某教學(xué)醫(yī)院耐碳青霉烯類(lèi)高毒力肺炎克雷伯菌臨床及分子特征

喬 艷，孫 紅，李江艷，應(yīng)沖濤，黃永強(qiáng)，郝斐然，余 蓮，郭 普

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，安徽 蚌埠 233004； 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蚌埠 233004； 3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院輸血科，安徽 蚌埠 233004； 4. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

隨著細(xì)菌適應(yīng)性進(jìn)化，兼具高耐藥性和高毒力的耐碳青霉烯類(lèi)高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae，CR-hvKP)已逐漸在臨床流行[1]。2015年Zhang等首次報(bào)道了CR-hvKP的存在[2]，隨后相繼在中國(guó)上海等地出現(xiàn)了CR-hvKP流行，給臨床帶來(lái)嚴(yán)重的威脅[3]。除中國(guó)外，歐美等國(guó)也出現(xiàn)了CR-hvKP臨床感染的報(bào)道[4]。CR-hvKP菌株攜帶大量毒力因子和耐藥基因，其引起的感染治療相當(dāng)困難，患者病死率高[3]。近年來(lái)，不同ST類(lèi)型的CR-hvKP不斷出現(xiàn)，流行范圍逐漸擴(kuò)大，而且耐藥及毒力不斷發(fā)生新的突變，各地流行病學(xué)特征也有較大差異。研究[5]顯示，肺炎克雷伯菌ST分型已超過(guò)2 000種型別，在中國(guó)，ST11為CR-hvKP主要流行型別，也有其他ST型別的報(bào)道，包括ST25、ST15和ST375等。目前，CR-hvKP相關(guān)研究報(bào)道較少，其致病、耐藥機(jī)制及流行特點(diǎn)尚不十分明確。筆者調(diào)查分析安徽某教學(xué)醫(yī)院臨床分離CR-hvKP的耐藥、毒力及流行病學(xué)特征，對(duì)于了解CR-hvKP的臨床特征，制定感染控制措施，阻止其傳播流行具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株鑒定 收集2018年1月—2020年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床分離的CRKP非重復(fù)分離株，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(法國(guó)生物梅里埃公司)鑒定細(xì)菌。根據(jù)菌株拉絲試驗(yàn)結(jié)果和rmpA、iutA和iucA基因結(jié)果將CRKP分為CR-hvKP和 碳青霉烯耐藥非高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant non-hypervirulentKlebsiellapneumoniae, CR-non-hvKP)。其中拉絲試驗(yàn)和rmpA、iutA和iucA基因同時(shí)陽(yáng)性為CR-hvKP。收集CR-hvKP和 CR-non-hvKP患者基本信息(如患者年齡、性別等)、基礎(chǔ)疾病、侵襲性操作以及臨床轉(zhuǎn)歸情況等。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705。

1.2 藥敏試驗(yàn) 采用全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀VITEK 2(法國(guó)生物梅里埃公司)檢測(cè)抗菌藥物敏感性。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2020版標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。替加環(huán)素和多粘菌素B結(jié)果分別采用美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)和歐洲AST(EUCAST) 標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 拉絲試驗(yàn) 用接種環(huán)輕輕挑取經(jīng)過(guò)18～24 h 37℃培養(yǎng)的5%羊血瓊脂平板上的純菌落，形成黏連且長(zhǎng)度均>5 mm的黏液絲，重復(fù)3次出現(xiàn)相同情況則認(rèn)為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.4 DNA提取 挑取經(jīng)過(guò)18～24 h 37℃培養(yǎng)的血瓊脂平板上的純菌落加入3 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃、220 r/min搖床12 h培養(yǎng)后，取菌液1 mL，12 000 r/min離心2 min后，棄上清，留沉淀，用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取菌株DNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)回收產(chǎn)物的純度和濃度，合格樣品OD260/OD280為1.7～1.9。

1.5 毒力和耐藥基因檢測(cè) 按1∶1配比從2018年1月—2020年12月該院分離的CR-non-hvKP中選取與CR-hvKP同病室或相近時(shí)間內(nèi)分離菌株作為對(duì)照組，采用illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)(上海生工生物有限公司)對(duì)CR-hvKP和對(duì)照組CR-non-hvKP菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序。在Linnux系統(tǒng)下運(yùn)行SPAdes-2.0軟件拼接原始數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CR-hvKP菌株的分布情況 2018年1月—2020年12月該院臨床共分離512株CRKP，其中CR-hvKP 30株，CR-non-hvKP 482株。30株CR-hvKP主要來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU，14株，46.67%)、神經(jīng)外科(6株，20.00%)和急診內(nèi)科(4株，13.33%)等；標(biāo)本來(lái)源為痰(14株，46.67%)、血(12株，40.00%)、尿(2株，6.67%)和膿液(2株，6.67%)。

