基于HIF-1α/VEGF通路中醫(yī)藥抑制肝癌血管生成的研究進展

宋征福，李澤鵬

(柳州市中醫(yī)醫(yī)院(柳州市壯醫(yī)醫(yī)院) 消化內科，廣西 柳州 545000)

據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，2020年中國肝癌發(fā)病人數(shù)達41萬人，死亡人數(shù)達39萬人，位于惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第5位和第2位，新發(fā)病例和死亡病例均占全球肝癌病例和死亡病例的45%以上，嚴重威脅我國人民健康[1]。目前，臨床治療肝癌常用治療方法有外科手術(移植術、切除術)、局部治療(RFA、TACE)和系統(tǒng)治療(主要是靶向治療及免疫治療)。肝癌早期治療以根治手術為主，肝移植術后5年生存率為60%～80%，10年生存率為50%，5年復發(fā)率仍有10%～15%，而肝切除術后5年生存率為35%～70%，其5年復發(fā)率最高達70%[2]。因肝癌患者臨床表現(xiàn)的多樣性及腫瘤的異質性，大部分患者確診時已進展至中晚期，根治性治療復發(fā)轉移的風險較高，而系統(tǒng)治療對晚期 HCC(Hepatocellular carcinoma，HCC)的總體響應率仍較低[3]。其中一個重要原因為HCC 作為一種高度血管化的實體腫瘤，血管生成在其發(fā)生發(fā)展和轉歸中發(fā)揮了重要作用，而腫瘤缺氧微環(huán)境是血管生成最重要的刺激因素，其中，缺氧誘導因子(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為響應缺氧應激的關鍵調控因子，可激活其下游靶基因——血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，二者在血管生成、促內皮細胞增殖、遷移和侵襲中起核心作用[4-5]。因此，本研究主要圍繞HIF-1α/VEGF通路及其在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用的基礎上，探討HIF-1α/VEGF分子與肝癌中醫(yī)證候，尤其是血瘀證的相關性，總結中藥干預HIF-1α/VEGF通路調控肝癌血管生成的研究進展，為臨床治療肝癌提供參考。

1 HIF-1α/VEGF通路

1.1 HIF-1α概述

HIF是對細胞缺氧進行調節(jié)的重要基因，其是由120kD的氧調節(jié)亞單位α(包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和91-94kD的結構亞單位β(包括HIF-1β和HIF-2β)構成的異源二聚體，其中，以HIF-1α最為重要，決定了HIF-1的活性[6]。α亞基因位于人體第 14 號染色體 q21-24，其 cDNA長3 720 bp，有826個氨基酸由其編碼。HIF-1α亞基所含有的氧依賴降解域(Oxygen-dependent degradation domain，ODDD)能抑制該分子在正常氧水平下的反式激活作用，調節(jié)α蛋白的穩(wěn)定性。缺氧(或低氧)時，脯氨酰羥化酶(Prolyl hydroxylases，PHD)表達量減少，使得HIF-α亞基的ODDD脯氨酸殘基羥化水平降低，減少了與腫瘤抑制蛋白pVHL(Von Hippel-Lindau protein，pVHL)的結合，泛素化降解途徑受到抑制，從而使得HIF-α亞基表達量上升，HIF-1α易位至細胞核內，與HIF-1β在核內結合形成異二聚體后，與 p300/CBP 進一步結合形成具有轉錄活性的HIF轉錄復合物，與靶點基因啟動子中的缺氧反應元件(Hypoxia response element，HRE)相結合而進行轉錄調控，如VEGF、IL-6、轉化生長因子-β (Transforming growth factor-β，TGF-β)、成纖維細胞生長因子-2(Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)、葡萄糖轉運蛋白1(Glucose transporter protein-1，GLUT1)、胰島素樣生長因子-II(Insulin-like growth factors II，IGF-II)、血小板源性生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、促紅細胞生長素(Erythro poietin，EPO)等基因，參與血管生成與葡萄糖代謝等過程[7]。

