濕阻中焦動物模型及其評價指標(biāo)的建立研究進(jìn)展

謝亞婷，葉先文，張金蓮*，鄧亞羚，萬 全，劉敏敏，劉 穎，張 濤，黃 敏，席嘉禾，陳宇帆

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.贛州市人民醫(yī)院患者服務(wù)中心，江西 贛州 341000)

濕阻中焦證，其病機(jī)為濕邪阻滯脾胃，水液運(yùn)化失常，又稱濕困脾胃證，是中醫(yī)常見的一類病癥，具有發(fā)病率高、病程長的特點(diǎn)。臨床主要表現(xiàn)為脘腹脹滿，頭重身肢困倦，口黏淡，身困乏力，不思飲食，苔厚膩，脈濡或滑[1]。濕阻中焦證的現(xiàn)代病因尚未明確，目前造模法多以中醫(yī)病因作為出發(fā)點(diǎn)，模擬中醫(yī)發(fā)病機(jī)制，然此法與自然患病有差異，且造模復(fù)雜、耗費(fèi)時間長、動物死亡率高。但隨著濕阻中焦患病人數(shù)的不斷上升，臨床研究的不斷深入，對動物模型復(fù)制及模型的評價指標(biāo)有了更高要求，因此復(fù)制出穩(wěn)定的模型、制定顯著性好的評價指標(biāo)勢在必行。本研究對已有的濕阻中焦模型的造模方法與模型評價指標(biāo)進(jìn)行總結(jié)，以期為濕阻中焦證的現(xiàn)代機(jī)制、臨床研究提供更多參考。

1 濕阻中焦動物模型的建立

濕阻中焦證實(shí)驗(yàn)動物模型一般根據(jù)研究目的選用不同品系的大鼠。造模方法以濕阻中焦的中醫(yī)病因?yàn)榛A(chǔ)，將內(nèi)濕、外濕等作為誘導(dǎo)因素，從單純外濕和復(fù)合因素兩個方向入手，復(fù)合因素造模主要包括飲食不節(jié)、情志不遂、正氣不足等。

1.1 單純外濕造模方法

《素問·陰陽應(yīng)象大論》言：“地之濕氣，感則害人皮肉筋脈”[2]，提出濕阻中焦證的發(fā)病與外界環(huán)境有著密不可分的關(guān)系。故此類模型通過改變環(huán)境的潮濕度，以營造高濕的生存環(huán)境，久處后濕氣入侵中焦。濕性重濁致脾胃運(yùn)化不足，水液代謝失衡，形成濕阻。張六通等[3]通過控制造模箱的條件進(jìn)行造模，選用健康雄性wistar大鼠，控制造模箱內(nèi)相對濕度(RH)>90%，溫度(T)18～25 ℃，鼠籠底使用濕墊料，每天觀察大鼠精神、活動、關(guān)節(jié)、大小便等狀況，造模108天，成功復(fù)制出濕阻中焦模型。此法通過改變外部環(huán)境濕度的原理與中醫(yī)“氣候潮濕、涉水淋雨、居處卑濕及長期水中作業(yè)”等易招致濕邪為患的觀點(diǎn)相符。

1.2 復(fù)合因素造模方法

《醫(yī)碥·五行生克說》云：“飲食入胃，脾為運(yùn)行其精英之氣，雖曰周部諸臟，實(shí)先上輸于肺，肺先受其益，是為脾土生肺金，肺受脾之益，則氣愈旺，化水下降，澤及百體?！敝嗅t(yī)認(rèn)為的中焦多指脾胃，脾主運(yùn)化水濕，胃主受納、腐熟水谷。當(dāng)飲食不節(jié)、饑飽失常時，脾胃運(yùn)化功能受阻，濕不能運(yùn)化，故停留在脾胃形成內(nèi)濕；此外情志不遂也與內(nèi)濕有聯(lián)系，當(dāng)睡眠生物鐘打亂，情志難抒時，機(jī)體氣機(jī)受阻致氣不能運(yùn)濕，濕便停留在機(jī)體各處。因此復(fù)合因素造模法，多選用SD級大鼠、Wistar大鼠，通過控制飲食、損傷正氣、擾亂生物鐘等方法在最大程度上模擬中醫(yī)發(fā)病機(jī)理，提高模型臨床表現(xiàn)的相似度。見表1。

