基于電膜萃取-高效液相色譜法測(cè)定奶酪中的組胺

陳楚翹，劉振民，喻東威，徐斐，葉泰，曹慧，于勁松，袁敏*

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，上海，200093)2(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)3(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，011500)

奶酪是鮮牛奶經(jīng)過(guò)發(fā)酵之后得到的產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、鈣、脂肪和磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因其口味醇厚而深受廣大消費(fèi)者青睞。但奶酪在其成熟和貯存期間，部分蛋白質(zhì)在酶的作用下降解生成游離氨基酸，隨后氨基酸在脫羧酶分解和催化作用下產(chǎn)生了生物胺[1-3]。組胺由組氨酸在微生物作用下生成[4]，是奶酪等發(fā)酵食品中廣泛存在的一種生物胺。組胺在奶酪中的含量最高可達(dá)2 500 mg/kg[5-6]。攝入高濃度的組胺，會(huì)使人產(chǎn)生頭暈嘔吐、呼吸紊亂等不良反應(yīng)，甚至?xí)虼竽X出血導(dǎo)致死亡[7-8]。因此，奶酪發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的組胺與人體的健康息息相關(guān)，檢測(cè)奶酪中的組胺含量具有重要意義。

食品中生物胺的檢測(cè)較為困難，主要原因在于基質(zhì)復(fù)雜、存在干擾物及多種生物胺的共存性較差。人們?nèi)粘Ｊ秤玫陌l(fā)酵乳制品、肉類、水產(chǎn)類食品給生物胺形成提供了理想環(huán)境[9]，同時(shí)這類食品富含蛋白質(zhì)和脂肪為生物胺檢測(cè)增加了難度。對(duì)于基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品，其前處理在生物胺檢測(cè)前起著至關(guān)重要的作用，關(guān)系到生物胺檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前食品樣品中生物胺的前處理方法主要有液液萃取法[10]和固相萃取法[11]，但二者均耗時(shí)冗長(zhǎng)、操作繁瑣、消耗大量有機(jī)試劑，在樣品分析領(lǐng)域具有一定的局限性。近年來(lái)電膜萃取(electromembrane extraction，EME)技術(shù)作為一種新穎前處理方法，廣泛運(yùn)用于藥物、環(huán)境分析方面，并逐漸向食品和飲料檢測(cè)領(lǐng)域擴(kuò)展[12-14]。電膜萃取是GJELSTAD等[15]提出的以電勢(shì)差為驅(qū)動(dòng)力，促使離子化待測(cè)物通過(guò)支撐液膜發(fā)生快速的定向移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)選擇性萃取的前處理方法。支撐液膜是電膜萃取能否實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵因素，目前最常用的支撐液膜是將具有微孔結(jié)構(gòu)的中空纖維浸潤(rùn)在有機(jī)溶劑中制成的液態(tài)膜。但纖維膜浸潤(rùn)及有機(jī)溶劑去除過(guò)程繁瑣復(fù)雜。同時(shí)高電壓萃取以及萃取過(guò)程中水解導(dǎo)致的溫度升高等情況都易導(dǎo)致液態(tài)膜的脫落[16]，影響待測(cè)物的傳質(zhì)效果。ASADI等[17]以固態(tài)的聚丙烯酰胺凝膠薄膜提取母乳和廢水中的堿性藥物，在萃取過(guò)程中膜的穩(wěn)定性較液膜有顯著提高，有效降低了膜脫落現(xiàn)象的發(fā)生，固態(tài)凝膠膜制備簡(jiǎn)單，無(wú)需有機(jī)試劑，且可通過(guò)調(diào)整濃度進(jìn)而控制膜孔徑尺寸，根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)大小靈活調(diào)整膜孔徑，能有效提高待測(cè)物質(zhì)的萃取效率。但目前尚未見(jiàn)到以聚丙烯酰胺凝膠薄膜為支撐液膜萃取生物胺的報(bào)道。

