環(huán)介導等溫擴增技術在SARS-CoV-2核酸檢測中的應用研究

何禎碩，高 盼，張麗月 綜述,劉萬紅△ 審校

1.武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北武漢 430070；2.河北省衡水市第六人民醫(yī)院檢驗科，河北衡水 053200

2019年出現(xiàn)的新型冠狀病毒感染給全球公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大挑戰(zhàn)，2020年2月國際病毒分類委員會將該新型冠狀病毒命名為嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2),由SARS-CoV-2感染而引起的疾病命名為COVID-19。雖然COVID-19的病死率不及2003年的SARS以及2012年的中東呼吸綜合征(MERS)[1-3]，但是SARS-CoV-2傳播速度快、傳播能力強等特點使其防控難度顯著增加。感染SARS-CoV-2的癥狀主要為干咳、發(fā)熱、乏力以及肌肉酸痛等[4-5]，該癥狀與普通流行性感冒癥狀很難區(qū)分，對臨床醫(yī)師通過癥狀篩查來說是一種巨大的挑戰(zhàn)。目前SARS-CoV-2在分子診斷中的金標準為實時反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術[6-8]。雖然RT-PCR技術在檢測SARS-CoV-2方面具有高度特異性與靈敏度，但它需要特殊的核酸檢測實驗室以及經驗豐富的專業(yè)檢驗人員對結果進行分析，而且檢測周期較長，這在發(fā)展落后的地區(qū)很難實現(xiàn)大規(guī)模應用。因此有必要研究一種簡單、方便、廉價、特異性強且不需要專門儀器設備的檢測方法。環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)以及基于LAMP的各種聯(lián)合檢測技術在SARS-CoV-2檢測中的迅速發(fā)展，使其有望取代傳統(tǒng)的PCR技術成為一種更加靈敏且特異的SARS-CoV-2檢測方法。本文詳細綜述了SARS-CoV-2的結構特點、人類感染機制、LAMP檢測原理以及LAMP技術在SARS-CoV-2檢測中的研究進展。

1 SARS-CoV-2病原學特點

1.1冠狀病毒特點與分類 冠狀病毒通常為典型的球形或多形性，得名于刺突蛋白突出的低聚物，這些低聚物在病毒粒子周圍形成冠狀邊緣，形似日冕[9]。在病毒基因結構方面，冠狀病毒都有相似的結構特點，即單股正鏈RNA病毒，全基因組長度26～32 kb，是套病毒目中最大的一組病毒科。冠狀病毒包含一段約30 kb不分節(jié)段的正義RNA基因組，該基因組包含一個5′帽結構與一個3′多聚A尾結構[10]。 5′帽結構當中包含兩個不同區(qū)域，即前導序列與非翻譯區(qū)(UTR)，在5′的UTR區(qū)域中包含多個RNA復制和翻譯所需的頸環(huán)結構；3′端的UTR區(qū)域還包括病毒RNA復制與合成所需的RNA結構。冠狀病毒含有4種主要的結構蛋白，分別為刺突(S)、膜(M)、包膜(E)、核衣殼(N)蛋白[11]。

冠狀病毒科進一步可細分為4個屬即α、β、γ、δ[10]。到目前為止能夠引起人類感染的冠狀病毒主要包括7種，分別為α屬的HCoV-229E、HCoV-NL63，β屬的HCoV-OC43、HCoV-HKU1以及2003年的SARS-CoV、2012年的MERS冠狀病毒(MERS-CoV)與2019年的SARS-CoV-2[12-14]。

1.2SARS-CoV-2特點

1.2.1SARS-CoV-2結構特點 SARS-CoV-2是一種單股正鏈RNA有包膜的冠狀病毒?；蚪M大小為29 891個核苷酸，編碼9 860個氨基酸，G+C含量約為38%。SARS-CoV-2基因包含2個非翻譯區(qū)與1個編碼多聚蛋白的長開放閱讀框，基因組排列順序為5′-復制酶(ORF1a/b)-結構蛋白[S蛋白-E蛋白-M蛋白-N蛋白]-3′，整個結構缺乏血凝素酯酶基因。在SARS-CoV-2中，ORF1a/b編碼16種非結構蛋白，約占整個基因組的67%，這些非結構蛋白包括兩種病毒性半胱氨酸蛋白酶[木瓜蛋白酶樣蛋白酶(nsp3)和胰凝乳蛋白酶(nsp5)]，RNA依賴的RNA聚合酶(nsp12)、解旋酶(nsp13)，以及其他可能參與病毒轉錄復制的非結構蛋白[15]。

