高產(chǎn)輔酶Q10類球紅細(xì)菌的選育及發(fā)酵優(yōu)化

李文鑫，曾偉主，周景文,3*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122)

輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是一種脂溶性醌類化合物。作為天然存在的輔酶，CoQ10是人體必需的抗氧化劑和電子傳遞體，在呼吸作用中是非常關(guān)鍵的物質(zhì)，能夠增強(qiáng)胞內(nèi)ATP的供給，降低體內(nèi)自由基，抵抗氧化，幫助延緩衰老，提高機(jī)體免疫力[1]。CoQ10在食品、醫(yī)藥、化妝品和畜牧飼料領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，市場需求和技術(shù)應(yīng)用日趨增加[2-3]。目前，CoQ10的生產(chǎn)方法主要是發(fā)酵法，該方法不僅僅可以擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，在生產(chǎn)力層面占據(jù)優(yōu)勢，又因其是微生物自身合成的產(chǎn)物，CoQ10的下游產(chǎn)物均是具有良好生物活性的反式結(jié)構(gòu)，相比于動(dòng)植物組織提取法和化學(xué)合成法，發(fā)酵法生產(chǎn)成本更有競爭力[4]。類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)是一種古老的原核生物，廣泛存在于農(nóng)田、池塘、湖泊和海洋中。類球紅細(xì)菌具有多種代謝途徑，如光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)和化能異養(yǎng)。同時(shí)，類球紅細(xì)菌可以利用多種小分子有機(jī)物為碳源合成增值產(chǎn)品，如微生物蛋白、類胡蘿卜素、細(xì)菌葉綠素、CoQ10和長鏈游離脂肪酸等[5]。

CoQ10合成途徑較為復(fù)雜，當(dāng)前主要針對(duì)其合成關(guān)鍵機(jī)理及其限速酶進(jìn)行解析，通過代謝途徑和基因表達(dá)元件的調(diào)控等方式提高CoQ10效價(jià)[6-7]。目前，國內(nèi)CoQ10的生產(chǎn)效率并不能滿足當(dāng)前我國日益增長的需求，國內(nèi)外多采用誘變育種和發(fā)酵過程優(yōu)化來強(qiáng)化CoQ10的生產(chǎn)[8]。選育高產(chǎn)量的CoQ10生產(chǎn)菌是當(dāng)前亟待解決的問題。常用的菌株誘變育種方法包括物理誘變和化學(xué)誘變[9-10]。近年研究中，常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)技術(shù)因具有高突變率、低危險(xiǎn)性及操作便利性等優(yōu)勢，在國內(nèi)誘變研究工作中獲得了更多青睞，如維生素K、吡咯喹啉醌和輔酶等重要物質(zhì)高產(chǎn)菌株的篩選研究進(jìn)展迅速[11-12]。但是，誘變篩選的過程常常難以控制，菌株隨機(jī)突變而導(dǎo)致篩選過程難以實(shí)現(xiàn)高效率和高正向突變率的問題仍然存在[13]。近年來，高通量篩選方法因其高自動(dòng)化和高效率的特點(diǎn)迅速崛起，此類平臺(tái)為CoQ10高產(chǎn)菌株的高效篩選提供了新思路[14-15]。能夠簡便而快速篩選到更多正向突變菌株的篩選方法亟待被開發(fā)，用以應(yīng)對(duì)CoQ10高產(chǎn)菌株的研究工作。