1.2 VEGF概述

VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、胎盤生長因子和內分泌腺源性VEGF[8]，其中，VEGF-A是目前研究發(fā)現(xiàn)的血管生成最強驅動因子，參與了包括肝癌在內的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，VEGF主要與跨膜受體結合誘導細胞內信號轉導，如酪氨酸激酶受體(VEGFR-1、VEGFR-2 和VEGFR-3)，其中，VEGFR-1和VEGFR-2表達于內皮細胞、廣泛的非內皮細胞和腫瘤細胞[9]。VEGF-A主要與VEGFR-2相結合來調節(jié)內皮細胞的遷移、增殖和募集等過程，對于促進血管生成非常重要，當細胞組織接受VEGF的刺激后，內皮細胞產生偽足并向頂端細胞延伸，此時，莖細胞則緊隨其后不斷增殖和延長，最終共同作用并成為新生血管的主干[10]。

盡管 VEGF 的誘導物種類豐富，但其啟動子的主要轉錄激活子僅有 HIF-1和 STAT3。HIF-1α除可以直接激活VEGF外，還能協(xié)同其他基因共同增強對VEGF表達的誘導作用。例如，單獨轉染Osx或HIF-1α可分別使VEGF啟動子活性增加3.6倍和3.3倍；當共轉染同等量的Osx和HIF-1α時，可協(xié)同作用使VEGF啟動子活性增強9.3倍[11]。此外，E2F7/8與HIF-1能形成轉錄復合物以刺激VEGFA啟動子活性[12]。

2 HIF-1α/VEGFA通路與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關

HIF-1α/VEGFA在HCC血管生成中發(fā)揮了重要調控作用，為肝癌細胞存活提供營養(yǎng)和氧氣。Wen Y等[13]研究表明，HIF-1α 活化能上調 VEGFA、TGF-β、EPO、FGF-2等下游血管新生相關基因的表達，并在體外人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)模擬血管形成實驗中促進HCC細胞毛細血管新生。HIF-1α表達水平在HCC腫瘤組織中明顯高于癌旁正常組織，且與臨床病理特征中血管侵犯、腫瘤大小及數(shù)目正性相關，還與患者不良預后，如總體存活、無病生存有關，而對于HIF-2α的表達與臨床病理及預后的關系仍存在爭議[14-15]。孫建英等[16]發(fā)現(xiàn)，肝癌組患者血清HIF-1α、VEGF表達水平明顯高于肝硬化組及慢性肝炎組，肝細胞癌變模型進一步證實，由正常肝細胞、肝細胞變性、癌前病變至癌變的惡性轉化過程中，HIF-1α及VEGF進行性增高表達。張庚等[17]在HBV感染型及非HBV感染型肝癌組織中觀察發(fā)現(xiàn)，HIF-1α及VEGF表達水平升高，且與腫瘤內微血管密度有關，表明其在肝細胞癌血管生成中發(fā)揮了重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、VEGFA與臨床病理特征，如血管侵犯、轉移等有關，且影響患者預后，二者表達越高預后越差，可用來評估患者短期療效，有望成為肝癌臨床治療的潛在靶點[18-20]。

3 HIF-1α/VEGF與肝癌中醫(yī)證候關系

中醫(yī)學根據(jù)“肝癌”臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“肝積”“黃疸”“積聚”“脅痛”“臌脹”“癥瘕”等范疇。根據(jù)古代醫(yī)家對其病因病機的論述，現(xiàn)代醫(yī)家結合自身臨床實踐認為[21]，邪毒內侵是原發(fā)性肝癌的病因病機的外在始動因素，正氣虧虛是內在核心驅動力，與肝、脾、腎等臟腑功能失調密切相關，其病機演變關鍵是肝失疏泄及脾失健運，導致氣血津液運行失調，氣滯、血瘀、濕熱、痰濁等凝結不化所成。由“陽化氣，陰成形”視角分析肝癌病因病機發(fā)現(xiàn)，陽虛寒凝、陰氣不化是肝癌中醫(yī)病理基礎及病機關鍵[22]。從腫瘤微環(huán)境角度分析，腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞進行了重新編程，是癌毒轉化的關鍵因素，并賦予腫瘤干細胞(CSCs)分化潛能和干性，CSCs使至虛之處的毒根深藏，腫瘤微環(huán)境中的能量代謝障礙及免疫抑制又多責之于脾虛[23]，而腫瘤微環(huán)境中乏氧狀態(tài)、血管生成、上皮間質轉化及細胞外基質等與中醫(yī)痰瘀密切相關[24-25]，痰瘀在肝癌發(fā)生發(fā)展及轉移復發(fā)中具有重要作用[26]。

