醬油發(fā)酵中乳酸菌的功能及其研究進(jìn)展

彭勃，侯莎，周其洋，童星*

(1.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東 佛山 528511；3.廣東省調(diào)味食品生物發(fā)酵先進(jìn)技術(shù)重點實驗室，廣東 佛山 528000)

醬油是人們?nèi)粘Ｉ钪袘?yīng)用最廣泛的發(fā)酵調(diào)味品之一，在生活水平不斷提高的過程中，人們對醬油的品質(zhì)需求也日益提高。醬油的種類較多且制作工藝比較復(fù)雜，主要涉及制曲、鹽水發(fā)酵、壓榨或提取以及殺菌等階段[1]。在傳統(tǒng)醬油的生產(chǎn)過程中，主要生產(chǎn)的菌株是米曲霉，而乳酸菌等其他菌株基本上來自制曲、發(fā)酵器皿或空氣。在制曲階段，部分乳酸菌能夠與曲霉共同繁殖，而進(jìn)入鹽水發(fā)酵階段，高鹽體系抑制了大部分乳酸菌的生長，在此階段能夠繼續(xù)繁殖并發(fā)揮功能的乳酸菌，無論是自然條件下引入還是人為添加，都必須具有能夠在高滲透壓下生長繁殖的特點。受技術(shù)水平的限制，自古以來醬油中的乳酸菌一直處于自然繁殖狀態(tài)，隨著研究的不斷深入，如今醬油中乳酸菌的使用已經(jīng)越來越具有功能性和精確性。

1 醬油發(fā)酵中主要的乳酸菌種類

1.1 嗜鹽四聯(lián)球菌

1907年首次報道了在發(fā)酵醬油醪中存在一些形成四分體的球菌，經(jīng)過對四分體形成球菌的一系列研究，1958年將一組嗜鹽乳酸球菌定為新種——醬油片球菌[2]，它很快被重新分類為嗜鹽片球菌并在《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》中以此名稱被引用；1990 年，該物種被轉(zhuǎn)移到一個新屬并命名為嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilusi)[3]。

嗜鹽四聯(lián)球菌一直以來被認(rèn)為是醬醪的優(yōu)勢種之一，在醬油制作過程中加入嗜鹽四聯(lián)球菌具有提升醬油風(fēng)味、改善醬油品質(zhì)的功能。根據(jù)醬油中微生物菌落種群研究發(fā)現(xiàn)，醬油發(fā)酵至第2周時就能夠檢測到嗜鹽四聯(lián)球菌，而在發(fā)酵后期的醬醪中含量較少[4-5]。從醬醪中分離得到的嗜鹽四聯(lián)球菌耐鹽性很強(qiáng)，能夠在18%的高鹽環(huán)境下產(chǎn)生乳酸，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和分析發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與其耐鹽性呈正相關(guān)[6]。

1.2 魏斯氏菌

魏斯氏菌(Weissella)屬于耐鹽型乳酸菌的一種，在發(fā)酵食品中用途廣泛，最早被分類為副腸系膜明串珠菌(Leuconostocparamesenteroides)，1993 年分類修改為魏斯氏菌。該類菌株的環(huán)境耐受力很強(qiáng)，可在20 g/dL鹽分下生長，pH耐受范圍為3.0～9.5[7-8]。魏斯氏菌是參與醬油發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，在細(xì)菌總數(shù)中占比可達(dá)80%，能夠?qū)⒃现械钠咸烟寝D(zhuǎn)化為乳酸，并產(chǎn)生特有的香氣，使其口感更柔和濃厚、色澤紅潤，對醬油的發(fā)酵效果和風(fēng)味具有顯著的貢獻(xiàn)，其中融合魏斯氏菌(W.confusa)、類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)和食竇魏斯氏菌(W.cibaria)是最具優(yōu)勢的3個菌種[9]。

