超高液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)定量牛奶中主要蛋白質(zhì)

韓靜雯，李國輝*，鐘其頂，王道兵，班楠，劉洋

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)2(北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，北京，101300)

牛奶作為日常生活中最常見的乳品，以其較高的蛋白質(zhì)含量在人們各個成長階段中發(fā)揮著重要作用。牛奶蛋白中含量最高的是酪蛋白和乳清蛋白。牛酪蛋白包括β-酪蛋白(β-casein, β-CN)、αS1-酪蛋白(αS1-casein, αS1-CN)、αS2-酪蛋白(αS2-casein, αS2-CN)和κ-酪蛋白(κ-casein, κ-CN)，其中β-CN含量接近40%，且具有遺傳多樣性[1]，其會在被消化后形成較小的酪蛋白磷酸肽，酪蛋白磷酸肽可促進鈣的吸收并與睡眠活動相關(guān)[2]。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的十幾種β-CN的變異體中,最常見的是A1型和A2型。αS-酪蛋白(αS-casein, αS-CN)是牛乳中主要過敏原之一，主要組分為αS1-CN和αS2-CN，對αS-酪蛋白過敏的人群約占乳品過敏總數(shù)的65%左右[3]。κ-酪蛋白影響酪蛋白膠束的形成、大小和功能，同時具有抗菌活性、增加消化率等重要的生理學(xué)功能[4]。

牛乳清蛋白中主要含有α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-La)和β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)[5]。α-La能夠為發(fā)育中的新生兒提供蛋白質(zhì)合成所必需的氨基酸，如色氨酸等，在促進嬰兒生長發(fā)育的同時，具有免疫調(diào)節(jié)和促進大腦發(fā)育的作用[6]。成年人攝入α-La可以提高個體的認知能力、記憶力和睡眠質(zhì)量，此外，α-La還是鈣、鎂、錳、鈉、鉀和鋅的載體[7]。β-Lg是牛乳中具有天然防御功能的脂蛋白，經(jīng)過胃酸和蛋白酶等消化后仍有部分保持完整的蛋白結(jié)構(gòu)，因此也會造成一系列的過敏反應(yīng)。同時，β-Lg是基本氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源，并能夠結(jié)合脂溶性維生素，增加其生物利用率[8]。

現(xiàn)在常用于檢測酪蛋白和乳清蛋白主要組分的主要有電泳法[9-10]、酶聯(lián)免疫吸附法[11-12]、高效液相色譜[13-15]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16-18]等。通常前3種方法的單個樣品檢測需耗費大量時間，而液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用大大縮短了檢測時間，并一定程度提高了檢測的精確度和靈敏性，使對牛奶中不同蛋白質(zhì)的定量研究愈加方便準確。

本研究在BOBE等[19]建立的乳蛋白液相色譜測定方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了對牛奶樣品的前處理方式，確定了有效色譜分離和質(zhì)譜檢測條件，在實現(xiàn)對牛奶中6種主要蛋白質(zhì)定量檢測的同時，通過解卷積分析對比觀測質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)，可確認各個蛋白峰中包含的主要蛋白質(zhì)亞型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標準品：κ-CN，αS-CN，β-CN，α-La，β-Lg，源葉生物公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)、鹽酸胍(GdnHCl)、檸檬酸鈉、dL-二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)，乙腈(acetonitrile,ACN)，Sigma公司；超純水(Milli-Q制備系統(tǒng))，美國Millipore公司。

1.2 實驗儀器

1290-6546超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，配備Dual AJS ESI源，美國Agilent公司；離心機，貝克曼庫爾特美國股份有限公司；渦旋振蕩器，其林貝爾儀器制造有限公司；一次性針管注射器，江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司；0.22 μm濾膜，北京匯科同創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 樣品收集

牛奶乳頭奶樣品分別采集于河北省、湖北省、黑龍江省和新疆維吾爾族自治區(qū)大型牧場，每個地區(qū)各選擇6個樣品，共24個樣品。

1.4 試劑配制

流動相A：0.1%(體積分數(shù)，下同)TFA的水溶液；流動相B：0.1%TFA的乙腈溶液。

溶液A：根據(jù)定容體積，準確稱(量)不同量的各試劑，使得最終混合溶液中含有17.5 mmol/L Tris Base緩沖液，6 mol/L GdnHCl的溶液，5.37 mmol/L檸檬酸鈉，20 mmol/L DTT，溶液最終pH為7.92；溶液B：含有4.5 mol/L GdnHCl的流動相A，溶液pH為2.25。

