呼吸道病原體檢測平臺應(yīng)用進展*

周承勃森，賈 紅 綜述，鞠長燕 審校

1.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，四川瀘州 646000；2.廣東省深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518000

呼吸道感染(RTIs)是臨床感染性疾病的主要死因[1-2]。呼吸道感染在2019年世界常見死亡原因中排名第四，造成了全球超過290萬人的死亡[3-4]。近年來，呼吸道感染新發(fā)病原體不斷出現(xiàn)，從嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)、甲型流感病毒 H7N9 亞型，到嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，新型呼吸道感染病原體給公共衛(wèi)生防控帶來嚴峻挑戰(zhàn)的同時，也給社會造成了巨大的經(jīng)濟損失[5-7]。

了解呼吸道感染的病原學，并對病原體進行早期、快速、準確的篩查對呼吸道感染性疾病的控制至關(guān)重要[8]。由于傳統(tǒng)的檢驗方法在進行呼吸道病原體檢測時檢測速度慢(2～5 d)、通量低，以及在面對呼吸道未知微生物時存在局限性，高通量的檢驗方法得以發(fā)展[9-10]。有研究表明，呼吸道感染高通量檢測技術(shù)不僅能實現(xiàn)快速檢測，還可以顯著減少抗菌藥物的使用，具有很高的社會效益和經(jīng)濟效益[10-11]。近年來，呼吸道病原體檢測技術(shù)不斷創(chuàng)新，新的呼吸道病原體檢驗平臺不斷推出[12-13]。如何選用呼吸道病原體檢測平臺以實現(xiàn)成本-效益的最大化，成為專業(yè)人員關(guān)注的問題。本文對目前常見呼吸道病原體檢測的商品化平臺進行綜述，意在了解目前高通量呼吸道病原體檢測平臺的性能，以期為呼吸道病原體檢測平臺的臨床實踐提供參考。

1 基于傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測技術(shù)的檢測平臺

1.1基于免疫法的檢測平臺 免疫化學檢測法是利用免疫學抗原抗體反應(yīng)，以熒光素、酶、放射性核素或電子致密物質(zhì)等對抗原或抗體加以標記，對某些蛋白質(zhì)(抗原或抗體)進行檢測的技術(shù)[14]。ArcDia公司的mariPOC是一種基于免疫化學檢測法的雙光子熒光激發(fā)檢測系統(tǒng)，其原理是待檢抗原先被特異性抗體捕獲，帶有熒光標記的抗體再與其結(jié)合，進而實現(xiàn)病原體檢測[15]。mariPOC具有完全自動、可現(xiàn)場使用、約20 min自動報告的特點[15]。其呼吸道面板(respi)可檢測來自上、下呼吸道的9種臨床相關(guān)病原體[15]。GUNELL等[16]聯(lián)合芬蘭14個實驗室共進行了22 485次檢測，證明了mariPOC?respi在日常監(jiān)測中的有效性。

1.2基于多重PCR技術(shù)的檢測平臺 多重PCR技術(shù)可以同時檢測同一標本中的呼吸道臨床常見病原體。其工作原理主要是應(yīng)用多重引物，先針對不同的病原體核酸進行特異性擴增，再根據(jù)不同病原體的擴增產(chǎn)物判斷感染何種病原體[17]。市場上有多種基于多重PCR的呼吸道病原體檢測試劑，可同時檢測數(shù)種呼吸道病原體，適用于絕大多數(shù)型號的PCR儀，但其檢測通量不高。以下是兩種試劑與儀器配套的一體化PCR檢測平臺，其檢測通量較高，可同時檢測十幾種呼吸道病原體。

1.2.1多重熒光PCR平臺 多重熒光PCR技術(shù)是在多重PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，加入了幾種不同熒光基團，通過檢測不同通道的熒光，實現(xiàn)對多個靶標的實時檢測[17]。Unyvero是由Curetis 公司開發(fā)的一種基于多重熒光PCR的檢測系統(tǒng)，可對下呼吸道多重病原體與耐藥基因進行檢測和鑒定[18]，該系統(tǒng)使用單個檢測陣列在多孔陣列膜上雜交實現(xiàn)定性擴增檢測[19]。其配套面板包括Unyvero P50/P55。Unyvero P50可檢測17種肺炎病原體及耐藥基因[20]。Unyvero P55肺炎面板可檢測21種呼吸道病原體以及17種耐藥基因[21]。該系統(tǒng)自動化，檢測全程大約需要5 h[20-21]。PAPAN等[20]報道，與培養(yǎng)相比，Unyvero P50的總體特異性較高，對于耐藥基因的檢測，75%與抗生素圖譜一致。