研究顯示，從醬油中分離出的類腸膜魏斯氏菌能夠分泌耐高鹽的蛋白酶，食竇魏斯氏菌能夠在高鹽且pH較低的環(huán)境中產(chǎn)生較大量的富馬酸，因此魏斯氏菌十分具有提高醬油中氨基酸含量以及有機(jī)酸豐富度的潛力。此外，部分魏斯氏菌還能對白色念珠菌等致病菌起到一定的抑制作用，是醬油中的一類功能型微生物[10]。

1.3 其他種類

醬油發(fā)酵過程中還存在其他乳酸菌，例如：片球菌屬(Pediococcus)在醬油乳酸菌中占有較大比重，主要包括乳酸片球菌(P.acidilactici) 和戊糖片球菌(P.pentosaceus)，其耐鹽性較好且在發(fā)酵前期還參與有機(jī)酸及氨基酸代謝[11]；乳桿菌屬(Lactobacillus)在自然界中分布廣泛，包括多個種，在制曲階段適量生長能夠抑制有害物質(zhì)的產(chǎn)生，其中發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)等在醬醪中可成為優(yōu)勢菌種[12]，但大多數(shù)乳桿菌的耐鹽性較低，在醬醪中占比較小，從發(fā)酵起始階段含量逐漸降低。乳球菌屬(Lactococcus)是1985年Schleifer等提議設(shè)立的一個新菌屬[13]，也少量存在于醬油醪中，部分乳酸乳球菌(L.lactis)及其亞種能產(chǎn)生乳鏈菌肽，在食品中具有天然的抑菌功能[14]。

2 醬油發(fā)酵中乳酸菌的功能

2.1 制曲過程中的功能

制曲是傳統(tǒng)發(fā)酵制品如醬油、豆豉等的關(guān)鍵工序，傳統(tǒng)醬油采用米曲霉制曲，米曲霉在原料中生長繁殖，形成豐富的酶系，包括中性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[15]。在傳統(tǒng)醬油半開放的生產(chǎn)過程中，實際參與到制曲過程中與米曲霉共同完成降解、轉(zhuǎn)化及代謝過程的微生物種類較多。制曲階段的乳酸菌通常以非耐鹽性乳酸菌為主，但目前為止對于曲料中乳酸菌作用的研究相對較少。

鐘方權(quán)等[16]從醬油中篩選到一株非耐鹽乳酸菌耐久腸球菌(Enterococusdurans)，能夠顯著影響曲料中酶系的豐富度和酶活力，并確定了其最佳接種比例為米曲霉接種量0.4%、乳酸菌接種量1.0%。米曲霉和乳酸菌的共同使用可顯著提高小麥曲料的中性、酸性蛋白酶活力，提高全氮、氨基酸態(tài)氮和谷氨酸含量，能夠有效增強(qiáng)醬油的鮮味[17]。孫莉等[18]在醬油制曲時加入非耐鹽的融合魏斯氏菌，使醬油中的酚類物質(zhì)顯著增加，提高了抗氧化活性，同時增加了風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸含量，顯著改善了醬油的風(fēng)味。

除了直接提升醬油的品質(zhì)外，制曲過程中使用乳酸菌還能夠抑制曲料中雜菌的繁殖，或減少有害物質(zhì)的含量。在日本醬油生產(chǎn)過程中，常用溫度控制法提高制曲前期的乳酸菌生長活性，生成少量乳酸，抑制其他雜菌的生長，再逐漸升高溫度，使乳酸菌不至于過度消耗營養(yǎng)物質(zhì)而影響曲霉的生長。大豆在制曲過程中有污染黃曲霉毒素風(fēng)險，將嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、植物乳桿菌(L.plantarum)和保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)的菌體和代謝產(chǎn)物作用于曲料中，能夠顯著抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，同時不影響米曲霉的生長[19-20]。

