝再生有著非常顯著的促進(jìn)作用。 Schadde 等[37]發(fā)現(xiàn)由于肝動(dòng)脈緩沖效應(yīng)(hepatic arterial buffer response, HABR) 的存在,ALPPS 一期術(shù)后預(yù)留側(cè)肝的肝動(dòng)脈血流會(huì)顯著下降并導(dǎo)致明顯的肝組織缺氧;Kron 等[38]發(fā)現(xiàn)采用脯氨酰羥化酶抑制劑激活PVL 大鼠的缺氧信號(hào)通路可以顯著加速肝組織再生,而消除ALPPS 大鼠肝組織缺氧則可以延緩肝再生,強(qiáng)烈提示組織缺氧可能是肝再生的重要加速因子;Dirscherl 等[39]也發(fā)現(xiàn)缺氧的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)中存在促血管生成因子的激活,能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)依賴的血管生成,在快速肝再生中可能起著關(guān)鍵作用。

3.2 肝再生相關(guān)細(xì)胞因子的研究

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),ALPPS 術(shù)后早期血清及肝組織生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、TNF-α、和IL-6 等的表達(dá)水平顯著高于PVL 組,其中IL-6 的表達(dá)水平大約是PVL 組的6 倍,預(yù)留肝組織中TNFα、IL-6 和HGF 水平比對(duì)照組高約3 倍[8,10-11]。Schlege 等[5]將ALPPS 組小鼠血漿注射到PVL 組小鼠體內(nèi),使后者的預(yù)留肝再生速度可以達(dá)到前者水平,提示由創(chuàng)傷誘導(dǎo)增加的生長(zhǎng)因子是ALPPS 促進(jìn)FLR 增生的主要因素。 有學(xué)者復(fù)制該模型,發(fā)現(xiàn)射頻消融聯(lián)合PVL 促進(jìn)FLR 增生的效果與ALPPS 相當(dāng),且細(xì)胞因子濃度無(wú)差異,與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)也幾乎相同,認(rèn)為射頻消融可以實(shí)現(xiàn)與肝實(shí)質(zhì)離斷相同的效果;通過基因分析,發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)損傷之后釋放的生長(zhǎng)因子激活了參與細(xì)胞再生的基因,并下調(diào)了參與細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的基因[14]。

3.3 肝再生相關(guān)信號(hào)通路的研究

Langiewicz 等[19]發(fā)現(xiàn)c-Jun 氨基末端蛋白激酶1(JNK1)介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞旁分泌IHH(Indian hedgehog)對(duì)于肝實(shí)質(zhì)的加速再生是必需的,JNK1-IHH 軸是ALPPS 促進(jìn)肝再生所特有的機(jī)制。 Shi等[9]發(fā)現(xiàn)ALPPS 后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和YAP 蛋白(yes associated protein)激活,可能在肝再生中起重要作用。 Otsuka 等[26]在大鼠ALPPS 模型中發(fā)現(xiàn)ALPPS 加速肝再生與非受體型酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/STAT3 通路的激活有密切關(guān)系,而胰島再生源蛋白(regenerating islet-derived protein,Reg)Reg3ɑ 和Reg3β 的表達(dá)可能在JAK2/STAT3 通路的活化中扮演著重要角色,作者還認(rèn)為炎性細(xì)胞因子的升高并不是ALPPS 促進(jìn)FLR 快速增生的主要原因;Colak 等[40]分別在肝切除、ALPPS 和PVL 術(shù)后24 h 和96 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法對(duì)肝基因表達(dá)及再生信號(hào)通路的激活進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)肝損傷后基因表達(dá)的改變是時(shí)間依賴性的,大量的細(xì)胞周期相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子、DNA 復(fù)制調(diào)控基因、細(xì)胞和生長(zhǎng)因子參與了這一過程。

3.4 腫瘤學(xué)相關(guān)研究

為了探究ALPPS 是否對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用,Kikuchi 等[41]分別對(duì)小鼠轉(zhuǎn)移性肝癌模型行ALPPS 和PVL 術(shù)后的腫瘤增殖活性和相關(guān)細(xì)胞因子的水平進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)預(yù)留肝在術(shù)后任何時(shí)相點(diǎn)都沒觀察到腫瘤生長(zhǎng)加速的跡象,而門脈結(jié)扎側(cè)肝在術(shù)后晚期(≥9 d)可以觀察到腫瘤進(jìn)展,并且循環(huán)中的細(xì)胞因子對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的沒有明確影響。Kambakamba 等[36]通過體外實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均發(fā)現(xiàn)ALPPS 沒有直接的促腫瘤生長(zhǎng)作用。 然而也存在爭(zhēng)議。 García-Pérez 等[42]在大鼠ALPPS 模型中發(fā)現(xiàn)ALPPS 可以促進(jìn)腫瘤在門靜脈結(jié)扎側(cè)肝葉中的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,肝血管生成因子VEGF 和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá)急劇上升,同時(shí)伴有枯否細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage,TAM)的顯著增加以及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的下降。 因此,ALPPS 是否促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,還需要進(jìn)一步探究。

4 總結(jié)

ALPPS 是近十年來(lái)肝外科臨床最重要的突破之一,其不僅提供了一種新的擴(kuò)大肝切除方式,更重要的是為進(jìn)一步研究肝再生機(jī)制打開了一扇希望之門。 總結(jié)既往研究成果,血流動(dòng)力學(xué)改變(門靜脈結(jié)扎)和生長(zhǎng)因子的釋放是促進(jìn)余肝快速增生不可缺少的兩大要素,而在對(duì)生長(zhǎng)因子的探索中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)信號(hào)分子、JAK-Ihh 軸和JAK2/STAT3 等信號(hào)通路參與其中。 我們相信,隨著ALPPS 動(dòng)物模型的發(fā)展和成熟,有關(guān)ALPPS 促進(jìn)肝再生機(jī)制及其病理生理特性的研究可望取得更大的突破。