本研究以類球紅細(xì)菌作為出發(fā)菌株，應(yīng)用Craven test法以堿性環(huán)境下CoQ10上甲氧基和氰基的配合物在熒光條件下能夠快速檢測的原理為基礎(chǔ)，確定了多孔板初篩高產(chǎn)CoQ10菌株的方法，采用ARTP誘變技術(shù)結(jié)合篩選因子維生素K3、對(duì)羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid，PHBA)和羅紅霉素(roxithromycin，ROX)進(jìn)行多輪誘變和發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，獲得1株高產(chǎn)CoQ10的突變菌株，考察其遺傳穩(wěn)定性，并在搖瓶水平進(jìn)行培養(yǎng)基成分和濃度的優(yōu)化，最后在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，以強(qiáng)化類球紅細(xì)菌的生產(chǎn)性能。該研究亦可為其他維生素的高產(chǎn)菌株的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發(fā)菌株為類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 菌株培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉15.0，KH2PO41.0，NaCl 2.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO40.09，CoCl20.003，氯化膽堿0.012 12，瓊脂粉18.0，pH 7.0～7.2。121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO42.5，酵母粉1.0，谷氨酸鈉0.5，玉米漿干粉0.5，葡萄糖4.0，KH2PO40.5，K2HPO40.5，NaCl 2.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，MgSO4·7H2O 2.0，MnSO40.03，CoCl20.001，CaCO38.0，氯化膽堿0.004，pH 6.6～7。115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO42.5，谷氨酸鈉2.5，玉米漿干粉3.5，KH2PO40.45，NaCl 2.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.2，MgSO4·7H2O 11.0，MnSO40.05，CaCl20.07，CaCO38.0，氯化膽堿0.002 8。121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基輔料(g/L)：維生素B10.605，維生素B20.060 5，維生素B60.111 3，煙酸0.687 5，煙酰胺0.687 5，葉酸0.033，泛酸鈣0.011，生物素0.021 7，0.22 μm水系膜過濾。

1.1.3 主要試劑和主要儀器

硫胺素、生物素、煙酸、PHBA、維生素K3、ROX、CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品、DMF、甲醇、乙醇(色譜純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；谷氨酸鈉、NaOH、(NH4)2SO4、CaCO3、FeSO4、MnSO4、CoCl2、無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿干粉，上海源葉生物有限公司。

ZQZY-80AS搖床，上海知楚儀器有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)，美國Thermo公司；Applied Biosystems臺(tái)式離心機(jī)，美國Eppendorf公司；ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；synergy H1酶標(biāo)儀，南京拜爾沃克智能科技有限公司；T&J-TypeA 5L發(fā)酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ARTP誘變處理

采用ARTP育種儀對(duì)出發(fā)菌株R.sphaeroides進(jìn)行誘變。誘變條件：等離子體的輸出功率為120 W；氦氣流速為10 L/min；等離子體激發(fā)器與樣品之間的距離為2 mm；突變細(xì)菌的懸浮液體積為10 μL；將10 μL細(xì)菌懸浮液鋪在無菌不銹鋼載片上(ARTP儀器配件)。誘變處理不同時(shí)間：從0 s開始，每一次增加30 s，最長的處理時(shí)間為150 s。誘變后，將包含細(xì)菌懸液的整個(gè)載片放入含有1 mL無菌生理鹽水的2 mL無菌EP管中。用渦旋振蕩器洗脫2 min后，梯度稀釋后取100 μL菌溶液，涂在含有篩選因子的平板培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中于32 ℃孵育3 d，觀察平板上菌落的生長情況并計(jì)算致死率。

1.2.2 致死率測定

取經(jīng)過ARTP不同照射時(shí)間處理后的稀釋10-4、10-5梯度的平板培養(yǎng)基(每個(gè)梯度進(jìn)行3組重復(fù))，分別統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，按照公式(1)計(jì)算致死率：

(1)

式中：在同一稀釋梯度下，N，未經(jīng)誘變的空白對(duì)照平板上長出的單菌落個(gè)數(shù)；M，經(jīng)過誘變處理后的平板上長出的單菌落個(gè)數(shù)。

1.2.3 高通量篩選方法

按照所選用90～120 s的時(shí)間進(jìn)行ARTP誘變處理，處理完畢的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋，然后吸取100 μL，涂布于含DMF、PHBA、ROX、維生素K3的篩選平板中，各3個(gè)平行，32 ℃靜置避光倒立培養(yǎng)，3～8 d觀察并統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)。通過比較突變菌株生長的菌落大小，挑選飽滿的單菌落接種孔板篩選，平板劃線保存。