2.2 與酵母菌發(fā)酵的相互促進(jìn)作用

當(dāng)醬油進(jìn)入鹽水發(fā)酵階段，米曲霉逐漸死亡，耐鹽的乳酸菌、酵母菌等愈發(fā)活躍，發(fā)揮其各自的作用，這些微生物的演替、代謝與醬油的風(fēng)味特征和產(chǎn)量密切相關(guān)[21]。醬油中的乳酸菌經(jīng)過長時間的馴化都屬于耐鹽或嗜鹽性菌種，但往往耐酸性不強(qiáng)，在鹽水發(fā)酵過程中，乳酸菌通過產(chǎn)生乳酸使pH值降至5.0以下后，自身無法繼續(xù)生長，而醬油中發(fā)揮主要作用的魯氏酵母(Saccharomycesrouxii)則適宜在pH 5.5以下生長。此外，在發(fā)酵初期乳酸菌的代謝活動可以促進(jìn)原料水解，產(chǎn)生更多的還原糖，也為酵母的快速生長提供了有利條件[22]。由此，醬油釀造過程中加入耐鹽乳酸菌能夠在一定程度上促進(jìn)酵母菌的發(fā)酵效果，從而間接改善醬油的發(fā)酵效果。

劉卓[23]研究證明，在高鹽稀態(tài)醬油中，耐鹽乳酸菌與球擬酵母(Torulopsis)能夠協(xié)同作用，改善風(fēng)味，而對其主要指標(biāo)的影響較小，可明顯增加乳酸等有機(jī)酸的含量，同時提升了酯類及4-EG (4-乙基愈創(chuàng)木酚)、HDMF(4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮)等風(fēng)味物質(zhì)的含量。此外有研究顯示，嗜鹽四聯(lián)球菌和耐鹽酵母菌共同作用能夠使醬油風(fēng)味物質(zhì)含量提高116.88%[24]。在鹽分只有12%的減鹽醬油中，復(fù)合使用乳酸菌、酵母菌，檢測到其關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)乙醇、2-甲基-1-丙醇、HDMF和 3-羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮的含量顯著提高[25]。

然而，醬醪中兩類微生物的相互促進(jìn)作用在實際生產(chǎn)中更加復(fù)雜，乳酸菌和酵母菌之間不一定始終處于平衡狀態(tài)，也會因形成抑制作用而破裂。醬醪中的氮源有限，微生物對營養(yǎng)資源的利用屬于競爭關(guān)系，只有找到最合適的使用方法，才能促進(jìn)互補(bǔ)關(guān)系的建立。日本的研究人員認(rèn)為，為使乳酸菌正常發(fā)揮作用，酵母菌的接種量應(yīng)為105CFU/g，乳酸菌與酵母菌之比應(yīng)在100∶1～1000∶1范圍內(nèi)，并且醬醪中乳酸菌數(shù)達(dá)到107CFU/g再引入酵母菌，否則酵母將威脅乳酸菌的生長和代謝[26]。

2.3 改善有機(jī)酸結(jié)構(gòu)

能夠在醬油發(fā)酵過程中生長繁殖的耐鹽乳酸菌通常產(chǎn)酸能力較弱，耐酸性低，不會因為過度產(chǎn)酸而過度降低醬油的pH值，不會引起醬醪中的中性蛋白酶活性降低，從而影響醬油的品質(zhì)。這類菌株能夠利用糖產(chǎn)生適宜濃度的乳酸，提供柔和的酸味，對咸味起到中和作用，使醬油的口感更加溫和，同時，乳酸與醬油中的醇類反應(yīng)生成乳酸乙酯等酯類，也會成為香氣物質(zhì)的重要組成。據(jù)報道，當(dāng)醬油中乳酸的含量處于0.15 g/dL左右時，其具有較好的口感，而當(dāng)乳酸含量低于0.05 g/dL時，其口感明顯變差[27]。

