基于均勻設計法探討黃芪總皂苷-荷葉總生物堿防治高脂血癥的劑量配比

陳 健，彪雅寧，王 楊，高晶淼，步 潔，張一昕

(河北中醫(yī)學院 藥學院，河北 石家莊 050200)

高脂血癥為臨床常見疾病，我國成人血脂異常的總患病率達40.40%，高脂血癥是心血管疾病的主要發(fā)病原因[1-2]?，F(xiàn)代臨床治療高脂血癥的常用藥有他汀類、貝特類等，盡管治療效果較好，但因存在肝損傷、肌肉酸痛、橫紋肌溶解等副作用而應用受限。研究表明，中醫(yī)藥防治高脂血癥安全有效，且組分中藥具有明確的物質基礎及作用機制，是創(chuàng)制現(xiàn)代創(chuàng)新中藥的一種有效途徑[3]。

筆者認為脾虛痰濕為高脂血癥的重要病機，黃芪、荷葉合用具有補益脾氣、滲利水濕的功效，可作為防治高脂血癥的有效配伍。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪和荷葉中的主要化學成分黃芪總皂苷、荷葉總生物堿均有較好的降血脂、改善脂肪沉積作用[4-5]，但其最佳配伍劑量尚不明確。因此，本研究采用高脂飲食誘導高脂血癥大鼠模型，結合均勻設計法，探究黃芪總皂苷-荷葉總生物堿改善脂質代謝、調(diào)節(jié)血脂等不同作用的最佳劑量配比，以探討中藥有效組分組合的劑量配比規(guī)律。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量155～175 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2 藥物

黃芪總皂苷(純度70%，批號：K20495)購自西安開來生物科技有限公司；荷葉總生物堿(純度60%，批號：20200921)購自西安中輝欣茂進出口有限公司。血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司，批號：Z10950029)，實驗時按要求配制成相應濃度的藥液。

1.3 試劑

甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒(批號分別為：201102、201001、210201、201102、201001、201201)均購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 模型制備

采用喂養(yǎng)高脂飲食的方法制備高脂血癥模型，除正常組喂養(yǎng)普通飼料外，其余各組大鼠均喂養(yǎng)高脂飼料6周。高脂飼料(78.8%基礎飼料+15%豬油+1%膽固醇+5%蔗糖+0.2%膽酸鈉)購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司(批號：2020123104)。

2.2 均勻設計實驗方案

選用U7(74)均勻設計表，將黃芪總皂苷和荷葉總生物堿分別作為考察因素，分別用X1、X2表示，每個因子各取7個水平，根據(jù)文獻[6-8]確定黃芪總皂苷和荷葉總生物堿的劑量范圍分別為34～166 mg/kg、20～80 mg/kg，根據(jù)均勻設計表進行劑量配比設計，得到均勻設計實驗方案。見表1。

表1 均勻設計篩選實驗組方給藥方案

2.3 動物分組與給藥

2.3.1 均勻設計篩選實驗 SD雄性大鼠72只，自造模起，按體質量分層原則隨機分為正常組、模型組、均勻設計1～7組，每組8只。造模2周后，正常組和模型組給予等量蒸餾水，均勻設計各組分別灌胃相應藥物4周，給藥量為1 mL/100 g。

2.3.2 均勻設計驗證實驗 SD雄性大鼠60只，自造模起，按體質量分層原則隨機分為正常組、模型組、血脂康組(0.126 g/kg)、黃芪總皂苷組(34 mg/kg)、荷葉總生物堿組(80 mg/kg)、最佳劑量配伍組(34 mg/kg+80 mg/kg)，每組10只。造模2周后，正常組、模型組給予等量蒸餾水，各用藥組給予相應藥物治療，給藥4周。

2.4 標本采集

實驗結束后，10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，股動脈取血，置于潔凈試管中，4 ℃，4 000 r/min，離心15 min，分離血清冷貯以備生化指標檢測；取適量的肝組織-20 ℃保存，以備肝組織勻漿指標檢測；另取適宜大小的肝組織4%多聚甲醛溶液固定，以備HE染色觀察肝組織病理形態(tài)學變化。

2.5 指標檢測與方法

2.5.1 血清生化指標檢測 全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT的含量或活性，嚴格按照試劑盒說明進行。

2.5.2 肝組織中TC、TG含量檢測 全自動生化分析儀檢測各組大鼠肝組織TC、TG的含量，嚴格按照試劑盒說明進行。

2.5.3 HE染色觀察肝組織病理形態(tài) 將4%多聚甲醛固定的肝組織取出，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學變化。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 均勻設計篩選實驗

3.1.1 各組大鼠血脂和肝功能指標變化 由表2、表3可知，與正常組相比，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、AST、ALT的含量或活性均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，HDL-C含量無明顯變化(P>0.05)。與模型組相比，均勻設計1組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、AST、ALT的含量或活性，均勻設計2、3、6組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、AST的含量或活性，均勻設計4、5組血清中TC、LDL-C含量和均勻設計7組中TC的含量均有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01)，各用藥組血清中HDL-C的含量均無顯著變化(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量變化