1.5 樣品前處理

樣品前處理：1 mL溶液A在室溫下加入到1 mL樣品中，渦旋振蕩10 s，室溫下孵育1 h，之后在4 ℃下16 000×g離心5 min，去除脂肪層。殘留液經(jīng)溶液B以體積比1∶3稀釋后，0.22 mm濾膜過濾，上樣分析。

標準品前處理：標品蛋白質(zhì)用超純水溶解，分別配成質(zhì)量濃度為40 mg/mL κ-CN，40 mg/mL αS-CN，40 mg/mL β-CN，20 mg/mL α-La，20 mg/mL β-Lg的標準儲備溶液，儲存在-20 ℃的冰箱中備用。將配好的標準品等體積混合，配制成混合標樣溶液，之后操作步驟同牛乳樣品預(yù)處理。在相同的前處理條件下，用超純水代替樣品制備溶劑作為對照。

1.6 色譜條件

使用安捷倫ZORBAX 300Extend-C18(2.1 mm×100 mm,300 A) 色譜柱，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min；進樣量1 mL。在6 min內(nèi)使流動相B從30%升至40%，在6.1 min～16 min使流動相B從40%升至44%，后置平衡時間3 min。

1.7 質(zhì)譜條件

干燥氣溫度200 ℃；干燥氣流速8 L/min；霧化氣壓力30 psi；鞘氣溫度30 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓3 500 V；質(zhì)量掃描范圍m/z50～3 200；采集速率2 spectra/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件優(yōu)化

以牛奶為研究對象，進行6種主要蛋白質(zhì)的定量探究，使用GdnHCl作為變性劑，以打開蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，使其中的氫鍵與流動相更好結(jié)合；使用DTT作為還原劑，用于還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，并且阻止蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵生成。利用Tris base在pH 7.5～9.0較強的緩沖能力，以其作為緩沖劑來防止體系pH變化影響DTT的還原效果。

對乳蛋白的色譜分離通常采用水和乙腈作為流動相，在此基礎(chǔ)上進行不同流動相組分、梯度、流速和進樣量的對比，具體條件見表1。

表1 實驗條件優(yōu)化Table 1 Optimization of experimental conditions

為了減輕TFA對質(zhì)譜的影響，使用甲酸(formic acid，F(xiàn)A)取代或部分取代TFA，但峰形較差，不能有效分離。TFA作為一種弱離子對試劑，能夠起到改善峰寬和拖尾的問題，因此隨著TFA的濃度逐漸上升，不同蛋白質(zhì)峰的出峰情況和分離效果都得到改善。但由于TFA與質(zhì)譜之間存在不兼容的情況，因此方法在得到較好的分離情況后，不再繼續(xù)增加TFA的濃度，盡可能減輕對質(zhì)譜造成的負擔。

同時，實驗對比了3種不同的流動相梯度洗脫程序，分析起始有機相(流動相B)比例與梯度變化速率對分離度的影響。先以20%有機相作為起始比例，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在洗脫程序的后半程(30%～50%，6.1～16 min)被集中洗脫，從而進一步選取蛋白質(zhì)出峰的有機相比例范圍(30%～50%，0～16 min)作為單線性梯度，此時部分蛋白峰不能實現(xiàn)有效的分離，出現(xiàn)拖尾、重疊、峰形較差的問題。在此基礎(chǔ)上進行調(diào)整，采用了有機相比例從30%～40%(0～6 min)以及40%～44%(6.1～16 min)的兩段線性梯度，以較高的有機相比例確保蛋白峰的分離度，同時又降低最終有機相的比例從而加快梯度變化，促進蛋白質(zhì)的洗脫，使其具有良好的峰形。

方法使用的色譜柱內(nèi)徑為2.1 mm，在其適用流速的基礎(chǔ)上，分析了0.2和0.3 mL/min的流速條件對峰型和分離度的影響，發(fā)現(xiàn)在0.3 mL/min的流速下，峰形相對較好、峰寬變小，但對于分離度不具有顯著的影響。對進樣量的優(yōu)化結(jié)果顯示，隨著進樣量的增加，峰高增加，但過大的進樣量會使部分峰的分離效果變差、峰寬增加甚至可能出現(xiàn)色譜柱過載的問題，因此選擇進樣量1.0 mL，在保障良好的峰高和響應(yīng)值的基礎(chǔ)上確保良好的峰寬?；谝陨涎芯?，可在16 min內(nèi)完成單個樣品采集，如圖1所示。