表1 復(fù)合因素造模操作方法

1.3 不同濕阻中焦動物模型特點(diǎn)比較

目前，濕阻中焦動物模型分單純外濕造模法和復(fù)合因素造模法兩種，研究動物多選用SD大鼠和Wistar大鼠，通過對已知的文獻(xiàn)進(jìn)行查詢，發(fā)現(xiàn)單純外濕造模法操作簡單、易上手，但其存在造模時間長等不足；復(fù)合因素造模法選擇多種相關(guān)致病因素，與中醫(yī)病因相近，但其操作復(fù)雜，對條件要求高，動物死亡率高。見表2。

表2 模型特點(diǎn)比較

2 濕阻中焦模型檢測指標(biāo)

2.1 一般體征指標(biāo)

濕為重濁、黏滯之邪，易損害機(jī)體陽氣，阻遏氣機(jī)。故濕阻中焦證會導(dǎo)致脾胃氣機(jī)升降失常，納運(yùn)失司，出現(xiàn)脘腹脹滿、腹瀉、精神不振等癥狀。因此濕阻中焦動物模型完成后，其飲食量、飲水量、體脂量等一般檢測指標(biāo)將會發(fā)生變化[11-12]。見表3。

表3 一般檢測指標(biāo)

2.2 生化指標(biāo)

目前濕阻中焦證的現(xiàn)代機(jī)制尚未明確，但為了更深入地探討濕阻中焦證的機(jī)制及模型的判斷指標(biāo)。本研究總結(jié)了近年來濕阻中焦模型的相關(guān)生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其主要表現(xiàn)在胃腸功能、水液代謝、免疫系統(tǒng)、黏膜屏障、炎癥表達(dá)等方面[13]。

2.2.1 胃腸功能指標(biāo) “濕勝則濡泄”，濕阻中焦證最常見的臨床表現(xiàn)為胃腸功能障礙，如脘腹痞脹、不欲飲食、腹瀉、大便不成形等，這些癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上胃動力不足、慢性胃炎等疾病的描述相似，故在模型評價中常選用胃腸道檢測指標(biāo)。見表4。

表4 胃腸道檢測指標(biāo)

2.2.2 水液代謝指標(biāo) 脾胃主水液運(yùn)化，濕邪入侵阻滯脾胃，致其水液運(yùn)化失常，引起一系列水液代謝病理變化，如尿潴留、水腫等。通過文獻(xiàn)整理，發(fā)現(xiàn)濕阻中焦證可影響尿液代謝、水糖代謝、水鹽代謝、胃腸腸道水通道蛋白、離子泵等。見表5。

2.2.3 免疫反應(yīng)指標(biāo) “正氣內(nèi)存，邪不可干”，中醫(yī)認(rèn)為疾病的發(fā)生與正氣和邪氣之間的斗爭有密切的關(guān)系。經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)正氣作用與臨床醫(yī)學(xué)上免疫作用相類似，其對疾病的發(fā)生起著決定性的作用。當(dāng)濕阻中焦證發(fā)生時，機(jī)體多種穩(wěn)態(tài)水平被打破，白細(xì)胞介素2、腫瘤壞死因子等免疫功能指標(biāo)發(fā)生改變，故可以將此作為判斷模型成功與否的指標(biāo)之一，提高模型準(zhǔn)確性。見表6。

表5 水液代謝檢測指標(biāo)

表6 免疫功能檢測指標(biāo)

2.2.4 炎癥因子表達(dá) 濕阻證與脾胃腸關(guān)系密切，濕氣的長期存在，會導(dǎo)致胃腸動力不足，引起炎癥發(fā)生，引起相關(guān)炎癥因子水平的升高，與臨床慢性胃炎、腸炎臨床癥狀相似。見表7。

表7 炎癥檢測指標(biāo)

2.2.5 黏膜保護(hù)屏障指標(biāo) 濕困脾胃，運(yùn)化受阻，尤其出現(xiàn)腹瀉、便溏等癥狀，由該癥狀可推測病位在胃、大小腸等消化系統(tǒng)，而腹瀉、便溏的發(fā)生在臨床上與胃黏膜、腸黏膜保護(hù)屏障，如機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障等受損有一定關(guān)系，故在造模后常會選擇黏膜保護(hù)檢測指標(biāo)作為判斷的標(biāo)準(zhǔn)之一。見表8。