表3 各組大鼠血清中AST、ALT活性變化

3.1.2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學觀察 正常組大鼠肝小葉結構完整，肝索以中央靜脈為中心排列整齊，肝細胞胞質均勻，無明顯脂滴與炎細胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結構被破壞，肝索排列紊亂，肝細胞腫脹變形，胞漿疏松，有大小不一的脂滴空泡和氣球樣變。見圖1。

注：A：正常組；B：模型組。

3.1.3 最佳配比分析 將均勻設計的各組數(shù)據(jù)用DPS 7.05軟件進行處理，分別得到以各指標為Y值的回歸方程，黃芪總皂苷和荷葉總生物堿分別用X1、X2表示，當Y取最小值時，TG、TC、LDL、AST、ALT的治療效果最好，故最佳配比劑量為黃芪總皂苷34 mg/kg+荷葉總生物堿80 mg/kg。見表4。

表4 均勻設計回歸分析結果

3.2 均勻設計驗證實驗

3.2.1 各組大鼠血脂含量變化 與正常組相比，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C的含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平明顯下降(P<0.01)。與模型組相比，各用藥組大鼠血清中TG、TC、LDL-C的含量明顯降低(P<0.01)，血脂康組、最佳劑量配比組HDL-C的含量明顯升高(P<0.05)。最佳劑量配比組大鼠血清中TC的含量明顯低于血脂康組、黃芪總皂苷組和荷葉總生物堿組(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C的含量變化

3.2.2 各組大鼠肝組織中TG、TC含量變化 與正常組相比，模型組大鼠肝組織中TG、TC含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，各用藥組大鼠肝組織TG、TC的含量明顯降低(P<0.01)，其中，最佳劑量配比組大鼠肝組織中TC的含量低于血脂康組(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠肝組織TG、TC的含量變化

3.2.3 各組大鼠肝組織病理變化 正常組大鼠肝組織形態(tài)正常，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞排列緊密，核圓居中。模型組大鼠肝索排列紊亂，細胞內(nèi)可見大量脂滴空泡和氣球樣變，與模型組相比，各用藥組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴空泡和氣球樣變均明顯減少，尤以最佳配伍組效果最為明顯。見圖2。

注：A：正常組；B：模型組；C：血脂康組；D：黃芪總皂苷組；E：荷葉總生物堿組；F：最佳配比組。

4 討論

中醫(yī)學中并無高脂血癥的命名，根據(jù)其發(fā)病原因和臨床特征，多將其歸屬于“痰濁”“瘀血”等范疇。在高脂血癥形成過程中，脾主運化功能是否正常是其發(fā)病關鍵。嗜食肥美、飲食失節(jié)、久坐懶動等均為誘發(fā)高脂血癥的外因[9]，脾虛失運，痰濁內(nèi)生為其發(fā)病的內(nèi)因和關鍵病機，健脾化痰祛濁為基本治法。黃芪補氣利水，荷葉升發(fā)清陽、滲利水濕，二藥合用既能補脾益氣，杜絕水濕痰濁生成之源，又能升清降濁、運化水濕，使既生之痰濕得以消散，恰合高脂血癥的發(fā)病機制，不失為防治高脂血癥的有效藥對。研究表明，黃芪水煎劑對非酒精性脂肪肝大鼠具有良好的調(diào)脂護肝作用[10]。荷葉水提物可以促進脂肪動員，能明顯減輕實驗性肥胖大鼠的體質量，改善血脂水平[11]。黃芪總皂苷具有降血脂、抗炎、抗氧化應激等作用[12]。荷葉總生物堿具有調(diào)節(jié)脂質代謝、減肥、改善炎癥、抗氧化等作用[13-14]。因此，選用黃芪與荷葉有效組分配伍治療高脂血癥符合中醫(yī)學理論，且有臨床療效證實及現(xiàn)代研究依據(jù)。

本研究基于均勻設計探討黃芪總皂苷-荷葉總生物堿治療高脂血癥的最佳劑量配比及治療效果，對于模型組大鼠血清中異常升高的TG、TC、LDL-C、AST、ALT等指標和肝臟脂肪變性，均勻設計各組均有不同程度的調(diào)脂護肝作用。二次多項式逐步回歸分析結果表明，以TC、LDL-C、AST、ALT指標為Y值的回歸方程結果提示，黃芪總皂苷34 mg/kg+荷葉總生物堿80 mg/kg為最佳配比劑量，以TG為Y值的回歸方程結果提示，黃芪總皂苷34 mg/kg+荷葉總生物堿75 mg/kg為最佳配比劑量，其中，75 mg/kg并非均勻設計實驗中擬定劑量，實為計算機優(yōu)化后的結果，其與方案中的80 mg/kg最為接近，因而最終確定的最佳劑量配比為黃芪總皂苷34 mg/kg+荷葉總生物堿80 mg/kg，而驗證實驗進一步證實了其結果的有效性。均勻設計實驗結果表明，黃芪總皂苷和荷葉總生物堿配伍對高脂血癥有較好的治療效果，且有一定配比規(guī)律，對中藥臨床應用具有重要意義。