將成熟后的單菌落挑選于含有1 200 μL種子培養(yǎng)基的48深孔板中，在32 ℃、220 r/min培養(yǎng)28 h，以10%的接種量轉(zhuǎn)接于含有1 200 μL液體篩選培養(yǎng)基的24深孔板中，在32 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h。從多孔板培養(yǎng)中取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液至24深孔板中，提取CoQ10后吸取400 mL提取液與1 mL的體積分?jǐn)?shù)0.5%的KOH以及1 mL氰基乙酸乙酯(ethyl cyanoacetate，ECA)充分混合，避光條件下25 ℃靜置30 min后，吸取200 μL轉(zhuǎn)移到96淺孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測在λex/λem=430/530 nm處的熒光值，檢測同樣條件下的培養(yǎng)基，扣除培養(yǎng)基背景噪音，熒光值越高表明CoQ10量越高，挑取高于對(duì)照10%以上的優(yōu)勢菌株復(fù)篩。

搖瓶水平復(fù)篩后選取的優(yōu)勢菌株檢測效價(jià)，挑取高于對(duì)照10%以上的優(yōu)勢菌株-80 ℃保存。進(jìn)行傳代培養(yǎng)，成熟后進(jìn)行搖瓶篩選,將確定了遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)菌株進(jìn)行-80 ℃保存。

1.2.4 液相檢測條件

CoQ10的提?。喝? mL發(fā)酵液于1.5 mL的EP管中，加入20 μL的HCl溶液，2 mL丙酮，100 μL的H2O2，補(bǔ)充無水乙醇定容至10 mL，超聲波提取45 min后，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，吸取1 mL置于液相進(jìn)樣瓶中進(jìn)行液相檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液效價(jià)。

采用HPLC檢測發(fā)酵液中CoQ10的效價(jià)。色譜柱：Diamonsil 5 μm C18 150 mm×4.6 mm，檢測條件：流動(dòng)相為V(無水乙醇)∶V(無水甲醇)=35∶65等速洗脫，洗脫流速為1.1 mL/min，吸收波長為275 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5 搖瓶培養(yǎng)方法

將安瓿管中菌粉用培養(yǎng)基混勻后于32 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌株長至對(duì)數(shù)期進(jìn)一步平板劃線進(jìn)行活化，32 ℃培養(yǎng)6～7 d。劃線接種搖瓶種子32 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min培養(yǎng)30 h，按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入搖瓶發(fā)酵，于32 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min下培養(yǎng)48 h，采用單因素試驗(yàn)確定碳源、PHBA、金屬離子的最佳組合。

1.2.6 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

在搖瓶水平得到的最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證培養(yǎng)。通氣量1 vvm，轉(zhuǎn)速400 r/min，5 L發(fā)酵罐初始裝液量為2.5 L，控制發(fā)酵罐內(nèi)的葡萄糖質(zhì)量濃度在5～12 g/L，用氨水維持pH為6.8。觀察發(fā)酵過程中菌株的生長情況及CoQ10的合成情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線的繪制

ARTP誘變育種技術(shù)使用等離子體對(duì)菌體內(nèi)P—O鍵、C—N鍵等關(guān)鍵位置進(jìn)行破壞，因此，微生物經(jīng)過誘變處理后會(huì)大量死亡，但少部分存活的菌株會(huì)通過自身修復(fù)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)一定的修復(fù)作用，從而導(dǎo)致基因突變[16]。通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)算類球紅細(xì)菌的ARTP致死率，計(jì)算不同誘變時(shí)間處理后涂板所獲得的菌落數(shù)，計(jì)算ARTP誘變致死率，繪制致死率曲線，結(jié)果如圖1所示。對(duì)R.sphaeroides菌懸液處理時(shí)間從0～150 s，處理90 s后致死率達(dá)到了90%以上，處理150 s致死率達(dá)到95%以上。通常情況下，致死率越高時(shí)，菌株發(fā)生突變的概率越高，致死率達(dá)到85%～90%時(shí)較為合理[17]。因此，為了高效獲得突變菌庫，本研究選擇處理時(shí)間120 s(90%左右的致死率)作為誘變劑時(shí)間，進(jìn)行誘變處理。