SARS-CoV-2與SARS-CoV的主要區(qū)別在于ORF3b、S蛋白和ORF8，其中在S蛋白S1和ORF8中尤為明顯，這兩個位點之前被認為是重組的熱點。ZHOU等[16]的分析發(fā)現(xiàn)，部分SARS-CoV-2基因與SARS-CoV的核苷酸序列同源性低于80%。然而，ORF1a/b區(qū)域中用于分類的7個保守復制酶域氨基酸序列在SARS-CoV-2與SARS-CoV中同源性卻高達94.4%。他們還發(fā)現(xiàn)，一種蝙蝠冠狀病毒(BatCoV RaTG13)的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)短區(qū)與SARS-CoV-2具有極高的序列同源性，全基因組序列一致性高達96.2%。在所有的序列當中，RaTG13表現(xiàn)出與SARS-CoV-2最近的親緣關系，這與其他與SARS相關的冠狀病毒(SARSr-CoVs)形成了截然不同的譜系。其次，在SARS-CoV-2中，S基因所編碼的受體結合S蛋白與其他SARS-CoV的S蛋白存在很大差異，而與RaTG13 S蛋白的一致性高達93.1%，SARS-CoV-2與RaTG13的S蛋白長度遠高于其他與SARS相關的冠狀病毒S蛋白。同樣，在LU等[17]的分析中證明SARS-CoV-2編碼的S蛋白較SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白更長。

1.2.2SARS-CoV-2的感染機制 冠狀病毒的感染機制主要與S蛋白相關。S蛋白是一個相對分子質量約180×103的跨膜同源三聚體糖蛋白，為Ⅰ類融合蛋白。對于大多數(shù)冠狀病毒來說，宿主蛋白將S蛋白切割處理成兩個亞基即S1和S2，它們在預融合構象中以非共價結合形式存在[18-22]。SARS-CoV-2的S1亞基主要功能區(qū)包括N端結構域(NTD)、受體結合域(RBD)以及受體結合基序(RBM),S2亞基包括兩個七肽重復序列(HR)即HR1與HR2，跨膜結構域(TM)、胞質域(CP)以及融合肽(FP)[23]。S1亞基主要負責與宿主細胞受體結合，而S2亞基在介導病毒與宿主細胞融合并進入宿主細胞中起關鍵作用，HR1與HR2可以相互作用形成六螺旋束(6-HB)，從而使病毒與細胞膜接近，以便相互融合。

與SARS-CoV、MERS-CoV一樣，SARS-CoV-2 S蛋白S1亞基中的RBD區(qū)域能夠特異性識別宿主受體血管緊張素轉換酶2(ACE2)，并使其作為自身功能性受體而進入宿主細胞[16,24-25]。人類ACE2由一個N端肽酶結構域(PD)與一個C端收集素樣結構域(CLD)組成，CLD末端有一個跨膜螺旋和一個約40個殘基的包內段[26]。有研究表明，SARS-CoV-2 S蛋白的胞外域主要與人類ACE2的PD區(qū)域結合，其親和力約15 nmol/L，較SARS-CoV S蛋白的親和力高約10～20倍[27]。另外，SHANG等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV RBM區(qū)域相比，SARS-CoV-2 RBM區(qū)域形成更大的結合界面，與人類ACE2的接觸面積更多，其原因可能為SARS-CoV-2和SARS-CoV RBM的一種結構(即人類ACE2結合脊的環(huán)狀構象)存在顯著差異。人類和果子貍SARS-CoV毒株以及蝙蝠冠狀病毒Rs3367在這個環(huán)狀結構中都含有一個3個殘基基序(脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸)，而SARS-CoV-2和蝙蝠冠狀病毒RaTG13都含有甘氨酸-纈氨酸/谷氨酰胺-谷氨酸/蘇氨酸-甘氨酸4個殘基基序，兩個相對龐大的殘基和兩個柔韌的甘氨酸使這種環(huán)狀結構差異顯著。在SARS-CoV-2 RBM區(qū)域中，因為這些結構上的差異，Asn487和Ala475之間形成了一個額外的主鏈氫鍵，導致脊狀構象更緊湊，包含Ala475的環(huán)更靠近人類ACE2。因此，SARS-CoV-2 RBM中的脊與人類ACE2 N端螺旋的接觸更多。SARS-CoV-2 S區(qū)域對人ACE2的高親和力可能是導致SARS-CoV-2在人與人之間更易傳播的原因[29]。