組胺在酸性條件下以陽(yáng)離子形式存在，可以在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下定向移動(dòng)。本文針對(duì)現(xiàn)有生物胺前處理技術(shù)不足的發(fā)展現(xiàn)狀，利用上述原理，以聚丙烯酰胺凝膠薄膜為支撐膜，優(yōu)化萃取條件，建立了電膜萃取-高效液相色譜檢測(cè)組胺的方法，以期為食品中生物胺的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡薩奶酪粉(配料：牛奶、食鹽、凝乳酶)購(gòu)于上海嘉定區(qū)食品批發(fā)市場(chǎng)。組胺(≥99%)、丹磺酰氯(≥99%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA，99.0%)、濃鹽酸(36%～38%)、氨水、NaHCO3、NaOH、過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate，APS)、丙酮(99%)、乙酸乙酯(色譜純)，上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司；丙烯酰胺、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)，上海麥克林生化科技公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，德國(guó)默克公司；所有化學(xué)試劑均為分析純及以上級(jí)別，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；IKA color squid磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；QL-866旋渦混合器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；伯樂(lè)電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；鉑絲電極(0.5 mm×37 mm)，武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司；0.45 μm微孔過(guò)濾膜，上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司；0.22 μm一次性針頭過(guò)濾器，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠支撐膜的制備

在文獻(xiàn)[17]的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)合成聚丙烯酰胺凝膠膜，稱取適量丙烯酰胺和N,N′-甲叉雙丙烯酰胺溶于100 mL超純水中，在4 ℃下避光保存。于5 mL離心管中加入2 mL上述溶液，再依次加入1.6 mL超純水、50 μL APS、6 μL TEMED，渦旋混勻后迅速取200 μL混合液于底部封閉的載體室中，靜置20 min，待膠完全凝固后，避光保存。

1.4 電膜萃取裝置的搭建

電膜萃取裝置由伯樂(lè)電泳儀、L型鉑絲電極、樣品室、接受相載體室、磁力攪拌器構(gòu)成。在整個(gè)萃取過(guò)程中，電泳儀作為電源提供電驅(qū)動(dòng)力，正負(fù)鉑絲電極的一端分別置于樣品室和載體室中，另一端則與電泳儀相連，從而構(gòu)成完整回路。裝置示意圖如圖1所示。

圖1 電膜萃取裝置圖Fig.1 Schematic illustration of EME device

1.5 電膜萃取

稱取磨碎后的奶酪樣品5 g(精確到0.000 1 g)于50 mL離心管中，加入35 mL 50 g/L TCA+0.1 mol/L HCl溶液(V/V=1∶2.5)，渦旋振蕩30 s，超聲提取5 min，于 9 000 r/min下離心5 min，取離心后的上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾，得到澄清透明的樣液，作為供體相溶液。取5 mL供體相溶液于25 mL玻璃燒杯中，將600 μL HCl溶液作為接受相溶液加入固定有聚丙烯酰胺凝膠薄膜的載體室中，隨后將載體室固定在燒杯中部的環(huán)形玻璃板上。L型鉑絲電極則分別插入樣品室和載體室中，樣品室連接正極，載體室連接負(fù)極，調(diào)節(jié)電極距離為3 cm。整個(gè)萃取裝置置于磁力攪拌器上，電壓設(shè)置為45 V，時(shí)間為5 min，在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，供體相溶液中的組胺以陽(yáng)離子形式通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠支撐膜進(jìn)入接受相溶液。萃取完成后，立刻收集接受相溶液，以高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 電膜萃取條件優(yōu)化

供體相種類優(yōu)化：稱取5 g奶酪，分別加入35 mL 50 g/L TCA+0.1 mol/L HCl、2 g/L乙酸鉛+1 g/L TCA、2 g/L乙酸鉛+0.1 mol/L HCl，其他條件保持不變，電膜萃取完成后，高效液相色譜法測(cè)定組胺含量。

供體相體積優(yōu)化：稱取5 g奶酪，以35 mL 50 g/L TCA+0.1 mol/L HCl初步提取后，得到約33 mL上清液，分別取30、20、10、5 mL加入樣品室，其他條件保持不變，電膜萃取完成后測(cè)定組胺含量。