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 30株CR-hvKP經(jīng)全基因組測(cè)序共發(fā)現(xiàn)43種耐藥基因。攜帶β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因主要有blaKPC-2(93.33%)、blaTEM-1(80.00%)、blaCTX-M-65(73.33%)、blaSHV-12(80.00%)。氨基糖苷類(lèi)耐藥基因主要有aadA2(80.00%)、rmtB(80.00%)、

表1 CR-hvKP與CR-non-hvKP對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況比較[株(%)]

aac(3)-IId(30.00 %)、mph(A)(30.00%)，喹諾酮類(lèi)耐藥基因qnrSl(46.67%)、qnrB4(6.67%)，oqxA(6.67%)、oqxB(3.33%)，磷霉素耐藥基因fosA6(100%)和fosA3(20.00%)，磺胺類(lèi)耐藥基因主要攜帶sul2(43.33%)和sul1(43.33%)，四環(huán)素耐藥基因tet(A)(36.67%)。30株CR-hvKP耐藥基因SHV-11、mph(A)和armA的檢出率低于CR-non-hvKP菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 30株CR-hvKP攜帶的毒力基因iucA、iutA、fimF、fimH、mrkD檢出率高于CR-non-hvKP菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 CR-hvKP與CR-non-hvKP耐藥基因檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparison of detection results between CR-hvKP and CR-non-hvKP resistance genes

2.5 莢膜血清型及ST分型 30株CR-hvKP菌株中ST11型28株，ST23型2株。通過(guò)莢膜和ST組合分成幾個(gè)克隆基因型：ST11-K64(23株，76.67%)、ST11-K47(5株，16.67%)和ST23-K1(2株，6.67%)；30株CR-non-hvKP菌株中ST11型27株，ST15型3株，莢膜和ST組合分成幾個(gè)克隆基因型：ST11-K64(12株，40.00%)、ST11-K47(14株，46.67%)和ST15-K107(3株，10.00%)和ST11-K57(1株，3.33%)。CR-hvKP菌株中ST11-K64檢出率(76.67%)高于CR-non-hvKP菌株

表3 CR-hvKP與CR-non-hvKP毒力基因檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 Comparison of virulence gene detection results between CR-hvKP and CR-non-hvKP

(40.00%)；而CR-non-hvKP菌株中ST11-K47檢出率(46.67%)高于CR-hvKP菌株(16.67%)；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 CR-hvKP與CR-non-hvKP莢膜血清型及ST分型檢測(cè)結(jié)果比較

2.6 CR-hvKP的臨床特征 CR-hvKP感染患者多為老年患者(66.67%)，存在呼吸系統(tǒng)疾病(96.67%)、消化系統(tǒng)疾病(40.00%)、感染性休克(33.33%)、侵入性治療(23例，76.67%)以及高病死率(20例，66.67%)。見(jiàn)表5。CR-hvKP組病死率(20例，66.67%)高于CR-non-hvKP組(125例，25.93%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CR-hvKP死亡組與存活組患者臨床特征比較，死亡組患者>60歲、感染性休克、氣管插管及動(dòng)靜脈置管比率較存活組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表5 CR-hvKP組與CR-non-hvKP組患者的臨床特征分析[例(%)]

表6 CR-hvKP死亡組與存活組患者臨床特征分析[例(%)]Table 6 Clinical characteristics of patients in death group and survival group of CR-hvKP (No. of cases[%])

3 討論

近年來(lái)，CR-hvKP菌株的相關(guān)臨床報(bào)道逐漸增多，由于CR-hvKP兼具多重耐藥和高毒力特性，給公眾健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，成為真正的“超級(jí)細(xì)菌”。本研究中2018—2020年共收集30株CR-hvKP，檢出率為5.86%。雷靜等[6]對(duì)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU的研究報(bào)道CR-hvKP檢出率為13.2%。Zhang等[5]對(duì)中國(guó)56個(gè)中心的CR-hvKP檢測(cè)情況進(jìn)行分析，CR-hvKP感染患病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，從2015年2.0%的檢出率增長(zhǎng)為2017年的8.1%，不同地區(qū)之間差異較大(0～25.8%)，其中河南(25.4%)和山東(25.8%)較高。30株CR-hvKP來(lái)源于30例臨床患者的不同感染部位，患者主要來(lái)自于ICU、急診內(nèi)科以及神經(jīng)外科，均為成年人，年齡>60歲的患者占66.67%，說(shuō)明老年患者是CR-hvKP感染的易感人群，與相關(guān)報(bào)道一致[7]。多數(shù)患者伴有呼吸及消化系統(tǒng)等基礎(chǔ)疾病，23例患者有氣管插管等侵入性操作史。30株CR-hvKP分離自患者的痰、血、尿和膿液標(biāo)本，其中以痰標(biāo)本為主，占46.67%，與老年患者呼吸道功能下降及呼吸機(jī)的使用有關(guān)，CR-hvKP也是引起血流感染的重要病原菌。與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道CRKP感染的危險(xiǎn)因素主要為患者有基礎(chǔ)疾病、侵入性操作及抗菌藥物暴露史等相近。盡管30例CR-hvKP感染患者均接受了抗感染治療，依然有20例患者死亡，病死率高達(dá)66.67%，高于CR-non-hvKP菌株引起感染的患者，與相關(guān)研究[9-10]報(bào)道結(jié)果一致。提示臨床需要對(duì)CR-hvKP菌株進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以防止感染的發(fā)生與流行，給患者生命健康帶來(lái)威脅。通過(guò)對(duì)CR-hvKP感染死亡組和存活組患者臨床特征分析顯示：年齡>60歲、感染性休克、動(dòng)靜脈置管和氣管插管等侵入性操作史可能會(huì)增加感染患者的病死率。這部分患者常合并基礎(chǔ)疾病，病情復(fù)雜，往往需要使用各種置管，侵入性操作也增加了感染CR-hvKP的機(jī)會(huì)，而CR-hvKP高毒力和高耐藥特點(diǎn)，增加了死亡的風(fēng)險(xiǎn)。