2 LAMP檢測原理

LAMP首次由日本學者NOTOMI等[30]提出，是一種在等溫條件下對核酸進行擴增的方法。該方法主要包括一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶與4種專門設計的引物，4種引物能夠識別目標DNA上的6個不同序列。6個不同序列主要包括5′端的B1、B2、B3區(qū)以及3′端的F1c、F2c、F3c。引物分為內引物與外引物，內引物當中包括一條上游正向內部引物(FIP)與一條下游反向內部引物(BIP),每條引物都包含兩個不同的序列分別對應目標DNA的有義與反義序列(FIP主要包括F1c、一段TTTT間隔區(qū)以及一條與目標基因3′端F2c互補的F2序列；BIP包括一條與B1互補的B1c序列、一段TTTT間隔區(qū)以及B2序列)，一條內引物用于第一階段的啟動，另一條用于第二階段的自我啟動。兩條外引物包括下游外部引物B3(與B3c 區(qū)域互補)與上游外部引物F3(與F3c互補)。外引物引發(fā)鏈置換DNA的合成，釋放出單鏈DNA，它作為DNA合成的模板，由第二對內外引物啟動DNA的合成(即內外引物與目標DNA的另一端進行雜交，產生莖環(huán)結構)。在隨后的LAMP循環(huán)中，一個內引物與產物上的環(huán)進行雜交并啟動鏈置換DNA的合成，產生原始莖環(huán)DNA與一個比原始莖長兩倍的新莖環(huán)DNA。最終產物是具有多個靶標反向重復序列的莖環(huán)DNA結構與具有多個環(huán)狀結構的花椰菜樣結構。

3 LAMP在SARS-CoV-2檢測中的應用

迄今為止，已有大量關于LAMP以及基于LAMP為基礎的聯(lián)合檢測技術應用于SARS-CoV-2檢測的報道。在這些檢測技術中，檢測/擴增一管化、結果可視化、引物組設計以及減少假陽性概率等是研究人員所面臨的主要問題。

3.1檢測/擴增一管化方案 SARS-CoV-2檢測中，簡化核酸檢測與擴增步驟是縮短檢測時間的關鍵，EL-THOLOTH等[31]以LAMP為基礎，構建了用于檢測COVID-19的兩階段等溫擴增(COVID-19 Penn-RAMP)，實現(xiàn)了檢測與擴增的一管化方案。他們的研究結果顯示，在檢測純化RNA目標時COVID-19 Penn-RAMP的靈敏度比COVID-19 LAMP和COVID-19 RT-PCR高10倍，在檢測模擬患者標本時，靈敏度比COVID-19 LAMP和COVID-19 RT-PCR高100倍。但是，由于當時缺乏COVID-19感染病例導致他們無法用真實患者的標本進行測試。隨后，LAMB等[32]的研究證明，在經過RNA提純的模擬SARS-CoV-2感染以及實際COVID-19患者的標本中，RT-LAMP檢測均能在30～45 min特異性地檢測出SARS-CoV-2的存在，然而，當對未經RNA提純的COVID-19患者標本進行檢測時，RT-LAMP的特異度與靈敏度卻顯著下降。

3.2標本處理與優(yōu)化 TAKI等[33]的研究中得出，在經過RNA提純步驟的唾液與鼻咽拭子標本當中，利用RT-LAMP方法檢測的靈敏度與特異度兩者均分別為97%與100%。而當檢測未經RNA提純的鼻咽拭子與唾液標本時，兩者的靈敏度降低到只有71%與47%。如何在未進行RNA提純步驟的前提下提高檢測靈敏度與特異度是困擾研究人員的難題之一。

LALLI等[34]通過實驗證明，當對唾液標本進行65 ℃ 15 min以及95 ℃ 5 min加熱處理并冷卻至4 ℃后，RT-LAMP對標本中SARS-CoV-2的檢測限能夠達到59個粒子拷貝數(shù)，其靈敏度與特異度得到了顯著提高。HOWSON等[35]在進行RT-LAMP檢測之前，用MucolyseTM1∶1稀釋唾液標本，然后用10% (w/v) Chelex 100 Resin再次稀釋，98 °C加熱2 min，經過這兩步處理的唾液標本利用RT-LAMP在短短5 min 43 s內就被檢測到了SARS-CoV-2的存在。他們的實驗證明，對唾液標本的預處理在一定程度上能夠縮短檢測周期。但是由于唾液預處理以及下游分析過程仍然需要一些特殊的培訓以及設備，使其在大規(guī)模核酸檢測中的應用仍然受到一定限制。