研究表明，氣滯與血瘀是中晚期肝癌最常見的病性證素[27]，癌性疼痛常存在于肝癌患者中，尤其在中晚期階段，癌性疼痛與血瘀證存在相關性，且疼痛程度越高的患者其血瘀證候評分越高[28]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌疼痛患者血清HIF-1α及VEGF表達水平異常增高，且不同疼痛程度患者間，其血清含量存在顯著差異，兩者間存在明顯正相關關系[29-30]。因此，HIF-1α、VEGF與肝癌血瘀證是否存在一定相關性，可否作為中醫(yī)微觀辨證的分子基礎，為今后研究提供了一個新方向。VEGF與肝癌中醫(yī)證候相關性研究發(fā)現(xiàn)，包括氣滯血瘀證在內的常見證型與原發(fā)性肝癌患者外周血清VEGF之間存在顯著相關性[31-32]，可指導中醫(yī)辨證分型，而在氣虛血瘀肝癌模型中也存在VEGF高表達[33]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌血瘀證患者腫瘤組織 HIF-1α、VEGF 的陽性表達率明顯高于非血瘀證患者[34]，胃癌血瘀證患者組織中也存在VEGF陽性表達[35-36]，而在脾胃虛寒證患者血清中VEGF也比較明顯[37]。

綜上，VEGF依賴HIF-1α表達，二者正性相關，肝癌患者組織及血清中HIF-1α、VEGF存在差異性表達；肝癌疼痛程度與HIF-1α及VEGF表達水平密切相關，而疼痛與中醫(yī)血瘀證相關，VEGF則與肝癌(氣滯或氣虛)血瘀證型有一定相關性。因此，HIF-1α/VEGF或可作為肝癌血瘀證重要分子機制之一，為研究中醫(yī)活血化瘀法治療肝癌提供潛在靶點。

4 中藥靶向HIF-1α/VEGF通路治療肝癌機制研究

中醫(yī)藥全程介入及個體化診治肝癌，以扶正祛邪、調和陰陽為總則，在防治復發(fā)轉移、減毒增效及逆轉耐藥等方面[38-39]，具有多途徑、多靶點、協(xié)同作用的優(yōu)勢。目前，中醫(yī)藥治療腫瘤的策略逐漸轉向于重塑腫瘤微環(huán)境，如改善乏氧環(huán)境、抑制血管生成、調節(jié)炎癥反應、免疫抑制等[40]，進而達到防治腫瘤復發(fā)轉移的作用，其中，抑制血管生成即為重要機制之一。采用臨床數(shù)據(jù)挖掘技術，分析中醫(yī)藥治療肝癌規(guī)律發(fā)現(xiàn)，健脾益氣與活血化瘀是臨床較常用的治法[41-42]。結合網(wǎng)絡藥理學研究臨床經典名方及常用復方作用機制發(fā)現(xiàn)，可通過參與抗血管生成及調控炎癥反應等生物學行為治療肝癌，其中，調控HIF-1通路是眾多分子機制之一，而HIF-1α及VEGF作為HIF-1通路中的關鍵分子或可作為治療靶點[43-44]。