表8 黏膜保護(hù)檢測指標(biāo)

2.2.6 其他指標(biāo) 除上述外，近幾年研究還發(fā)現(xiàn)，濕阻中焦模型還會出現(xiàn)氧化應(yīng)激失衡、能量供需失衡、代謝組學(xué)異常等。據(jù)推測這些異常與濕阻中焦動物模型細(xì)胞的氧化代謝有關(guān)，出現(xiàn)氧化能力減弱、自由基減弱、代謝率減慢等。見表9和圖1。

表9 其他檢測指標(biāo)

注：淺藍(lán)六邊形表示機(jī)制分類；淺黃色菱形表示作用途徑；淺紅色橢圓形表示造模后指標(biāo)上調(diào)；淺綠色三角形表示造模后指標(biāo)下調(diào)。

3 討論

動物模型的準(zhǔn)確建立是進(jìn)行濕阻中焦證研究的基礎(chǔ)之一，實(shí)驗(yàn)動物的正確選擇對實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的基因與人相似，且大鼠成本低、生命周期短，較小鼠造模成活率高，故目前多選用大鼠作為濕阻中焦模型的常用動物[41]。大鼠品系選擇上，Wistar大鼠種系純、性格溫順，且極易受外在環(huán)境因素如溫度、濕度、噪聲等影響，較SD大鼠更為適合用來建立濕阻中焦模型[42]。

濕阻中焦證是一種致病因素與發(fā)病機(jī)制都十分復(fù)雜的疾病，在目前的臨床研究中對其發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵點(diǎn)并未有明確的發(fā)現(xiàn)，因此難以用現(xiàn)代臨床技術(shù)讓建模過程簡單化，因而使得理想動物模型的建立變得非常困難，只能依賴于中醫(yī)病機(jī)病因模擬出與濕阻中焦證臨床癥狀相類似的模型。中醫(yī)認(rèn)為濕阻中焦證由久居濕地，濕侵入體或脾胃虛弱，運(yùn)化失常，水液代謝受阻，致濕阻脾胃。濕包括外濕和內(nèi)濕，故常用的造模方法有兩種：①純外濕造模法，如增加環(huán)境、墊料濕度等；②復(fù)合因素造模法，將環(huán)境外濕、脾虛內(nèi)濕、情志等多因素結(jié)合。單純外濕造模法是最早提出的一類造模法，但該法耗時長，且建立的動物模型多存在因素單一性和過程不穩(wěn)定性等特點(diǎn)；而多因素造模法建立的動物模型較單純外濕造模法動物模型更穩(wěn)定，且更符合濕阻中焦證的病理特點(diǎn)，故大多學(xué)者偏向選擇多因素造模法。

模型評價指標(biāo)的合理與否，直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。前人多以形體、飲水量、飲食量、糞便、毛發(fā)等一般體征為主，胃腸道、炎癥因子等生化指標(biāo)為輔。體征在中醫(yī)辨證中起著決定性的作用，然而生長體態(tài)、糞便性狀、精神狀態(tài)、被毛色澤、活動狀態(tài)等屬于宏觀體征，因此僅憑借宏觀指標(biāo)作為主要判斷使造模的成功性過多依賴于主觀性判斷，無法直接量化模型質(zhì)量，從而導(dǎo)致結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性。故有必要通過中醫(yī)病理機(jī)制與現(xiàn)代臨床分析技術(shù)相結(jié)合，建立模型臨床評價指標(biāo)體系，深入研究濕阻中焦證對水液代謝、炎癥反應(yīng)、代謝組學(xué)等產(chǎn)生的影響，為模型評價指標(biāo)提供有力支撐；借助基因組學(xué)、分子生物學(xué)、芯片等學(xué)科的新技術(shù)與新方法，以中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，從宏觀、微觀的角度對濕阻中焦模型和評價指標(biāo)進(jìn)行多方面、多角度的客觀性考察，細(xì)化評價標(biāo)準(zhǔn)，使?jié)褡柚薪鼓Ｐ偷脑u價指標(biāo)更具準(zhǔn)確性、科學(xué)性。探索建立與濕阻中焦患者臨床體征和生化檢測指標(biāo)高度吻合的動物模型，是解決目前建模操作方法復(fù)雜、模型機(jī)理不清，提高模型的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性問題的關(guān)鍵。