肺炎克雷伯菌的重要毒力因子主要包括莢膜多糖、脂多糖和鐵載體等[14]。rmpA可以促進(jìn)莢膜多糖的合成，屬于黏液表型調(diào)節(jié)基因，而鐵載體在CR-hvKP的生長(zhǎng)和感染中起著關(guān)鍵作用，其中氣桿菌素為鐵載體活性主要成分，占90%，氣桿菌素由iucABCD操縱子編碼，其同源受體由iutA基因編碼[15]。目前大多研究都基于高黏液表型和攜帶rmpA和iucA基因作為hvKP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)本研究CR-hvKP菌株中莢膜相關(guān)基因(rmpA)，菌毛相關(guān)基因(fimH、mrkD)以及鐵載體相關(guān)基因(iucA)等主要毒力基因攜帶率為100%，高于CR-non-hvKP菌株，CR-hvKP菌株同時(shí)還攜帶其他的毒力基因，與相關(guān)報(bào)道相似[13]。莢膜為由糖和多肽組成的一層黏液物質(zhì)，位于細(xì)菌細(xì)胞壁外，可以使細(xì)菌具有黏附性及遠(yuǎn)處定植，同時(shí)可抵抗血清殺菌及抗中性粒細(xì)胞吞噬。根據(jù)莢膜多糖的不同，可將高毒力肺炎克雷伯菌分為82個(gè)莢膜血清型，其中常見(jiàn)的K1及K2型毒力最強(qiáng)，容易引起感染遷移[17]。CR-hvKP報(bào)道的莢膜血清型與hvKP不同，常見(jiàn)的除Kl、K2外，還有K47、K64及少見(jiàn)血清型如K20、K54、K62等[18]。本試驗(yàn)中檢測(cè)出的CR-hvKP以K64和K47莢膜血清分型為主，與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[3, 5]結(jié)果報(bào)道相近。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)是一種基于核酸序列分析，常用于研究細(xì)菌的進(jìn)化和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的分型方法。ST11型是我國(guó)CRKP最主要克隆群，ST23是經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classical Klebsiella pneumonia, CKP)主要的克隆群[19]。通過(guò)莢膜血清型和ST分型組合，該院30株CR-hvKP主要為ST11-K64，其次為ST11-K47，僅有2株是ST23-K1型。目前，報(bào)道顯示ST11-K64型是CR-hvKP較為常見(jiàn)的莢膜型，在國(guó)內(nèi)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)均有檢出[20-21]。研究[22]顯示，ST11-K64型能夠更快速殺滅大蠟螟幼蟲(chóng)，可以較強(qiáng)的抵抗人中性粒細(xì)胞的殺滅作用，易形成生物被膜，比ST11-K47型毒力強(qiáng)，更適合在醫(yī)院環(huán)境中生存。本研究中ST11-K64在高毒力菌株中的分布高于非高毒力菌株，ST11-K47型非高毒力菌株檢測(cè)率高于高毒力菌株，與相關(guān)研究[22]一致。CR-hvKP的進(jìn)化路線主要有兩種可能，一種是hvKP菌株從CRKP菌種中獲得耐藥質(zhì)粒而表現(xiàn)出相關(guān)的耐藥性；另一種是CRKP菌種從hvKP菌株獲得毒力相關(guān)質(zhì)粒從而表現(xiàn)出高毒力和高耐藥性[5, 23]。本組CR-hvKP主要為ST11-K64型，因此推測(cè)該院分離的CR-hvKP是主要由CRKP獲得毒力質(zhì)粒進(jìn)化而來(lái)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。