接受相種類優(yōu)化：50 g/L TCA+0.1 mol/L HCl初步提取得到的溶液作為供體相溶液，分別以0.5 mol/L HCl、0.2 mol/L PB、100 g/L TCA為接受相溶液，體積為0.6 mL，其他條件保持不變，進(jìn)行電膜萃取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定萃取完成后接受相溶液中的組胺含量。

接受相濃度優(yōu)化：以HCl溶液為接受相溶液，濃度分別設(shè)置為0.08、0.5、0.8 mol/L，其他條件保持不變，進(jìn)行電膜萃取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定萃取得到的組胺含量。

萃取電壓優(yōu)化：在電壓分別為25、35、45、55 V條件下進(jìn)行電膜萃取實(shí)驗(yàn)，時(shí)間為5 min，其他條件保持不變，萃取結(jié)束后測(cè)定接受相溶液中的組胺含量。

萃取時(shí)間優(yōu)化：在45 V電壓條件下進(jìn)行電膜萃取實(shí)驗(yàn)，時(shí)間分別設(shè)置為1、3、5、7 min，其他條件保持不變，進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，萃取完成后，以液相法測(cè)定接受相溶液中的組胺含量。

1.7 高效液相色譜分析

1.7.1 儀器分析條件

色譜柱：Hypeisil ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；室溫35 ℃，流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，每次進(jìn)樣前的平衡時(shí)間為30 min。流動(dòng)相A為：90%乙腈/10%乙酸銨(含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液)；B相為10%乙腈/90%乙酸銨(含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液)。梯度洗脫程序(A相)：0～15 min，60%～85%；15～18 min，85%～100%；18～23 min，100%～60%；23～25 min，60%。

1.7.2 組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取組胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用0.5 mol/L HCl溶液稀釋至刻度，配制成1 000 mg/L的組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)使用的不同質(zhì)量濃度組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液均由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋得到。

1.7.3 衍生化條件

取250 μL樣品或某一濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.5 mol/L HCl溶液稀釋4倍后，依次加入1 mL飽和NaHCO3溶液、100 μL NaOH溶液(0.1 mol/L)、1 mL丹磺酰氯(10 mg/mL，溶劑為丙酮)，渦旋混勻后于60 ℃水浴鍋中衍生15 min，取出加入100 μL氨水，振蕩混勻后，再次于60 ℃下水浴15 min，取出后放置一段時(shí)間待冷卻到室溫加入1 mL超純水，振蕩1 min后N2除去丙酮(約1 mL)，加入0.5 g NaCl，振蕩5 min至NaCl完全溶解，再加入6 mL乙酸乙酯，渦旋均勻后靜置10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，下層水相再萃取1次，合并2次乙酸乙酯溶液，在40 ℃條件下N2吹干，加入1 mL乙腈復(fù)溶，0.22 μm濾膜針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

1.7.4 線性范圍、檢測(cè)限

用0.5 mol/L HCl溶液對(duì)組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，配制成系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，衍生化后采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，以不同組胺的濃度為橫坐標(biāo)，以組胺峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)其進(jìn)行線性擬合，求得線性方程和相關(guān)線性系數(shù)。

1.8 富集倍數(shù)的計(jì)算

根據(jù)萃取前后溶液中含有的組胺濃度，計(jì)算組胺的富集倍數(shù)[18]，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：cf，萃取后接受相所含的組胺質(zhì)量濃度，mg/L；ci，萃取前供體相樣品中所含的組胺質(zhì)量濃度，mg/L。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 電膜萃取前后接受相溶液的色譜分析

以高效液相色譜法對(duì)奶酪樣品進(jìn)行測(cè)定，所得色譜圖如圖2所示。

a-供體相溶液；b-組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 g/L TCA+0.1 mol/L HCl)；c-萃取前的接受相溶液；d-組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 mol/L HCl)；e-萃取后的接受相溶液圖2 組胺色譜圖Fig.2 The chromatograms of histamine

比較萃取前后的接受相溶液色譜圖，結(jié)果表明，在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，組胺成功地被萃取到了接受相溶液中。并且圖2-a中供體相溶液中有較多的雜質(zhì)峰和背景音，而經(jīng)過(guò)電膜萃取得到的接受相溶液(圖2-e)，雜峰的數(shù)量明顯減少，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的凈化。

