八種精油對(duì)乳酸菌及致病菌的選擇抑制性篩選及其應(yīng)用研究

薛元泰，吳世芳，李義恒，石承瑞，楊曉麗，魯迎瑞，王瑩，張衛(wèi)兵*，文鵬程*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州，730010)3(武威高原生物制品有限責(zé)任公司，甘肅 武威，733000)

發(fā)酵乳作為益生菌的載體，在全世界被廣泛消費(fèi)。為了滿(mǎn)足和豐富對(duì)發(fā)酵乳的偏好及提高產(chǎn)量，人們開(kāi)始添加各種營(yíng)養(yǎng)及功能成分[1]。植物精油(狹葉精油[2]，留蘭香、水薄荷精油[3]，肉桂、丁香、迷迭香等精油[4]，蒔蘿精油[5]，紫蘇葉精油[6]等)因?yàn)榱己玫墓δ苄约耙嫔砸脖粐?guó)內(nèi)外學(xué)者添加于發(fā)酵乳中并進(jìn)行研究。

精油是自植物中提取的天然產(chǎn)物，被美國(guó)食品藥物管理局認(rèn)定為一般認(rèn)定為安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的物質(zhì)，在食品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。大多數(shù)精油對(duì)病原菌具有抑制作用，且抑菌途徑涉及細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等方面，菌種對(duì)精油難以產(chǎn)生耐藥性[7]，精油能為發(fā)酵乳的食用創(chuàng)造一層安全保障。另一方面，精油抑制病原菌的同時(shí)，也可能對(duì)發(fā)酵菌種產(chǎn)生影響，而較致病菌而言，乳酸菌是對(duì)精油不敏感的微生物[3]。在發(fā)酵乳中致病菌引發(fā)的中毒事件時(shí)有報(bào)道[1]，開(kāi)發(fā)新型綠色的抑菌劑迫在眉睫。目前針對(duì)單種精油對(duì)乳源微生物作用及多種精油對(duì)致病菌的抑菌效果研究較多，而各種精油對(duì)致病菌及乳酸菌的選擇抑制性報(bào)道較少。

本試驗(yàn)預(yù)選8種精油，以抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為表征，分析精油對(duì)6株乳酸菌及2株致病菌的抑菌活性，從中篩選出具有強(qiáng)抑制作用及選擇抑制性的精油，并系統(tǒng)研究pH對(duì)MIC的影響，旨在為發(fā)酵產(chǎn)品篩選合適的植物精油提供一定理論基礎(chǔ)；以O(shè)D600值表征所篩選的精油各濃度對(duì)指示菌的生長(zhǎng)過(guò)程的影響，并制作精油發(fā)酵乳，對(duì)發(fā)酵及儲(chǔ)藏過(guò)程活菌數(shù)、pH、滴定酸度等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，探究其在發(fā)酵乳中的實(shí)際作用，為精油應(yīng)用于發(fā)酵乳提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料

肉桂、牛至、百里香、羅勒、沒(méi)藥、丁香，市售；留蘭香，安徽桑標(biāo)貿(mào)易有限公司；迷迭香，洛陽(yáng)迷迭香農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司；乳酸鏈球菌素(Nisin)，索萊寶公司；其他試劑均為分析純。

嗜酸乳桿菌G1、鼠李糖乳桿菌G5、羅伊氏乳桿菌G8、副干酪乳桿菌L9、嗜熱鏈球菌Q1、嗜熱鏈球菌Q2由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供并保存。乳酸菌的培養(yǎng)采用MRS肉湯及MRS固體培養(yǎng)基，致病菌采用TSB和TSA培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Versa Max全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；723型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；pH S-3C精密pH計(jì)、HG 303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；游標(biāo)卡尺，上海九金工具有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精油的提取

采用水蒸餾法提取精油。粉碎后的物料與蒸餾水以料液比1∶10(g∶mL)混合，采用Clevenger裝置蒸餾4 h，收集后于4 ℃暗光保存。

1.2.2 菌種的活化

菌種在甘油管中于-80 ℃保存。使用前，將指示菌活化3代(37 ℃，12 h)，調(diào)節(jié)菌液濃度，備用。

1.2.3 抑菌圈直徑的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]的方法。將100 μL 108CFU/mL的菌液涂布于培養(yǎng)基，將濾紙片貼于其上，移取5 μL精油或10 mg/mL的Nisin水溶液于濾紙片上，37 ℃培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)定抑菌圈大小并記錄。