1.2.2多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(多重RT-PCR)結(jié)合毛細管電泳平臺 多重RT-PCR結(jié)合毛細管電泳，即在多重RT-PCR的產(chǎn)物分析過程中，以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間分配行為差異實現(xiàn)分離的分析方法[22]。Beckman Coulter公司開發(fā)的GeXP是一種多重RT-PCR結(jié)合自動毛細管電泳的商品化系統(tǒng)。使用GeXP，能夠在一根試管中對最多達30個基因的表達譜進行差異評估，其周轉(zhuǎn)時間低于5 h[23]，GeXP檢測成本較低，每次綜合檢測的成本約為8美元[24]。LUO等[25]的研究表明GeXP檢測中各病毒檢測的靈敏度與近年來報道的實時PCR方法相似。

1.3基于多重連接探針擴增(MLPA)技術(shù)的檢測平臺 MLPA是一種可以同時定量檢測多個靶基因的方法。MLPA 技術(shù)的基本原理是通過合理設(shè)計針對靶序列片段的2個特異探針，結(jié)合高度特異的雜交反應(yīng)，并對雜交后的連接產(chǎn)物進行 PCR 擴增和毛細管電泳，最后比較擴增片段長度或判定擴增片段的有無，實現(xiàn)對未知靶序列的鑒定[26]。QIAGEN公司的RespiFinder 是一種基于MLPA技術(shù)的多參數(shù)測試面板，它通過多重連接探針擴增和電泳分析，通過對每個探針根據(jù)其特定長度進行識別，完成病原體檢測[27]。RespiFinder Smart 面板可以同時分析15例患者標本，區(qū)分22種病原體，其運行時間低于6 h[28]。REIJAN等[27]的研究表明與細胞培養(yǎng)結(jié)果相比，RespiFinder檢測的特異度和靈敏度均高于92%。多項研究結(jié)果表明，該方法的靈敏度與單倍實時RT-PCR相當，人工操作時間比RT-PCR減少了一半以上[27-29]。

1.4基于傳統(tǒng)檢測技術(shù)的呼吸道病原體檢測平臺性能對比 基于傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測技術(shù)的商品化平臺大大擴展了檢測的通量，并縮短了檢測的時間，詳見表1。在基于傳統(tǒng)呼吸道檢測技術(shù)的檢測平臺中，免疫法的mariPOC檢測時間最短，主要用于呼吸道常見病原體的現(xiàn)場檢測?；诙嘀豍CR技術(shù)的Unyvero，可實現(xiàn)對下呼吸道病原體的檢測，特別的是，它還可用于下呼吸道病原體耐藥基因的檢測。

表1 基于傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測技術(shù)的檢測平臺的特性

2 基于生物芯片技術(shù)的檢測平臺

2.1液相懸浮芯片技術(shù)的檢測平臺 液相懸浮芯片技術(shù)也稱微球體懸浮芯片技術(shù)(SAT)，即通過在不同編碼的微球上進行抗原抗體、酶底物、配體受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，再通過不同的激光分別對微球編碼和報告熒光進行定性和定量檢測，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)、核酸等多種生物大分子的多重檢測，通過微球的分類標記，可實現(xiàn)一次對標本中多達100個不同的目標進行檢測[30-31]。Thermo Fisher公司的Luminex系統(tǒng)采用SAT技術(shù)。其配套檢測試劑盒包括xTAG RVP、NxTAG RPP。xTAG RVP適用于48個樣品，可同時檢測18種常見呼吸道病毒，檢測周期為5 h；NxTAG RPP適用于96個樣品，可同時檢測21種呼吸道病原體，檢測周期小于4 h[32]。目前，市售的懸浮陣列試劑盒成本較低[33]。HANSON等[34]的研究表明Luminex系統(tǒng)靈敏度高，是ELISA靈敏度的10～100倍，重復(fù)性好，可達90%以上。

2.2微流控基因芯片技術(shù)的檢測平臺 微流控基因芯片技術(shù)是微流控系統(tǒng)將不同實驗室系統(tǒng)微縮在玻璃或者塑料機上，在微米級的尺度上構(gòu)建液流通道、核酸提取池、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增池、雜交池等部件，整合了標本處理、反應(yīng)、檢測的全部流程，從而實現(xiàn)高通量檢測[35]。微流控基因芯片技術(shù)的微型化、高靈敏度、高通量以及低檢測時間等技術(shù)優(yōu)勢，使其在生物醫(yī)學研究中應(yīng)用廣泛[35]。

2.2.1FilmArray Bio Fire公司的FilmArray是一套基于微流控技術(shù)的商品化系統(tǒng)。FilmArray擁有的呼吸道檢測面板包括BioFire?RP、BioFire?RP2、BioFire?Pneumonia面板[36]。其中，RP面板可靶向19種病原體；RP2面板可靶向21種病原體；Pneumonia 面板可靶向32種病原體[36]。手工操作只需2 min，大約1 h即可獲得結(jié)果[36]。FilmArray單次檢測價格約為200美元，F(xiàn)ilmArray經(jīng)過FDA認證，大量研究表明其對多數(shù)病原體的靈敏度和特異度高達95%以上[37-38]。