2.2 萃取條件優(yōu)化

對(duì)影響電膜萃取的因素進(jìn)行優(yōu)化，以接受相中的組胺含量(mg/L)為衡量指標(biāo)，探究最適合組胺萃取的供體相種類和體積、接受相種類及濃度、萃取電壓與時(shí)間，結(jié)果如圖3所示。

a-供體相種類；b-供體相體積；c-接受相種類；d-接受相濃度；e-萃取電壓；f-萃取時(shí)間圖3 電膜萃取條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of EME conditions

電膜萃取必需條件之一是目標(biāo)物質(zhì)以離子形式存在[19]。生物胺為有機(jī)堿小分子，在酸性溶液下以陽(yáng)離子形式存在。因此選用酸試劑初步提取奶酪中的組胺，萃取結(jié)果如圖3-a所示，0.1 mol/L HCl溶液對(duì)奶酪中生物胺的提取效果相對(duì)較好。這可能是由于乙酸鉛和三氯乙酸更多作用于沉淀蛋白質(zhì)，相較于鹽酸，萃取能力較弱，因此，本方法采用50 g/L TCA+0.1 mol/L HCl作為提取劑。

比較不同供體相體積對(duì)電膜萃取組胺富集倍數(shù)的影響，在其他條件保持不變的情況下，將供體相的體積設(shè)置為5～30 mL，比較接受相溶液中的組胺含量，如圖3-b所示，隨著供體相體積的增加，接受相中組胺含量明顯下降。奶酪制品不同于酸奶和牛奶，Na+濃度較高，在電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)下，會(huì)對(duì)組胺的移動(dòng)產(chǎn)生干擾。供體相體積越大，其中富含的鹽離子量就越多，在一定程度上影響組胺從供體相向接受相移動(dòng)，綜合考慮，選擇5 mL作為電膜萃取的供體相體積。

目標(biāo)物質(zhì)組胺在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下從供體相遷移到接受相溶液，從而達(dá)到富集和減少基質(zhì)干擾的效果。接受相的種類影響組胺的遷移量。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)為陽(yáng)離子形式時(shí)，接受相的選擇要滿足以下條件[20]：(1)接受相為酸性溶液；(2)接受相的pH要小于供體相的pH，從而減弱H+向接受相溶液移動(dòng)。如圖3-c所示，以鹽酸為接受相溶液得到的組胺含量明顯高于PB溶液(0.2 mol/L，pH 2.5)和100 g/L TCA溶液。為了得到盡可能高的萃取效率，選擇鹽酸作為接受相溶液。

電膜萃取理論模型[21]中提出萃取效率與樣品溶液及接受相的離子強(qiáng)度成反比。因此接受相中的離子強(qiáng)度高于供體相溶液往往能有效提高萃取效率。圖3-d中探究了不同濃度的鹽酸溶液作為接受相得到的組胺含量，當(dāng)鹽酸濃度從0.08 mol/L增加到0.5 mol/L時(shí)，組胺濃度增加，但進(jìn)一步增加鹽酸濃度，萃取效率有所降低。因此將鹽酸濃度定為0.5 mol/L。

電膜萃取的過(guò)程中，電壓是影響目標(biāo)物質(zhì)遷移的重要因素。圖3-e研究了在25～55 V電壓下萃取組胺的效果，結(jié)果表明在25～45 V,隨著電壓增加，接受相中的組胺濃度隨之增加，但當(dāng)電壓超過(guò)45 V時(shí)，萃取得到的組胺含量反而下降。這可能是因?yàn)殡妷哼^(guò)高會(huì)加劇電解水反應(yīng)，從而導(dǎo)致接受相溶液中的pH發(fā)生改變[22]，影響傳質(zhì)過(guò)程，水電解反應(yīng)式為式(2)：

2H2O→4H++O2+4e-(正極)

2H2O+2e-→2OH-+H2(負(fù)極)

(2)