1.2.4 MIC的測(cè)定

根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)[8]的建議。用濃鹽酸調(diào)整液體培養(yǎng)基的初始pH為6.4、5.8、5.2、4.6、4.0，滅菌，并加入0.5%(體積分?jǐn)?shù))的二甲基亞砜(過(guò)0.22 μm濾膜)。在96孔板前11列完成精油濃度為20 μL/mL到0.156 μL/mL的稀釋?zhuān)?2列為不加精油的生長(zhǎng)對(duì)照，每孔100 μL。再接入100 μL 106CFU/mL菌液，吹打混勻。37 ℃培養(yǎng)24 h，未觀察到可見(jiàn)微生物生長(zhǎng)的最低濃度為精油的MIC。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線

參照陳默等[9]的方法。將100 μL 108CFU/mL的菌液加到100 mL含不同濃度牛至精油的培養(yǎng)基(含1.5%甘油作為乳化劑)中，混勻。吸取250 μL上述培養(yǎng)基于96孔板中，以不含精油的培養(yǎng)基為生長(zhǎng)對(duì)照(CK)，以不含菌的培養(yǎng)基為參比，37 ℃培養(yǎng)48 h，每隔一段時(shí)間用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.6 發(fā)酵乳制備

配制脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的復(fù)原乳，加入1.5%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-80為乳化劑，均質(zhì)。95 ℃滅菌5 min，冷卻至40 ℃，無(wú)菌條件下，加入0、0.156、0.313 μL/mL的牛至精油，以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的G5菌液，混勻，42 ℃培養(yǎng)，每隔0.5 h觀察并記錄凝乳時(shí)間，每隔4 h測(cè)定活菌數(shù)、pH及滴定酸度。將凝乳的發(fā)酵乳放入4 ℃后熟，在1、7、14、21、28 d時(shí)測(cè)定活菌數(shù)、pH、滴定酸度、DPPH自由基清除率。

1.2.7 活菌數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定活菌數(shù)。

1.2.8 pH和滴定酸度的測(cè)定

pH用精密pH計(jì)測(cè)定。參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》測(cè)定酸度。

1.2.9 DPPH自由基清除率

參照李思寧等[10]的方法并略作修改。將樣品于4 ℃、8 000×g離心10 min，收集上清液，過(guò)0.45 μm濾膜，獲得乳清樣品。將2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L，95%甲醇作為溶劑)與1 mL的乳清樣品或95%甲醇(對(duì)照)混勻，反應(yīng)20 min。4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液，于517 nm測(cè)定吸光值為A2。用95%甲醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光值為A1。用1 mL蒸餾水代替待測(cè)樣品測(cè)定吸光值為A0。DPPH自由基清除率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.10 感官評(píng)價(jià)

參考羅惠等[11]的方法并略作修改。由10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員按照表1對(duì)后熟1 d的發(fā)酵乳進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards

1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。使用SPSS 19.0的單因素方差分析中的鄧肯氏多重比較進(jìn)行顯著性差異分析，以P<0.05為差異顯著。利用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑

菌種對(duì)精油敏感程度判定標(biāo)準(zhǔn)為：直徑≤12 mm為低度敏感，12 mm<直徑≤20 mm為中度敏感，直徑>20 mm為高度敏感[7]。抑菌劑對(duì)指示菌的抑菌圈大小如表2及圖1所示。精油對(duì)乳酸菌的抑菌圈直徑均顯著小于致病菌(P<0.05)。類(lèi)似的結(jié)論也被AMBROSIO等[12]報(bào)道。乳酸菌對(duì)牛至、肉桂精油均中度敏感，而致病菌為高度敏感，2種精油展現(xiàn)了最好的抑菌效果。牛至精油的選擇抑菌性更強(qiáng)，其對(duì)致病菌的抑菌圈直徑均顯著高于肉桂精油(P<0.05)，而其抑制G8 (17.88±0.53) mm、L9 (18.44±0.98) mm的能力顯著低于肉桂精油G8 (20.79±0.99)、L9 (20.41±0.06) mm(P<0.05)。FANCELLO等[13]研究也指出肉桂精油在各精油中抑制乳酸菌的能力最強(qiáng)。乳酸菌和E.coli對(duì)百里香中度敏感，S.aureus為高度敏感，乳酸菌和致病菌分別對(duì)丁香呈現(xiàn)低度敏感和中度敏感，兩者抑菌性弱于牛至、肉桂。致病菌對(duì)迷迭香、羅勒、沒(méi)藥、留蘭香精油均低度敏感，作為抑菌劑的能力較弱。按照精油抑制致病菌的程度從強(qiáng)到弱排序分別為牛至>肉桂>百里香>丁香，抑制乳酸菌程度從強(qiáng)到弱排序?yàn)槿夤?牛至>百里香>丁香。

