特發(fā)性免疫性血小板減少癥患兒血清中ITGB3和PRDX6水平及臨床意義*

岐 錦,王 靜,姚秀坤

山西省兒童醫(yī)院(山西省婦幼保健院)：1.營(yíng)養(yǎng)科；2.血液科，山西太原 030002；3.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030002

特發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種以血小板(PLT)破壞、巨核細(xì)胞成熟障礙為特征的自身免疫性疾病[1]。ITP多見(jiàn)于兒童，目前，激素治療和脾臟切除是治療ITP的主要方案，但少數(shù)患兒仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)或?qū)λ幬锊幻舾械惹闆r，使顱內(nèi)出血等并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，發(fā)現(xiàn)合適的生化指標(biāo)判斷患兒的病情及預(yù)后對(duì)早期臨床干預(yù)至關(guān)重要。整合素β3(ITGB3)是一種跨膜糖蛋白受體，由788個(gè)氨基酸組成，主要存在于PLT和巨核細(xì)胞表面，具有調(diào)控細(xì)胞黏附、凋亡及遷移和介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接等功能[2]。研究表明，ITGB3能夠誘導(dǎo)血小板生成素活化，激活休眠中的造血干細(xì)胞(HSC)，維持HSC活性，促進(jìn)PLT合成[2]。過(guò)氧化物酶(PRDX)6屬于非硒代谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族，其編碼基因位于染色體1q24，相對(duì)分子質(zhì)量約為25 000，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及新陳代謝等過(guò)程[3]。研究表明，PRDX6失活能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致分化為PLT的數(shù)量下降，加速慢性ITP進(jìn)展[3]。目前ITGB3和PRDX6在ITP中的報(bào)道少見(jiàn)，且與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后關(guān)系尚不清楚。因此，本研究旨在探討ITP患兒血清中ITGB3和PRDX6水平及與疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2021年8月山西省婦幼保健院收治的73例ITP患兒作為ITP組，同時(shí)選取70例相同年齡層來(lái)院體檢的健康兒童作為對(duì)照組。ITP組中男32例、女41例，年齡1～11歲、平均(6.27±1.96)歲；對(duì)照組中男31例、女39例，年齡2～10歲、平均(6.33±1.78)歲。兩組的年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。ITP患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)均為首次診斷ITP，且病程<4周；(3)既往未接受過(guò)激素或丙種球蛋白類藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有凝血功能障礙疾病，如：彌漫性血管內(nèi)凝血、血友病及先天性凝血因子缺乏癥等；(2)肝、腎功能障礙；(3)伴有先天或后天性免疫功能異常。本研究經(jīng)山西省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液指標(biāo)的檢測(cè)方法 所有研究對(duì)象均于空腹?fàn)顟B(tài)下采集10 mL靜脈血置于抗凝管中。其中5 mL血液標(biāo)本通過(guò)離心機(jī)(生產(chǎn)廠家：美國(guó)Labnet公司；型號(hào)：SCI-12)離心，離心條件為6 000 r/min(4 ℃)、離心半徑10 cm、離心時(shí)間5 min，收集上清液，采用MC-6600全自動(dòng)血常規(guī)分析儀(生產(chǎn)廠家：深圳市美思康電子有限公司)檢測(cè)PLT計(jì)數(shù)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中ITGB3和PRDX6水平。嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。剩余的5 mL血液標(biāo)本采用全光譜流式細(xì)胞儀(生產(chǎn)廠家：Cytek公司；型號(hào)：Aurora 3L)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞 /CD8+T細(xì)胞比值。將標(biāo)本使用乙二胺四乙酸二鈉進(jìn)行抗凝，每個(gè)試管均加入20 μL的單克隆抗體，混勻后室溫避光染色10～15 min，使用磷酸鹽緩沖液洗滌1遍，棄上清液后加入磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞0.5 mL，之后加入肝素抗凝，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2ITP嚴(yán)重程度分級(jí) (1)輕度：PLT計(jì)數(shù)為(20～100)×109/L，小瘀斑和出血點(diǎn)較少。(2)中度：PLT計(jì)數(shù)為(10～20)×109/L，大瘀斑(直徑>5 cm)和出血點(diǎn)較多，伴有牙齦、鼻、消化道反復(fù)出血，偶見(jiàn)血尿、血便及咳血表現(xiàn)。(3)重度：PLT計(jì)數(shù)<10×109/L，全身廣泛大瘀斑和出血點(diǎn)，伴有牙齦、口腔及咽部持續(xù)性出血，偶見(jiàn)內(nèi)臟出血或顱內(nèi)出血[5]。