4.1 中藥單體或提取物

實驗研究表明，來源于中藥的單體成分或提取物可通過調節(jié)HIF-1α/VEGF通路抑制肝癌血管生成及侵襲轉移，目前研究主要集中于具有活血化瘀、清熱解毒作用的中藥。例如，姜黃素抑制低氧誘導的肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化，其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機制與下調HIF-1α蛋白水平有關[45]；姜黃素發(fā)揮抗肝癌H22細胞血管生成作用與其干預PI3K/AKT通路降低VEGF表達有關[46]。三七提取液抑制肝癌HepG2細胞增殖和血管內皮細胞侵襲遷移，其作用機制可能與抑制HIF-1α、VEGF、Ang-1及Ang-2表達有關[47]。大黃可下調HIF-1α、VEGF蛋白表達及HIF-1α、eIF4E、p70S6K1 mRNA表達水平而抑制炎癥反應[48]，而大黃素可能通過抑制HIF-1α mRNA表達，從而降低VEGF mRNA表達來抑制HepG2細胞新生血管形成[49]。穿心蓮內酯可通過誘導HIF-1α蛋白泛素化降解，降低其介導的VEGFA表達，繼而抑制肝癌生長[50]。槐耳多糖亦可作用于HIF-1α/VEGF信號通路，可抑制肝癌的腫瘤血管生成、侵襲和轉移并促進凋亡[51]。

4.2 中藥復方

目前，研究表明，具有健脾、活血、化瘀、解毒、散結作用的中藥復方可直接靶向調控HIF-1α/VEGF通路治療肝癌，主要通過減少乏氧狀態(tài)介導的血管生成，進而達到抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用，其也與減輕炎癥反應、抑制肝組織纖維化等有關。臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，由白術、茯苓、鱉甲、郁金、山慈菇等組成，可健脾除濕、活血散結的愈肝散結顆粒，能通過抑制晚期肝癌患者血清VEGF、HIF-1α表達，減少腫瘤血管生成而減緩腫瘤生長[52]；由黃芪、菝葜、黨參、白術、丹參、鱉甲等組成，主要為益氣健脾、祛瘀散結功效的扶正消瘤顆粒，可明顯改善肝癌TACE序貫RFA治療后患者生活質量，降低HIF-1α水平，下調VEGF表達，抑制腫瘤血管生成[53]。此外，基礎實驗研究表明，具有活血祛瘀、消腫散結等功效的復方紅豆杉膠囊，可降低Walker-256移植性肝癌大鼠腫瘤組織中HIF-1α、VEGF及PCNA陽性表達[54]；主要功效為清熱解毒、活血化瘀作用的癌毒清顆粒，遏制H22肝癌小鼠異位移植瘤的生長機制之一，即為通過下調缺氧微環(huán)境中血管生成促進因子VEGF、HIF-1α表達而遏制肝癌移植瘤微血管生成，且遏制程度和藥物劑量有關[55]。具有疏肝健脾益氣、活血化瘀散結作用的中藥復方，如軟肝散、疏肝健脾活血方、膈下逐瘀湯等，經肝纖維化模型研究發(fā)現(xiàn)，其可通過下調HIF-1α蛋白及VEGF mRNA表達，調控HIF-1α/VEGF信號通路抑制肝組織纖維化進程[56-58]。

5 結語與展望

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，預后較差，與復發(fā)轉移有一定關系。腫瘤缺氧微環(huán)境在腫瘤進展過程中起關鍵作用，其主要通過缺氧/HIF-1α驅動和VEGF過表達及其受體激活等機制促進腫瘤持續(xù)增殖、持續(xù)血管生成和局部侵襲、遠處轉移[59]?，F(xiàn)有大量證據(jù)表明，HIF-1α/VEGF通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，主要參與調節(jié)血管生成、血管侵犯、轉移等過程，與患者不良預后有一定關系。HIF-1α、VEGF與結直腸癌中醫(yī)血瘀證候相關，而有關HIF-1α及VEGF與肝癌中醫(yī)證候，特別是血瘀證候的研究較少，還需進一步探討。目前，以HIF-1α/VEGF為作用靶點的抗肝癌中藥研究主要以活血化瘀、清熱解毒等中藥單體或提取物為主，而中藥復方更能體現(xiàn)中醫(yī)的整體觀與辨證論治優(yōu)勢，尤其是益氣健脾與活血化瘀法配伍融合后，可下調HIF-1α/VEGF通路，具有抑制肝癌細胞增殖、遷移及血管生成的作用。而關于中藥調控HIF-1α/VEGF通路對腫瘤免疫炎癥微環(huán)境的影響，仍需進一步研究。