圖1 致死曲線Fig.1 The lethality curve

2.2 高產(chǎn)菌株誘變篩選方法與初篩

目前，CoQ10常用的檢測方法包括高效液相色譜法、分光光度法、Craven test法。高效液相色譜法檢測精準(zhǔn)性高、范圍廣，但并不適用于高通量篩選檢測。分光光度方法存在準(zhǔn)確度不高和重復(fù)性較差等問題。本研究采用Craven test法，CoQ10的一個(gè)甲氧基被ECA的一部分取代，產(chǎn)生的化學(xué)衍生物可以在λex/λem=430/530 nm處通過熒光分光光度計(jì)檢測[18]。如圖2所示，使用Craven test法處理CoQ10的標(biāo)品，避光條件中靜置2 h后用酶標(biāo)儀檢測λex/λem=430/530 nm(檢測CoQ10的終質(zhì)量濃度分別為100、200、500、800、1 000 μg/mL)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.299+364.57x(R2=0.998)。在100～1 000 μg/mL二者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。因此使用本方法進(jìn)行高通量篩選的初篩具有良好的可行性。

圖2 Craven test法檢測CoQ10的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of coenzyme Q10 detected by Craven test method

通過培養(yǎng)平板中添加篩選因子，可以提高篩選正向突變的效率[19]。維生素K3是脂溶性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)使用DMF作為有機(jī)溶劑對(duì)其進(jìn)行溶解。由表1可知DMF體積分?jǐn)?shù)在0%～2.5%時(shí)對(duì)菌體的生長基本上沒有影響，而體積分?jǐn)?shù)超過7.5%時(shí)會(huì)對(duì)菌體生長產(chǎn)生明顯抑制，因此，DMF的體積分?jǐn)?shù)上限定為5.0%。

維生素K3是CoQ10的結(jié)構(gòu)類似物，可用于篩選解除CoQ10產(chǎn)物抑制的菌株[19]。由表1可知，當(dāng)維生素K3質(zhì)量濃度在0.003～0.003 5 g/L時(shí)，平板上菌落正常，但隨著維生素K3濃度的增加，菌落數(shù)減少;當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.004 g/L時(shí)，由于受維生素K3的抑制作用比較明顯，平板上無菌落生長。因此，確定篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株所用抗性平板中維生素K3質(zhì)量濃度為0.003 5 g/L。

PHBA是CoQ10合成的重要前體物質(zhì)，用于篩選解除前體抑制的菌株。由表1可知，隨著PHBA濃度的增加，菌體的生長受到抑制逐漸加重，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.06 g/L時(shí)，沒有菌落生長。因此，確定PHBA的最小抑制質(zhì)量濃度為0.05 g/L。

ROX易與氧分子結(jié)合發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移形成超氧陰離子,用于篩選合成CoQ10能力強(qiáng)的菌株。由表1可知，隨著ROX濃度的增加，菌體的生長抑制逐漸加重，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.007 5 g/L時(shí)，少有菌落生長。因此，確定ROX的最小抑制質(zhì)量濃度為0.005 g/L。

表1 平板篩選因子濃度對(duì)菌體生長的影響Table 1 Effect of plate screening factor concentration on cell growth

本研究應(yīng)用ARTP誘變處理CoQ10生產(chǎn)菌株R.sphaeroides，進(jìn)行誘變處理，在孔板初篩階段共進(jìn)行6輪次的誘變處理，獲得5 184株菌的突變菌庫。使用本研究確立的高通量篩選方法獲得126株正向突變的高產(chǎn)菌株(圖3)從中選取孔板初篩效價(jià)提高12%以上的8株突變株進(jìn)行下一步的搖瓶水平復(fù)篩，分別命名為64p12、622v22、61p20、7r16、64p5、7p22、61r21和521p10。

圖3 ARTP誘變初篩Fig.3 Primary screening with ARTP mutation

2.3 高產(chǎn)菌株的復(fù)篩與穩(wěn)定性分析

將活化好的8株突變菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，以10%接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，32 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h，使用HPLC檢測CoQ10。復(fù)篩結(jié)果如圖4所示，獲得高產(chǎn)菌株7p22，CoQ10的效價(jià)158.44 mg/L較出發(fā)菌株(136.47 mg/L)提高了16.1%。