圖1 牛奶中6種主要乳蛋白的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of six main proteins in milk

2.2 牛奶蛋白的定量

2.2.1 標準曲線建立

以超純水為空白基質(zhì)制作標準溶液，按照同樣的樣品前處理方法，在同一色譜及質(zhì)譜條件下進行測定。以響應(yīng)值與濃度建立6種蛋白質(zhì)分別的標準曲線，結(jié)果見表2，各個蛋白質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)r均在0.99以上，線性關(guān)系良好。

2.2.2 回收率、精密度、檢出限和定量限

對牛奶樣品進行6種蛋白質(zhì)的3個水平加標回收率的檢測驗證，在各個水平重復(fù)3次，計算各個蛋白質(zhì)分別在3個水平下的回收率以及平均回收率。如表3所示，牛奶蛋白質(zhì)的平均加標回收率在92%～108%。

表2 六種蛋白質(zhì)的標準曲線圖Table 2 Standard curve of six proteins in milk samples

表3 六種蛋白質(zhì)在牛奶樣品里的加標回收率Table 3 Recoveries of six proteins in milk samples

為了驗證方法重現(xiàn)性和重復(fù)性，使用樣品溶液按照研究方法進行6次重復(fù)檢測，連續(xù)6 d，最終結(jié)果見表4。最終得到保留時間和峰面積的日內(nèi)精密度和日間精密度均在10%以下。以標準曲線的最小濃度水平計算方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，分別介于0.027 8～0.268 8 mg/mL和0.092 7～0.896 0 mg/mL。

表4 六種蛋白質(zhì)在牛奶樣品里的精密度、檢出限和定量限Table 4 RSD, LOD and LOQ of six proteins in milk samples

續(xù)表4

2.2.3 牛奶蛋白定量

在此基礎(chǔ)上對來源于不同地區(qū)的牛奶樣品進行定量，6種主要蛋白質(zhì)的平均含量見表5。盡管所有牛奶均來源于荷斯坦奶牛，但κ-CN，αS1-CN和β-Lg的含量沒有顯著差異，但4個不同省份牛奶樣品之間的α-La含量的差異顯著， αS2-CN和β-CN在不同地理環(huán)境下呈現(xiàn)極顯著差異。本次研究4個采樣省份中，僅有湖北省來自中國南方地區(qū)，與其他3個省份的地理環(huán)境差異較大，蛋白含量整體較高。中國土地廣闊，氣候條件以及牧草差異會對奶牛所產(chǎn)牛奶中蛋白質(zhì)組分含量造成不同程度影響，南北方氣候差異較大，南方規(guī)?；B(yǎng)殖場較北方更多。同時，不同氣候條件下，奶牛的進食量差異也會引起奶蛋白含量的差異[20]。因此即便相同奶牛品種，通過對比不同地區(qū)的牛奶中主要蛋白質(zhì)的整體和細化分類含量差異，可以為牛奶產(chǎn)地鑒別提供基礎(chǔ)。將本實驗牛奶蛋白定量結(jié)果與文獻[21]中的羊奶和牦牛奶中相應(yīng)蛋白質(zhì)含量進行了比較，發(fā)現(xiàn)牛奶中的αS-CN和β-Lg均高于羊奶中平均水平，但低于牦牛奶中平均水平。α-La在3種奶中含量相差不大，κ-CN和β-CN的含量均低于羊奶和牦牛奶。據(jù)此分析可知，不同氣候條件對牛奶蛋白質(zhì)含量有顯著影響，物種對乳蛋白質(zhì)含量影響更為顯著。與此同時，可看出牛奶相較于羊奶和牦牛奶潛在的過敏風(fēng)險較高，營養(yǎng)價值可能存在一定的差異性。

表5 六種蛋白質(zhì)在牛奶樣品里的定量結(jié)果Table 5 Quantification results of six proteins in milk samples