表2 K-B法抑菌結(jié)果 單位：mm

圖1 部分抑菌劑對(duì)指示菌的生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of some bacteriostatic agents on the growth of bacterial

本文以Nisin為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，Nisin水溶液抑制乳酸菌(Q2除外)效果均顯著強(qiáng)于致病菌(P<0.05)，賀松等[14]也有一致的研究結(jié)果。抗菌物質(zhì)對(duì)致病菌及益生菌的選擇抑制性是確定其抗菌譜的重要特征[15]，牛至、肉桂、百里香、丁香精油在該方面展現(xiàn)出較Nisin更好的性能，故以這4種精油作為MIC試驗(yàn)展開(kāi)的對(duì)象。

2.2 MIC

通常將pH 4.0作為發(fā)酵乳的貨架期終點(diǎn)[6]，故對(duì)精油進(jìn)行pH 6.4～4.0下的MIC試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。精油對(duì)乳酸菌的MIC隨著pH的降低均降低。這說(shuō)明一定濃度的精油在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中具有前期影響小，后期抑制乳酸菌生長(zhǎng)的潛力，這將有利于控制乳酸菌過(guò)度繁殖導(dǎo)致的后酸化。當(dāng)pH為4.6和4.0時(shí)，E.coli和S.aureus依次不生長(zhǎng)，根據(jù)ARYANA等[1]的報(bào)道，致病菌會(huì)在高pH下生長(zhǎng)、低pH下進(jìn)行變異，因而可能存在于低pH食品中。添加精油可以有效抑制高pH下致病菌生長(zhǎng)，同時(shí)減小其在低pH下變異的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 精油在不同初始pH環(huán)境下MIC的測(cè)定結(jié)果Table 3 MIC of essential oils in different initial pH environments

相同pH下，牛至、肉桂、百里香、丁香精油對(duì)致病菌的MIC遠(yuǎn)小于對(duì)乳酸菌的MIC，這些精油均具有作為發(fā)酵制品抗菌劑的潛力。牛至精油具有最低的MIC，使用時(shí)可減少用量，從而減小對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味及品質(zhì)的影響，其對(duì)乳酸菌的MIC(0.625～2.5 μL/mL)遠(yuǎn)大于對(duì)致病菌的(0.156～0.313 μL/mL)，故進(jìn)一步研究牛至精油濃度(0.156～2.5 μL/mL)對(duì)指示菌生長(zhǎng)情況的影響，試驗(yàn)采用GC-MS對(duì)牛至精油進(jìn)行成分表征，成分主要為香芹酚51.78%(數(shù)據(jù)未展示)。

2.3 生長(zhǎng)曲線

圖2監(jiān)測(cè)了指示菌在不同濃度的牛至精油處理下的生長(zhǎng)情況，精油通過(guò)抑制細(xì)菌對(duì)數(shù)期的正常分裂和繁殖，使其無(wú)法達(dá)到正常的生長(zhǎng)高峰，這與薩仁高娃[7]的研究一致。精油含量0.156 μL/mL時(shí)便已完全抑制E.coli的生長(zhǎng)(圖2-h)和有效抑制S.aureus的生長(zhǎng)(圖2-g，生長(zhǎng)量?jī)H為CK的51.06%)，而乳酸菌的生長(zhǎng)量可達(dá)CK的95.26%～104.57%(圖2-a～圖2-f)。精油含量0.313 μL/mL時(shí)完全抑制S.aureus、E.coli的生長(zhǎng)(圖2-g～圖2-h)，乳酸菌的生長(zhǎng)量達(dá)到CK的91.54%～102.12%(圖2-a～圖2-f)。精油含量0.625 μL/mL時(shí)，各乳酸菌的生長(zhǎng)量為CK的62.76%～87.94%，更高濃度下乳酸菌不生長(zhǎng)(圖2-a～圖2-f)。結(jié)果表明，0.156、0.313 μL/mL牛至精油可作為發(fā)酵制品抑菌劑來(lái)抑制致病菌的生長(zhǎng)，且不會(huì)對(duì)乳酸菌造成明顯的影響。