圖4 搖瓶復(fù)篩Fig.4 Second screening in the shake flasks注：WT代表原始出發(fā)菌株(下同)

為了驗(yàn)證突變菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性，在搖瓶上高產(chǎn)菌株進(jìn)行連續(xù)傳代6次，以出發(fā)菌株為對(duì)照。對(duì)其中第1代、第3代和第6代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測突變菌株的CoQ10發(fā)酵能力。結(jié)果如表2所示，傳代至第4代時(shí)，突變體積累CoQ10的效價(jià)變化不明顯。突變菌株積累的CoQ10的產(chǎn)量與第1代和第6代的產(chǎn)量基本相當(dāng)。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果表明3株高通量篩選獲得的突變菌株具有穩(wěn)定的遺傳特性。

表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性Table 2 The genetic stability of mutant strains

2.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 不同碳源條件對(duì)CoQ10的影響

在搖瓶水平上本研究選擇了葡萄糖、麥芽糖、乙酸鈉、果糖、甘油、蔗糖作為碳源，探究了幾種不同的廉價(jià)碳源對(duì)CoQ10的影響，結(jié)果如圖5所示，葡萄糖作為速效碳源時(shí)CoQ10產(chǎn)量最高可達(dá)143.4 mg/L (圖5-a)，有利于菌體的迅速生長(圖5-c)。葡萄糖初始質(zhì)量濃度添加量為30 g/L時(shí)更有利于CoQ10產(chǎn)物生產(chǎn)(圖5-b、圖5-d)。

a-碳源種類對(duì)CoQ10產(chǎn)量的影響；b-葡萄糖初始質(zhì)量濃度對(duì)CoQ10產(chǎn)量的影響；c-碳源種類對(duì)生物量的影響；d-葡萄糖初始質(zhì)量濃度對(duì)生物量的影響圖5 不同碳源下CoQ10的產(chǎn)量及OD600值Fig.5 OD600value and CoQ10 titer of different carbon sources

2.4.2 不同濃度的PHBA對(duì)CoQ10的影響

本研究考察了不同濃度PHBA對(duì)和CoQ10合成的影響，結(jié)果如圖6所示。初始添加質(zhì)量濃度為37.5 mg/L時(shí)CoQ10產(chǎn)量達(dá)到93.8 mg/L，比對(duì)照組(73.8 mg/L)產(chǎn)量提升27.1%。當(dāng)初始添加質(zhì)量濃度超過50 mg/L時(shí)，前體物質(zhì)抑制對(duì)菌體生長及CoQ10的產(chǎn)量有明顯的影響，與前期篩選因子的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。因此選擇初始添加PHBA質(zhì)量濃度為37.5 mg/L更有利于CoQ10的合成。

圖6 不同濃度PHBA對(duì)CoQ10產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different concentrations of p-hydroxybenzoic acid on titer of CoQ10

2.4.3 不同濃度的金屬離子對(duì)CoQ10的影響

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)鹽進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵CoQ10各種無機(jī)鹽的最適質(zhì)量濃度范圍，從圖7中可以確定4種無機(jī)鹽對(duì)CoQ10產(chǎn)量最適質(zhì)量濃度分別為25、1.2、0.3和2.5 g/L。無機(jī)鹽主要為微生物提供滲透壓等環(huán)境，同時(shí)，許多鹽離子作為重要的某些酶的酶活中心，能夠明顯地影響細(xì)胞的生長以及目標(biāo)產(chǎn)物的合成，因此無機(jī)鹽的濃度對(duì)微生物生長及合成CoQ10的影響同樣很大。

2.5 5 L發(fā)酵罐優(yōu)化

2.5.1 分批發(fā)酵

搖瓶階段的發(fā)酵難以針對(duì)pH值、溫度、溶氧等關(guān)鍵的發(fā)酵因素進(jìn)行及時(shí)的檢測與調(diào)節(jié)，5 L發(fā)酵罐更適合于滿足菌體生長的需要。因此本研究探索在5 L發(fā)酵罐階段中，分批發(fā)酵的策略培養(yǎng)類球紅細(xì)菌，給后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供經(jīng)驗(yàn)。