2.3 牛奶蛋白亞型

利用安捷倫Bioconfirm software對各個蛋白峰進行解卷積，得到觀測質(zhì)量數(shù)，并與文獻[19, 22]中記載的理論質(zhì)量數(shù)進行比對，確認6種蛋白質(zhì)的主要亞型(圖1)。色譜圖中從左到右依次為κ-CN, αS2-CN, αS1-CN, β-CN, α-La和β-Lg。在此基礎(chǔ)上對各個峰進行解析，各峰的質(zhì)譜圖和接卷積圖詳見電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030460 )，分析結(jié)果見表6，κ-CN的亞型主要為A型和B型，質(zhì)量數(shù)在19 000～22 000 Da，誤差最大達到了1.95 Da；αS2-CN的主要亞型僅觀測到A型，質(zhì)量數(shù)在25 000 Da以上；αS1-CN的亞型僅觀測到B型為23 614.54 Da；而β-CN的觀測質(zhì)量數(shù)集中在24 000 Da左右，亞型較多，分別為A1型、A2型和B型；B型是此次α-La觀測到的唯一亞型，質(zhì)量數(shù)最低，僅為14 185.72 Da；β-Lg得到2個亞型A型和B型，質(zhì)量數(shù)則高于18 000 Da。事實上，對于蛋白質(zhì)亞型的檢測既需要有效的前處理過程和分離檢測程序，專業(yè)的軟件和數(shù)據(jù)庫也不可或缺。本次研究簡要對各個蛋白質(zhì)的主要亞型進行了分析對比，發(fā)現(xiàn)同一蛋白質(zhì)存在不同亞型，若進一步進行分離純化可對不同亞型進行分離，以滿足不同的實驗需求。近些年來，研究者們的關(guān)注點從牛奶的蛋白總量轉(zhuǎn)變成為關(guān)注更加細致的蛋白分類和蛋白質(zhì)亞型含量，以此來進一步明確牛奶的營養(yǎng)價值和致敏性，如部分研究者在針對A1與A2型β-CN的差異時發(fā)現(xiàn)，A2型較A1型而言可以在一定程度上緩解乳糖不耐受反應(yīng)[23]。因此，對于蛋白質(zhì)不同亞型的檢測分析能夠有利于進一步明確牛奶中蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成和生理功能。

表6 主要蛋白峰解卷積后的觀測質(zhì)量數(shù)和理論質(zhì)量數(shù)對比Table 6 Comparison of observed mass number and theoretical mass number after deconvolution of main protein peaks

同時，同一蛋白質(zhì)亞型存在不同觀測質(zhì)量數(shù)并能有相應(yīng)的理論質(zhì)量數(shù)與之匹配，這是由于蛋白質(zhì)會與不同數(shù)量的磷酸基團結(jié)合導(dǎo)致磷酸化，而不同數(shù)量的磷酸基團使得質(zhì)量數(shù)產(chǎn)生變化。此外，κ-CN除磷酸化之外還會出現(xiàn)糖基化現(xiàn)象，使得蛋白質(zhì)質(zhì)量數(shù)出現(xiàn)更多種可能性。

3 結(jié)論與討論

本研究方法可在16 min內(nèi)完成牛奶中6種主要蛋白質(zhì)定量分析，并通過優(yōu)化得到較好的峰分離效果。相較而言，電泳法在靈敏度和精確性上較差，易受到雜質(zhì)干擾；酶聯(lián)免疫法靈敏性與特異性高，但卻存在制備新抗體較為繁瑣的問題，通常應(yīng)用于某一類蛋白質(zhì)的檢測分析，而不對亞型進行探究；液相色譜法重現(xiàn)性好，能在一定程度上對部分蛋白質(zhì)亞型進行分離檢測，但耗時較長。本方法的單樣品檢測時長與檢測靈敏度均優(yōu)于其他3種檢測方法，實現(xiàn)了較短時間的牛奶蛋白質(zhì)定量，適合進行大批量樣品的采集，方法回收率以及精密度較高，能夠進一步對蛋白質(zhì)進行更加細致的分析，得到更加豐富的蛋白質(zhì)亞型信息。本次研究的24個牛奶樣品雖然來自于4個不同的省份，但在6種主要蛋白質(zhì)的含量上并沒有出現(xiàn)較大的差異，可能與奶牛品種均為荷斯坦奶牛有關(guān)，因此若加大采樣數(shù)量并進行不同種類奶牛蛋白質(zhì)比例對比分析，可一定程度上作為奶源分析的基礎(chǔ)。根據(jù)采集到的譜圖，針對不同蛋白質(zhì)峰進行解卷積，探究其更加細化的分類，通過與理論數(shù)值進行對比，進一步明確了各個蛋白質(zhì)在樣品中的主要亞型，可以作為進一步細化牛奶蛋白甚至其他種類乳制品蛋白質(zhì)種類的依據(jù)和對照，方法有望應(yīng)用于乳制品品質(zhì)評價與品種鑒別。