研究表明萃取時(shí)間與電壓是相互影響的，較高電壓所需萃取時(shí)間較短，但高電壓可能會(huì)導(dǎo)致液膜脫落，從而使萃取過(guò)程失敗，若選用的電壓較低，則需要增加萃取時(shí)間才能達(dá)到同樣的萃取效果。為獲得一個(gè)較為溫和的實(shí)驗(yàn)條件，避免電解水過(guò)程中大量氣泡的生成，影響目標(biāo)物質(zhì)的遷移，本試驗(yàn)探究了在不同時(shí)間條件下對(duì)萃取效果的影響，如圖3-f所示，將萃取時(shí)間設(shè)置為7 min萃取組胺的效果較好，但電膜萃取過(guò)程中伴隨電解水現(xiàn)象，時(shí)間越長(zhǎng)，電解水產(chǎn)生大量氣泡會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性較差，綜合組胺萃取效果、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性因素將電壓萃取時(shí)間設(shè)定為5 min。

2.3 電膜萃取-高效液相色譜方法的檢出限和定量限

分別用不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以組胺峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比作為檢出限(limit of detection，LOD)，10倍信噪比作為方法定量限(limit of quantitation，LOQ)，測(cè)定結(jié)果表明目標(biāo)物質(zhì)在1～200 mg/L線性關(guān)系良好，回歸方程為y=89 190x-21 193，方法的檢出限為0.02 mg/L，定量限為0.1 mg/L。

2.4 樣品富集倍數(shù)

取5 g磨碎后的奶酪樣品于50 mL離心管中，分別添加5、10、20 mg/L 3個(gè)水平的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5步驟進(jìn)行萃取處理，1.7步驟進(jìn)行衍生液相測(cè)定。每個(gè)加標(biāo)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣品，根據(jù)1.8計(jì)算富集因子，如表1所示，3個(gè)加標(biāo)濃度得到的富集因子穩(wěn)定在1.7倍左右，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為1.41%～5.71%，符合樣品檢測(cè)要求。

表1 實(shí)際樣品的富集倍數(shù)及RSD(n=6)Table 1 The enrichment factor and RSD (n=6) in actual samples analysis

2.5 與國(guó)標(biāo)方法的對(duì)比分析

根據(jù)GB 5009.208—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》對(duì)奶酪樣品進(jìn)行前處理，與電膜萃取樣品得到的結(jié)果進(jìn)行比較，如表2所示，國(guó)標(biāo)方法提取出的組胺含量與電膜萃取得到的組胺含量較為一致，RSD均小于6.55%。然而國(guó)標(biāo)方法需經(jīng)過(guò)酸提、除脂、液液萃取等步驟，耗時(shí)約4 h，以電膜萃取為前處理方法提取奶酪中的組胺僅需20 min，顯著縮短了整個(gè)檢測(cè)時(shí)間。

表2 國(guó)標(biāo)法與電膜萃取法測(cè)定奶酪中組胺含量Table 2 Comparison of national standard method and EME-HPLC method in the determination of histamine in cheese

3 結(jié)論

本文利用電膜萃取-高效液相色譜技術(shù)對(duì)奶酪中的組胺進(jìn)行快速分析，在優(yōu)化萃取條件的基礎(chǔ)上，評(píng)估了對(duì)實(shí)際樣品中組胺檢測(cè)的可行性和準(zhǔn)確性。整個(gè)前處理過(guò)程僅需20 min即可實(shí)現(xiàn)組胺的提取，富集倍數(shù)達(dá)到1.7倍。與國(guó)標(biāo)方法相比，本方法顯著縮短了前處理時(shí)間，操作簡(jiǎn)單，同時(shí)無(wú)需任何有機(jī)試劑，更適用于發(fā)酵乳制品中的組胺檢測(cè)。適當(dāng)延長(zhǎng)萃取時(shí)間有利于提高目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率，然而水電解現(xiàn)象的劇烈程度與萃取時(shí)間呈正相關(guān)，電解放熱反應(yīng)會(huì)使膜穩(wěn)定性受到一定影響，如何在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)組胺的更高效提取，有待進(jìn)一步研究。