2.2.2GenMark GNMK公司的GenMark 同樣是基于微流控的商品化系統(tǒng)，目前已被Roche公司收購。與傳統(tǒng)微流控設(shè)備不同的是，其病原體檢測采用二茂鐵標記的寡核苷酸探針，它通過介質(zhì)上電潤濕的方式改變阻抗，從而對病原體進行檢測[39]。GenMark系統(tǒng)單次最多檢測26個標本[40-41]。其ePlex RP面板可檢測17種呼吸道病原體，每次分析的分析時間小于2 h，單次檢測成本約90美元[39]。一項多中心臨床試驗，使用BioFire RP面板作為比較方法，評估ePlex RP Panel檢測性能，ePlex RP和BioFire RP面板對所有目標的總體一致性超過95%[42]。

2.2.3QuantStudioTM7 Flex Thermo Fisher公司的QuantStudioTM7 Flex系統(tǒng)采用集成的Taqman@(TAC)低密度微流控卡作為面板，最多可同時進行384個個體的實時PCR反應(yīng)，每個微流控卡最多可檢測8個標本，每個標本最多可同時進行42種病原體的檢測[43]。在面板更新的情況下，TAC可根據(jù)研究目的修改引物/探針組，且不需要重新驗證整個面板[43]。LIU等[44]的研究中表明，TAC的靈敏度和特異度均較高。

2.3基于生物芯片技術(shù)的檢測平臺性能對比 基于生物芯片技術(shù)的呼吸道檢測平臺相較于基于傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測技術(shù)的平臺具有更高的準確性和更快的檢測時間，詳見表2。其中，值得一提的是基于微流控基因芯片的QuantStudioTM7 Flex，其Taqman?(TAC)呼吸道病原體檢測面板可在無需驗證面板的情況下，根據(jù)研究目的修改探針組，最多可實現(xiàn)42種病原體的檢測。

表2 基于生物芯片的呼吸道檢測平臺的特性

3 二代測序技術(shù)平臺

二代測序技術(shù)是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術(shù)，二代測序通過在DNA復(fù)制過程中(RNA需反轉(zhuǎn)錄為cDNA)，捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記來確定目標序列[45]。由于在二代測序中，隨著讀長增長，基因簇復(fù)制的協(xié)同性降低，測序質(zhì)量下降，因此，二代測序具有通量高但讀長短的特點[46]。

3.1二代測序平臺分類

3.1.1焦磷酸測序平臺 焦磷酸測序，即在DNA聚合反應(yīng)中釋放焦磷酸(PPi)，并將焦磷酸用作特定堿基摻入的指示物，依次添加和去除4個堿基，通過檢測由發(fā)光的酶級聯(lián)釋放的焦磷酸鹽完成測序[47]。QIAGEN公司的 PyroMark采用焦磷酸測序法，Roche公司的Roche 454 在此基礎(chǔ)上采用了一種“水包油”的擴增方法，即在擴增時使用了包含160多萬個光纖孔的平板，其中，每個孔是一個獨立的PCR體系，所有的DNA模板都被鏈接在孔中水油包被的一個磁珠上[48]。焦磷酸測序開拓了二代測序，但有其局限性：均聚物測序不準確，添加超過5個相同的核苷酸不能有效檢測，其成本也相對較高[48]。目前，焦磷酸測序已經(jīng)被淘汰[48]。

3.1.2氫離子測序平臺 氫離子測序即克隆乳液中單個核糖核酸，然后將其放置在一個包含單個pH傳感器矩陣的半導(dǎo)體芯片上，當DNA克隆通過合成進行測序時，局部pH值的變化可確定測序的核苷酸[48]。Thermo Fisher 公司的Ion Torrent平臺，采用氫離子測序。在應(yīng)用中，這項技術(shù)檢測速度快，可以實時測序，而且成本低[49-50]。然而，有研究表明，該技術(shù)均聚物測序容易出錯，因為在一個循環(huán)中重復(fù)使相應(yīng)數(shù)量的氫離子釋放，導(dǎo)致出現(xiàn)更高比例的電子信號[49-50]。

3.1.3邊合成邊測序平臺 邊合成邊測序采用橋式擴增策略，即通過將單個DNA分子附著在流動細胞上，然后將其局部擴增成克隆簇；在接下來的測序和合成過程中，它構(gòu)建互補DNA，采用熒光標記核苷酸的光學讀出，然后確定其堿基身份(A，T，C，G)[51]。在每個測序周期中，4種核苷酸之間的自然競爭減少了與焦磷酸測序相比的固有偏差。因此，均聚物的測序錯誤被這種技術(shù)克服[52-53]。Illumina公司開發(fā)了這種方法，約63%的測序工作是在該測序平臺上進行的，此外，Illumina在所有測序儀中擁有最高的通量[54]。