發(fā)酵過程中菌體濃度、葡萄糖濃度以及CoQ10合成情況的變化，如圖8所示。發(fā)酵60 h后停止發(fā)酵，OD600最高達(dá)到35.64，CoQ10產(chǎn)量達(dá)到256.6 mg/L。10 h后菌體生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，葡萄糖被快速消耗，到40 h后葡萄糖被耗盡，菌體也隨即停止生長，說明在分批發(fā)酵中葡萄糖是菌體生長和產(chǎn)物合成的限制性因素。

a-MgSO4·7H2O；b-FeSO4·7H2O；c-KH2PO4；d-NaCl圖7 金屬離子濃度對(duì)CoQ10產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of metal ions concentration on titer of CoQ10

圖8 5 L罐上分批發(fā)酵過程曲線Fig.8 Batch fermentation process curve on 5 L bioreactor

2.5.2 連續(xù)流加補(bǔ)料發(fā)酵

分批補(bǔ)料發(fā)酵方式生產(chǎn)CoQ10可以減少發(fā)酵過程中底物過分消耗和代謝副產(chǎn)物積累對(duì)CoQ10的不利影響。應(yīng)用恒定殘?zhí)菨舛攘骷拥姆椒?，根?jù)上一時(shí)間段的耗糖速率預(yù)測下一時(shí)刻的耗糖速率，從而將葡萄糖流速調(diào)至最適范圍內(nèi)，保持糖濃度的相對(duì)恒定。如圖9所示，流加葡萄糖的補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果，碳源的流加補(bǔ)料延長了菌體的生長時(shí)間，60 h后OD600達(dá)116.8，此時(shí)CoQ10產(chǎn)量達(dá)973.61 mg/L。發(fā)酵50 h后，菌體生長逐漸緩慢，但單細(xì)胞耗糖速率保持較高水平，說明其他限制因子可能對(duì)菌體生長有影響。

圖9 5 L罐上流加葡萄糖的補(bǔ)料分批發(fā)酵過程曲線Fig.9 Fed-batch fermentation with glucose feeding fermentation process curve on 5 L bioreactor

2.5.3 溶氧(dissolved oxygen,DO)水平對(duì)CoQ10的影響

類球紅細(xì)菌在發(fā)酵過程中對(duì)氧氣的需求比較嚴(yán)格。過低的DO會(huì)導(dǎo)致菌體生長代謝受阻；而過量的氧會(huì)形成超氧化物O2-和過氧化物基O22-，破壞細(xì)胞組分，進(jìn)而影響微生物生長[20]。為了確定發(fā)酵過程中最佳的DO條件，在其他條件不變的情況下，分別設(shè)置DO為5%和25%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過溶氧偶聯(lián)發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速來研究DO對(duì)CoQ10發(fā)酵的影響。圖10顯示，DO為5%時(shí)，OD600和CoQ10最高達(dá)到134和1 411.05 mg/L，相較于DO為25%時(shí)，OD600和CoQ10分別為220和1 006.48 mg/L，低溶氧條件下，更利于發(fā)酵CoQ10的合成，高溶氧條件下，明顯更利于菌體快速生長，但高溶氧對(duì)后期CoQ10的生產(chǎn)不利，具有抑制作用，與YOUSHIDA等[21]的報(bào)道基本符合。

a-DO=5%；b-DO=25%圖10 不同DO條件對(duì)CoQ10產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of different DO conditions on titer of CoQ10

2.5.4 補(bǔ)加無機(jī)磷對(duì)CoQ10的影響

磷元素在細(xì)胞代謝途徑調(diào)節(jié)方面有著關(guān)鍵的作用，它不僅促進(jìn)微生物生長，也能夠?yàn)橐恍┊a(chǎn)物的提升做出貢獻(xiàn)。CoQ10發(fā)酵過程中，通常選擇流加高濃度的KH2PO4的方法來控制發(fā)酵液中磷元素的質(zhì)量濃度為0.1～0.2 g/L。發(fā)酵過程中根據(jù)菌體的耗糖情況對(duì)流加速率做適當(dāng)調(diào)整，控制葡萄糖質(zhì)量濃度水平在5～10 g/L。由圖11可知，菌體生長在72 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長后期，由于磷酸鹽的加入使得菌體的生長周期延長，并且更有利于CoQ10的積累，于84 h時(shí)獲得最高OD600達(dá)到172。發(fā)酵液CoQ10的產(chǎn)量為1 640.6 mg/L，比較不流加磷酸鹽時(shí)CoQ10的產(chǎn)量顯著提高。