2.4 牛至精油對(duì)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程的影響

2.4.1 凝乳時(shí)間及活菌數(shù)

各組均在16.5 h凝乳，精油未對(duì)凝乳時(shí)間造成影響。各組發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)如表4所示。在凝乳時(shí)間內(nèi)，即16.5 h前，精油組與CK間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。20 h時(shí)，精油組活菌數(shù)均顯著高于CK(P<0.05)，且有劑量關(guān)系，這可能因?yàn)榫途哂锌寡趸?，可以清除O2為益生菌生長(zhǎng)提供合適的條件[16]。24 h時(shí)，精油組活菌數(shù)均顯著低于CK(P<0.05)，這可能與過(guò)酸環(huán)境下精油的抑菌性加強(qiáng)有關(guān)[17]。

a-G1；b-G5；c-G8；d-L9；e-Q1；f-Q2；g-S.aureus；h-E.coli圖2 不同濃度的牛至精油對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of oregano essential oil on bacterial growth注：數(shù)字為48 h時(shí)該處理組生長(zhǎng)量占CK生長(zhǎng)量的百分比

表4 牛至精油對(duì)發(fā)酵乳活菌數(shù)的影響單位：lg CFU/mL

2.4.2 產(chǎn)酸特性

各組發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中pH和酸度如圖3所示。凝乳前，第16 h時(shí)，牛至精油對(duì)發(fā)酵乳pH無(wú)顯著影響，對(duì)滴定酸度具有顯著促進(jìn)作用，值得注意的是，在12 h內(nèi)，精油組的滴定酸度顯著低于CK(P<0.05)，這可能因?yàn)榫椭杏坞x的羥基離子會(huì)中和乳酸菌產(chǎn)生的乳酸[18]。發(fā)酵20 h，0.313 μL/mL組pH顯著低于其余組，精油組滴定酸度顯著高于CK(P<0.05)，精油對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸呈現(xiàn)促進(jìn)作用。發(fā)酵24 h，0.313 μL/mL組pH顯著高于其余組，精油組滴定酸度顯著低于CK(P<0.05)，這說(shuō)明精油在低pH高酸度條件下顯著抑制了乳酸菌的產(chǎn)酸。鄭佳[6]利用紫蘇葉精油也成功延緩了發(fā)酵乳儲(chǔ)藏中的后酸化現(xiàn)象。綜上，牛至精油對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸呈現(xiàn)促進(jìn)-抑制的趨勢(shì)，且濃度增加會(huì)增大該趨勢(shì)。

a-pH；b-滴定酸度圖3 牛至精油對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸特性的影響Fig.3 Effects of oregano essential oils on the acid-producing properties of lactic acid bacteria

2.5 牛至精油對(duì)發(fā)酵乳儲(chǔ)藏過(guò)程的影響

2.5.1 活菌數(shù)

牛至精油對(duì)發(fā)酵乳儲(chǔ)藏過(guò)程中活菌數(shù)的影響結(jié)果如表5所示。活菌數(shù)在7 d時(shí)增長(zhǎng)至最高，后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。精油組活菌數(shù)均高于CK，0.313 μL/mL組在儲(chǔ)藏期均顯著高于CK(P<0.05)。MEHDIZADEH等[5]報(bào)道，蒔蘿精油提高了儲(chǔ)藏至14 d時(shí)發(fā)酵乳中益生菌的數(shù)量及活力。本研究表明，0.156～0.313 μL/mL的牛至精油在儲(chǔ)藏期均有效提高了發(fā)酵乳活菌數(shù)，牛至精油0.313 μL/mL時(shí)活菌數(shù)最高。