3.1.4雜交與連接測序平臺 雜交與連接測序法利用DNA連接酶來連接DNA序列中給定位置的核苷酸，通過已知序列對未知的目標DNA序列進行堿基配對和進行測序[55]。閱讀長度是該方法的一個主要限制[56]。CG公司的Complete Genomics采用連接法測序，后期被華大基因收購。特別的是，Complete Genomics在構(gòu)建測序文庫時基因片段的兩端加了接頭，形成環(huán)狀DNA 模板。其拷貝序列采用類似滾環(huán)的擴增方式，其單克隆球狀體也被稱為DNA 納米球，利用錨定序列與堿基單鏈熒光探針混合物在連接酶作用下連接獲得DNA 序列信息。該方法是分段進行的，擁有較高的容錯能力，后期的拼接也較容易[56]。

3.2基于二代測序技術(shù)的呼吸道檢測平臺性能對比 二代測序技術(shù)自焦磷酸測序以來不斷發(fā)展，目前已成為臨床常規(guī)病原學檢測技術(shù)的重要輔助手段，其檢測平臺特性詳見表3。其中，采用邊合成邊測序技術(shù)的Illumina平臺占據(jù)了大量市場[54]。我國的華大基因在收購雜交與連接測序平臺Complete Genomics后，也推出了國產(chǎn)的二代測序儀。

表3 基于二代測序技術(shù)的呼吸道檢測平臺的特性

3.3二代測序技術(shù)在呼吸道病原體檢測中的應(yīng)用 (1)病原體檢測。MIAO等[57]在比較二代測序技術(shù)與培養(yǎng)對病原菌診斷效果的同時，評估抗生素暴露對檢出率的影響，結(jié)果表明，二代測序技術(shù)的靈敏性優(yōu)于培養(yǎng)，二代測序技術(shù)具有較高的病原菌識別靈敏性，且不受先前接觸抗生素的影響，因此成為一種有前景的傳染病檢測技術(shù)。LI等[58]的研究表明，二代測序技術(shù)可提供全基因組序列，幫助確定病毒亞型和血清型。(2)多重耐藥基因檢測。QUAN等[59]利用二代測序技術(shù)開發(fā)了一種靶向測序方法，這種方法快速、廉價、多路復(fù)用能力強，而且足夠靈活，可以靶向任何感興趣的序列，并且可檢測患者標本中抗菌藥物的多重耐藥基因。SAHOO等[60]開發(fā)了一種基于擴增子的高通量測序策略，與現(xiàn)有的耐藥突變基因型檢測方法相比，該方法對微小變異體的檢測更加靈敏，具有更高的多路復(fù)用能力。(3)傳染病防治。德國一名患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征癥狀，使用PCR和分離培養(yǎng)方法檢測多種病原體均為陰性，F(xiàn)ISCHER等[61]通過二代測序技術(shù)在 50 h 內(nèi)快速確定了致病病原體是鸚鵡熱衣原體，隨后根據(jù)基因序列設(shè)計引物，并使用 PCR 驗證了檢測結(jié)果。在2019年末武漢SARS-CoV-2疫情中，研究者們通過二代測序技術(shù)實現(xiàn)了對病原體的快速鑒定及病毒全基因組序列的獲取，并通過此病毒的特有基因序列，設(shè)計RT-PCR引物，生產(chǎn)了用于感染者病原學診斷的試劑盒[62]。

二代測序技術(shù)的缺陷在于：(1)實驗結(jié)果難以解釋檢出的病原體為背景微生物還是病原微生物[63]。(2)目前進行二代測序技術(shù)檢測的工作流程高度個體化，不同的操作流程僅適用于特定的感染類型或標本類型；由于工作流程缺乏方法標準化和驗證，容易造成人為污染，最終導(dǎo)致結(jié)果的不確定[64]。(3)中國單次標本的成本是3 000元人民幣(約合400美元)，高于任何單一的通用方法[57]。

4 結(jié) 語

目前，對于醫(yī)療機構(gòu)，特別是基層醫(yī)療機構(gòu)而言，因資金不足、樣本量太大不能進行檢測，或因檢測時間、檢測結(jié)果不能滿足臨床需求的現(xiàn)象仍普遍存在[65]。未來，隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，呼吸道疾病病原體核酸檢測技術(shù)將朝著高通量、快速、自動化、低成本的方向發(fā)展。本文對常見的呼吸道病原體檢測平臺進行綜述，將有助于臨床醫(yī)師以及研究人員結(jié)合專業(yè)知識，合理選用呼吸道病原體的診斷方法，以實現(xiàn)成本-效益的最大化。