圖11 連續(xù)流加分批發(fā)酵過程曲線Fig.11 Continuous flow plus batch fermentation process curve

3 結(jié)論與討論

CoQ10作為一種呼吸鏈傳遞系統(tǒng)的必需輔助因子，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)。雖然在基因工程方面取得了一定的進(jìn)展，如XU等[22]分析了類胡蘿卜素途徑和限速酶對(duì)CoQ10生產(chǎn)的影響；LU等[23]鑒定并消除泛醌修飾途徑中的代謝瓶頸強(qiáng)化CoQ10的生產(chǎn)。但是CoQ10的合成途徑復(fù)雜，通過基因工程獲得CoQ10高產(chǎn)的菌株相對(duì)比較困難。目前主要是通過誘變育種和發(fā)酵工藝的優(yōu)化強(qiáng)化生產(chǎn)，如梁琳琳[24]對(duì)RhodopseudomonaspalustrisFM-01-12進(jìn)行復(fù)合誘變和發(fā)酵優(yōu)化后在50 L發(fā)酵罐上獲得3 158 μg/mL的產(chǎn)量。ZHANG等[25]通過磷酸鹽限制與葡萄糖補(bǔ)料分批發(fā)酵相結(jié)合的策略，R.sphaeroidesATCC BAA-808在100 L發(fā)酵罐上將CoQ10的產(chǎn)量提升至1.95 g/L。

本研究應(yīng)用常溫室壓ARTP對(duì)CoQ10生產(chǎn)菌株R.sphaeroides進(jìn)行誘變處理，針對(duì)CoQ10的特性確定了借助維生素K3、PHBA、ROX作為篩選因子的篩選手段，結(jié)合Craven test檢測方法應(yīng)用ECA堿性條件下在酶標(biāo)儀中快速地對(duì)CoQ10的檢測功能，對(duì)5 184株誘變菌株庫進(jìn)行分選、檢測。從分選出的8個(gè)正向突變株中選取了1株CoQ10高產(chǎn)菌株7P22，相比于初始菌株提升了16.1%，遺傳穩(wěn)定性良好。針對(duì)篩選得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行了搖瓶水平上的碳源、前體物質(zhì)PHBA及金屬離子的成分優(yōu)化，將突變菌株和優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大培養(yǎng)并對(duì)發(fā)酵罐水平的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵84 h后CoQ10產(chǎn)量達(dá)到1 640.6 mg/L。本研究針對(duì)誘變育種的高通量篩選方式和發(fā)酵優(yōu)化的方法對(duì)高產(chǎn)CoQ10的菌株進(jìn)行研究，今后的研究可以尋找代謝途徑關(guān)鍵的前體物質(zhì)、氧化性強(qiáng)等產(chǎn)物針對(duì)性明顯的細(xì)胞毒性物質(zhì)作為正向突變菌株篩選因子，作為高產(chǎn)CoQ10的菌株選育的理性基礎(chǔ)。結(jié)合流式細(xì)胞分選技術(shù)等更大規(guī)模高自動(dòng)化的先進(jìn)技術(shù)提高篩選通量，從而更高效的篩選高產(chǎn)突變株，進(jìn)入工業(yè)菌株選育研究模式的更高層次，從而應(yīng)對(duì)社會(huì)對(duì)CoQ10等高價(jià)值維生素的需求；另外，5 L發(fā)酵罐的溶氧、尾氣、罐壓等參數(shù)的檢測條件有限，今后的研究可以在更大規(guī)模的發(fā)酵罐中進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合氧傳遞系數(shù)(KLa)進(jìn)行優(yōu)化，從而進(jìn)步強(qiáng)化CoQ10的積累。