表5 牛至精油對(duì)發(fā)酵乳儲(chǔ)藏過(guò)程活菌數(shù)的影響 單位：lg CFU/mL

2.5.2 產(chǎn)酸特性

發(fā)酵乳儲(chǔ)藏28 d的pH及滴定酸度結(jié)果如圖4所示。在7 d內(nèi)，0.313 μL/mL組的pH顯著低于CK，精油組的酸度均顯著高于CK(P<0.05)，精油促進(jìn)了乳酸菌的產(chǎn)酸，且有劑量依賴(lài)性。14～28 d時(shí)，精油組的pH與酸度均和CK無(wú)顯著性差異(P>0.05)。MEHDIZADEH等[5]也有相似的報(bào)道。研究表明，牛至精油在儲(chǔ)藏7 d內(nèi)對(duì)pH及滴定酸度均有顯著的促進(jìn)作用。

a-pH；b-滴定酸度圖4 牛至精油對(duì)儲(chǔ)藏過(guò)程中乳酸菌產(chǎn)酸特性的影響Fig.4 Effects of oregano essential oils on acid production characteristics of lactic acid bacteria during storage

2.5.3 抗氧化性

牛至精油添加對(duì)發(fā)酵乳DPPH自由基清除能力的影響如圖5所示。在每個(gè)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)，精油組DPPH自由基清除能力均顯著高于空白組(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。JOUNG等[19]的研究中也有相似結(jié)果。這可能是由于牛至精油具有良好的抗氧化性，其中存在的酚類(lèi)等成分發(fā)揮了作用，使得自由基清除率升高[20]。

圖5 牛至精油對(duì)發(fā)酵乳清除DPPH自由基能力的影響Fig.5 Effects of oregano essential oils on DPPH free radical scavenging rate of fermented milk

2.6 牛至精油對(duì)發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)的影響

發(fā)酵乳感官評(píng)分如圖6所示。精油對(duì)發(fā)酵乳的色澤影響不大，樣品均呈現(xiàn)乳白色。精油具有特有的風(fēng)味，造成了氣味、滋味評(píng)分的降低，且隨濃度的增加而降低。精油對(duì)質(zhì)構(gòu)的影響并無(wú)劑量依賴(lài)性，0.156 μL/mL組乳清析出較多，評(píng)分較低，0.313 μL/mL組與CK評(píng)分相近。ELAMA等[4]報(bào)道，添加250 μL/kg的肉桂、丁香和迷迭香精油可賦予發(fā)酵乳制品良好的抑菌性，但同時(shí)精油帶來(lái)了感官評(píng)價(jià)小組中一些成員不喜歡的強(qiáng)烈風(fēng)味，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而JOUNG等[19]報(bào)道，0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的柿子葉和蓮葉提取物改善了發(fā)酵乳的口感和質(zhì)地。MAHMOUDI等[2]報(bào)道，不同濃度的精油雖然都引起了發(fā)酵乳感官特性的降低，但低劑量仍可以得到較好的接受度。本試驗(yàn)表明，0.156、0.313 μL/mL的牛至精油引起了發(fā)酵乳氣味、滋味、質(zhì)構(gòu)和總體接受度的下降。

圖6 牛至精油對(duì)發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)的影響Fig.6 Effects of oregano essential oils on sensory evaluation of fermented milk

3 結(jié)論

結(jié)果表明，牛至、肉桂、百里香、丁香精油具有良好的選擇抑制性，對(duì)致病菌S.aureus和E.coli的抑制能力顯著強(qiáng)于乳酸菌，精油表現(xiàn)出較Nisin(對(duì)照)更具作為發(fā)酵產(chǎn)品抗菌劑的潛力。4種精油對(duì)指示菌的MIC隨pH的降低而降低。0.156、0.313 μL/mL的牛至精油對(duì)培養(yǎng)基中乳酸菌的生長(zhǎng)基本無(wú)影響，但具有完全抑制或部分抑制致病菌生長(zhǎng)的能力。本文驗(yàn)證了0.156、0.313 μL/mL的牛至精油作為發(fā)酵乳添加劑的可行性。在發(fā)酵過(guò)程中，牛至精油對(duì)發(fā)酵乳凝乳時(shí)間、活菌數(shù)基本無(wú)影響，有助于乳酸菌在凝乳期的產(chǎn)酸，在過(guò)發(fā)酵情況下，精油有助于控制后酸化。在儲(chǔ)藏過(guò)程中，精油處理使得7 d內(nèi)活菌數(shù)顯著增加，酸度提高，并增強(qiáng)了抗氧化能力，但造成氣味、滋味、質(zhì)構(gòu)和總體接受度的下降。