1.2.3ITP的治療方法及預(yù)后評(píng)估 (1)對(duì)于PLT計(jì)數(shù)≥20×109/L且無(wú)內(nèi)臟出血者，采用地塞米松(生產(chǎn)企業(yè)：廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H44024469)治療，靜脈注射，劑量為1 mg/(kg·d)，最大劑量≤15 mg。當(dāng)PLT計(jì)數(shù)恢復(fù)正常后，采用潑尼松(生產(chǎn)企業(yè)：華中藥業(yè)股份有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H42021394)治療，口服，初始劑量為1.5～2.0 mg/(kg·d)，逐漸減量至停用。(2)對(duì)于PLT計(jì)數(shù)<20×109/L或伴有內(nèi)臟出血者，采用地塞米松聯(lián)合丙種球蛋白(生產(chǎn)企業(yè)：華蘭生物工程股份有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S10970034)治療。地塞米松用法、用量與(1)中一致。丙種球蛋白的劑量為400 mg/(kg·d)，靜脈注射。當(dāng)血PLT計(jì)數(shù)恢復(fù)正常后，采用潑尼松口服，用法、用量與(1)中一致。(3)若(1)和(2)在經(jīng)過(guò)2周治療后，尚未達(dá)到理想療效，則采用甲潑尼龍(生產(chǎn)企業(yè)：天津天藥藥業(yè)股份有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20020223)實(shí)施沖擊治療，劑量為10 mg/(kg·d)，連續(xù)使用5 d，再次評(píng)估PLT計(jì)數(shù)，采用(1)或(2)中的治療方案。此外，在治療期間進(jìn)行針對(duì)性的飲食管理，如：改善飲食結(jié)構(gòu)、低鈉低膽固醇飲食、多食用含鐵的綠葉蔬菜及增加攝入含有凝血止血成分的食物(銀耳、紅棗、紅衣花生及荷葉等)。治療周期為4周，若PLT計(jì)數(shù)未升高，且臨床癥狀未改善，則判斷為預(yù)后不良[5]。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對(duì)象血液指標(biāo)的比較 ITP組PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平均較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象血液指標(biāo)的比較

2.2不同嚴(yán)重程度ITP患兒各項(xiàng)血液指標(biāo)的比較 重度患兒PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平均低于中度及輕度患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中度患兒PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平低于輕度患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同嚴(yán)重程度ITP患兒各項(xiàng)血液指標(biāo)的比較

2.3血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值的相關(guān)性 血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值均呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值的相關(guān)性

2.4不同預(yù)后情況的ITP患兒血清中ITGB3、PRDX6水平差異 經(jīng)治療，預(yù)后良好患兒64例，預(yù)后不良患兒9例。預(yù)后不良患兒血清中ITGB3、PRDX6水平較預(yù)后良好患兒明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同預(yù)后情況的ITP患兒血清中ITGB3、PRDX6水平比較

2.5血清ITGB3、PRDX6水平對(duì)ITP患兒預(yù)后不良的診斷價(jià)值 以ITP患兒是否出現(xiàn)預(yù)后不良為前提繪制ROC曲線。ITGB3、PRDX6判斷ITP患兒預(yù)后不良的最佳截?cái)嘀捣謩e為105.31 pg/mL、28.98 pg/mL，曲線下面積(AUC)分別為0.786、0.741(Z=3.824，P<0.05；Z=2.841，P<0.05)。兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)判斷ITP患兒預(yù)后不良的AUC為0.852(Z=6.799，P<0.05)，其靈敏度和特異度分別為88.89%和78.12%。見(jiàn)表5和圖1。

表5 血清ITGB3、PRDX6水平對(duì)ITP患兒預(yù)后不良的診斷價(jià)值

圖1 血清ITGB3、PRDX6水平診斷ITP患兒預(yù)后不良的ROC曲線

3 討 論

兒童ITP的具體發(fā)病機(jī)制與機(jī)體免疫失耐受所致的血小板破壞及生成不足有關(guān)。皮膚黏膜出血、牙齦出血及鼻出血是ITP的主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)內(nèi)臟出血或顱內(nèi)出血，危及患者生命。目前，PLT計(jì)數(shù)是判斷ITP嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)，但也有其局限性，而針對(duì)ITP的預(yù)后評(píng)估尚無(wú)法做出有效判斷。因此，為了幫助臨床在早期采用更加合理的治療方案，探索合適的生化指標(biāo)輔助評(píng)估ITP的預(yù)后情況是必要的。

ITGB3又稱CD61，是一種Ca2+依賴的異源二聚體復(fù)合物，相對(duì)分子質(zhì)量為(90～110)×103，其編碼基因位于17號(hào)染色體，包括αvβ3 和αⅡbβ3兩種類型，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、傷口愈合、凝血止血及免疫應(yīng)答等病理生理過(guò)程[6]。BERTRAM等[7]發(fā)現(xiàn)，在拮抗ITGB3后，小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡，血管密度減低，血管生成相關(guān)因子沉默，從而導(dǎo)致顱內(nèi)出血。在ITGB3基因缺失的小鼠中，循環(huán)血管生成細(xì)胞分化減少，同時(shí)對(duì)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞下膜的黏附性降低，無(wú)法與纖維蛋白原結(jié)合，提高了血管滲血或出血的風(fēng)險(xiǎn)[6]。本研究結(jié)果表明，ITP組血清中ITGB3水平較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，提示ITGB3可能是影響ITP發(fā)病的重要因素。其原因可能是抗PLT自身抗體能夠特異性識(shí)別PLT表面的ITGB3，抗體與ITGB3結(jié)合后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞將其吞噬分解，使血清中的ITGB3水平降低[8]。本研究結(jié)果顯示，隨著ITP嚴(yán)重程度的增加，血清中ITGB3水平逐漸降低(P<0.05)，提示ITGB3可能參與了ITP的進(jìn)展。其機(jī)制可能是血清中ITGB3水平降低后，其自身的ICY 結(jié)構(gòu)域失活，發(fā)生去磷酸化，阻礙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白肌球蛋白在糖蛋白(GP)Ⅱb /Ⅲa結(jié)構(gòu)域中積聚，從而使PLT活性喪失，加重ITP病情[8]。此外，ITGB3失活能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使血管通透性增加，同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡使機(jī)體凝血系統(tǒng)異常，PLT合成受阻，導(dǎo)致血清中PLT計(jì)數(shù)下降[2,9]。