3.3基于LAMP的聯(lián)合檢測技術 以LAMP為基礎的聯(lián)合核酸檢測技術正逐漸受到研究人員的關注。例如，一些研究人員基于RT-LAMP，建立了一種基于CRISPR-Cas12蛋白快速檢測SARS-CoV-2的方法[36]。這種方法能夠靈敏且特異性地檢測出患者呼吸道標本中SARS-CoV-2的存在，其陽性預測值達95%，陰性預測值達100%。WANG等[37]開發(fā)了一套基于CRISPR/Cas12的“多相復式非連續(xù)生產法”用于檢測SARS-CoV-2的系統(tǒng),俗稱“一鍋法” (opv CRISPR) ，將RT-LAM與Cas12a裂解整合在一個反應體系中。這與前面EL-THOLOTH等[31]的研究有相似之處，即RT-LAMP試劑在試管底部孵育，而在試管頂部加入CRISPR/Cas12a反應試劑。研究表明opv CRISPR的靈敏度與RT-PCR相當，比RT-LAMP約高10倍，Cas12a的切割提高了RT-LAMP的靈敏度，使其檢測靈敏度提高到接近單分子水平，opv CRISPR的診斷結果與美國疾病控制與預防中心(CDC)批準的定量RT-PCR檢測結果100%一致。但是兩項研究在面對未提純的標本時其檢測的靈敏度與特異度均出現(xiàn)不同程度的下降。

3.4引物組設計與結果可視化研究 LAMP反應需要6種引物，到目前為止公開的LAMP引物設計工具很少，現(xiàn)有的工具沒有充分考慮到LAMP反應的復雜性，其次可視化反應容易受外界環(huán)境因素影響而使結果產生假陽性，因此特異性的引物組設計以及穩(wěn)定的顏色變化也是提高靈敏度與特異度不可或缺的步驟。HUANG等[38]分別針對SARS-CoV-2的ORF1a/b、S基因以及N基因區(qū)域設計了4組引物(O117、S17、N1和N15)，結果發(fā)現(xiàn)，引物N1與S17的檢測限最低均達到80 copy/mL。然而由于他們所應用的可視化原理主要是通過pH的變化來實現(xiàn)，其結果受臨床環(huán)境因素影響較大，易產生假陽性。在后續(xù)的研究中，他們在引物FIP的5′端連接了6-羧基熒光素(FAM)使顯色結果變得更加穩(wěn)定，但仍然沒有解決標本純化問題。

HUANG等[39]以病毒擴增所需的總時間(TT)以及假陽性率(FP)將所設計出的引物進行評分(總分4分，評分越低表明假陽性概率越低)并結合一種生物信息學算法篩選出了22種新型特異性引物(N7～N28)。其中，N7、N25和N27的總體表現(xiàn)最好，TT均小于20 min,FP評分均為1分。除此之外，他們還設計了6對針對M基因以及7對針對S基因的引物。在所有研究的引物中N7、N27、M以及M6表現(xiàn)最佳。在進一步的研究當中，他們將表現(xiàn)最佳的4種引物兩兩聯(lián)合，利用多重RT-LAMP法對SARS-CoV-2感染患者唾液標本不提純直接檢測，其檢測限達到了1.5 copy/μL的病毒載量。臨床結果表明該方法與標準RT-PCR方法總體靈敏度與特異度相當。在這項研究中他們成功解決了RNA提純問題，一定程度上縮短了檢測周期(各種LAMP為基礎的SARS-CoV-2檢測方法匯總見表1)。NAGURA-IKEDA等[41]在自行采集的唾液中，對SARS-CoV-2的6項分子診斷試驗和一項快速抗原試驗的臨床表現(xiàn)進行評估的實驗中證明RT-LAMP在臨床中應用具有足夠的靈敏度與特異度(已上市產品試劑盒列舉見表2)。

表1 以LAMP為基礎的SARS-CoV-2核酸檢測方法總結

表2 已獲批的基于LAMP的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒

續(xù)表2 已獲批的基于LAMP的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒

4 總結與展望

SARS-CoV-2感染的爆發(fā)給全球社會經濟帶來了巨大的災難，也導致生命科學等領域的爆發(fā)式發(fā)展，尤其在分子診斷領域。SARS-CoV-2變異毒株的不斷出現(xiàn)是全球分子診斷領域所共同面臨的一項巨大挑戰(zhàn)，RT-LAMP作為一種新型檢測技術在SARS-CoV-2檢測方面正表現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢[42-44]。LAMP的不斷改進與完善使其逐漸克服了之前的瓶頸，例如引物組設計、標本處理以及可視化等問題。而在ZHU等[40]的研究當中，利用多重RT-LAMP與納米顆粒側流生物傳感器相結合的方法，成功解決了檢測結果顯色等問題，顯著降低了外部環(huán)境因素的干擾。

與傳統(tǒng)RT-PCR相比，LAMP雖然不能定量，但卻表現(xiàn)出了更高的靈敏度與特異度。更重要的是，LAMP對SARS-CoV-2的檢測只需幾十甚至幾分鐘就能夠簡單通過肉眼對結果進行識別。這在SARS-CoV-2大流行期間對SARS-CoV-2感染疑似病例進行大規(guī)模篩查至關重要。以LAMP為基礎的聯(lián)合檢測技術有望取代傳統(tǒng)的RT-PCR技術，成為一種對SARS-CoV-2檢測更加快速、簡便且具有明顯成本-效益的方法。