PRDX6是僅含有1個(gè)保守半胱氨酸(Cys)殘基的PRDX超家族成員，包含224個(gè)氨基酸，同時(shí)具有磷脂酶A2(PLA2)和谷胱甘肽(GSH)過(guò)氧化物酶功能，在抵御細(xì)胞膜表面氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮重要作用[10]。VRBENSKY等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRDX6失活時(shí)，白細(xì)胞介素-1表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤壞死因子釋放，抑制花生四烯酸合成，阻礙PLT激活，并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在PRDX6基因敲除的大鼠體內(nèi)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度增加，促進(jìn)活性氧(ROS)釋放，抑制PLT生長(zhǎng)因子活性，提高大鼠肺泡出血風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究結(jié)果表明，ITP組血清中PRDX6水平較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，提示PRDX6可能在ITP發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。其原因可能是PRDX6基因啟動(dòng)子沉默，無(wú)法轉(zhuǎn)錄合成PRDX6，造成血清中PRDX6水平下降，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚[12]。本研究結(jié)果表明，隨著ITP嚴(yán)重程度的增加，血清中PRDX6水平逐漸降低(P<0.05)，提示PRDX6可能在ITP進(jìn)展具有調(diào)控作用。其原因可能是PRDX6下調(diào)后能夠激活絲/蘇氨酸激酶(AKT)信號(hào)通路，促進(jìn)促凋亡蛋白Bad磷酸化，誘導(dǎo)PLT失活，促進(jìn)ITP進(jìn)展[12]。此外，PRDX6活性降低能夠使ROS大量合成，促進(jìn)線粒體去極化，使內(nèi)環(huán)境處于氧化還原狀態(tài)，各種凋亡相關(guān)蛋白被激活，促進(jìn)PLT凋亡[13]。

本研究結(jié)果表明，血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞 /CD8+T細(xì)胞比值均呈正相關(guān)(P<0.05)，提示血清中ITGB3、PRDX6水平能夠在一定程度上反映機(jī)體免疫應(yīng)答狀態(tài)和血液中PLT含量。其機(jī)制可能是ITGB3水平降低能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)下調(diào)，抑制CD4+T細(xì)胞活性，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞 /CD8+T細(xì)胞比值失衡，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生識(shí)別PLT的特異性抗體，破壞血管內(nèi)的PLT[14]。PRDX6下調(diào)后無(wú)法消耗ROS，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)ROS水平明顯上升，使CD4+T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原不應(yīng)答，抑制其分裂、增殖，使CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值下降，同時(shí)，過(guò)量的ROS通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)使巨核細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，無(wú)法分化PLT，導(dǎo)致PLT計(jì)數(shù)下降[15]。本研究中預(yù)后不良患兒血清中ITGB3、PRDX6水平均較預(yù)后良好患兒明顯下降(P<0.05)，提示ITGB3和PRDX6水平可能影響ITP患兒的預(yù)后情況，對(duì)輔助臨床早期篩查具有重要意義。ROC曲線顯示，ITGB3和PRDX6聯(lián)合檢測(cè)判斷ITP患兒預(yù)后不良的AUC明顯高于ITGB3、PRDX6單一檢測(cè)的AUC，靈敏度和特異度分別為88.89%和78.12%，提示兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)能夠提高對(duì)ITP患兒是否發(fā)生預(yù)后不良的診斷價(jià)值，同時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度明顯高于單一指標(biāo)檢測(cè)，有利于早期篩查可能發(fā)生預(yù)后不良的患兒，為臨床早期進(jìn)行針對(duì)性治療提供可靠支持。

綜上所述，ITP患兒血清中ITGB3和PRDX6水平降低。同時(shí)，血清中ITGB3和PRDX6水平能夠反映機(jī)體免疫應(yīng)答狀態(tài)和PLT計(jì)數(shù)。這兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)ITP患兒是否發(fā)生預(yù)后不良具有良好的診斷效能，且靈敏度較高，為臨床早期針對(duì)性治療提供幫助。但受試驗(yàn)設(shè)備的限制，血清中ITGB3和PRDX6水平變化的具體機(jī)制尚不清楚，需要在后續(xù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。