以醬醪中存在最廣泛的嗜鹽四聯(lián)球菌為例，通常條件下，嗜鹽四聯(lián)球菌消耗1 mol葡萄糖會形成近2 mol的L-乳酸，少數(shù)菌株能形成正乳酸，而產(chǎn)生的乙酸量較少，乙酸與乳酸的比例因菌株而異，大多數(shù)嗜鹽四聯(lián)球菌也可以將檸檬酸轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸，這些檸檬酸來自于原料成曲霉[28]，多種類型有機(jī)酸的形成更加豐富了醬油的風(fēng)味。胡傳旺等從發(fā)酵醬醪中篩選了多株耐鹽乳酸菌，各菌株均能夠代謝產(chǎn)生除乳酸以外的其他有機(jī)酸，其中兩株片球菌屬均能產(chǎn)生豐富的乙酸、檸檬酸和富馬酸；一株食竇魏斯氏菌能產(chǎn)生乙酸和較多的丙酮酸。

2.4 提供特有的風(fēng)味物質(zhì)

醬油良好的風(fēng)味來自于有機(jī)酸、氨基酸、醇類、酯類等物質(zhì)，而這些風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物代謝密切相關(guān)。醬油中的乳酸菌對各種氨基酸具有脫碳作用，可能使醬油中的氨基酸組成發(fā)生變化，呈味物質(zhì)減少，但在一些情況下也可以根據(jù)需要利用乳酸菌改善氨基酸結(jié)構(gòu)。部分乳酸菌能夠?qū)⑵渌被徂D(zhuǎn)化為具有甜味的丙氨酸，從而提升醬油的風(fēng)味[29]；日本研究者在醬油制作過程中使用四聯(lián)球菌，最終增加了醬油的風(fēng)味物質(zhì)并且提高了醬油中游離氨基酸的含量[30]。

醬油中的乳酸菌自身也會產(chǎn)生具有香氣的揮發(fā)性物質(zhì)。Lee等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在醬油中接種嗜鹽四聯(lián)球菌后，主要揮發(fā)性化合物為乙酸、甲酸、苯甲醛、2-羥基丙酸乙酯、3-(甲硫基)-丙酸、環(huán)丁烯和香草醛。相比之下，接種魯氏酵母的醬油中主要揮發(fā)性化合物為乙醇、HDMF、丙酸乙酯、3-甲基-2-丁醇、1-丁醇、2-苯基乙醇和2-甲基丙酸乙酯。由此可以發(fā)現(xiàn)，嗜鹽四聯(lián)球菌處理后產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要為酸性化合物，而酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物包括支鏈或芳香雜醇、醛類和酯類化合物，這一結(jié)論充分支持了酵母和乳酸菌具有不同代謝途徑的觀點，表明在醬油中乳酸菌自身也能夠產(chǎn)生其獨特的揮發(fā)性成分，從而影響醬油的感官品質(zhì)。戚晨晨等[32]研究發(fā)現(xiàn)，添加耐鹽乳酸菌能夠使醬油風(fēng)味物質(zhì)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙醇和乙酸乙酯等揮發(fā)物含量提高，同時提高了醬油中無鹽固形物含量的。此外，本公司前期研究中在醬醪中篩選出了一株能夠增加4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量的嗜鹽四聯(lián)球菌，對醬油的香氣產(chǎn)生正面影響[33]。

2.5 減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是曾在醬油等多種發(fā)酵類食品中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，食用后有致癌的風(fēng)險，雖然醬油中該物質(zhì)的形成途徑尚不完全清晰，但其前體物質(zhì)乙醇、瓜氨酸和精氨酸等與微生物的活動有關(guān)[34]。部分乳酸菌能夠減少醬油中EC的前體物質(zhì)，對于控制或減少EC的產(chǎn)生、提高發(fā)酵類調(diào)味品的安全性意義重大。楊希飛[35]開發(fā)了一株嗜鹽四聯(lián)球菌，能夠顯著降低醬油中EC的含量，且對主要理化指標(biāo)沒有影響，最適添加量為106CFU/mL，EC含量降低了53.9%。廖淡宜等[36]從醬醪中篩選出一株嗜鹽四聯(lián)球菌株，能夠消耗EC前體物質(zhì)瓜氨酸和精氨酸，并將其轉(zhuǎn)化為具有優(yōu)質(zhì)風(fēng)味的鳥氨酸。

生物胺作為一類低分子量的活性生物堿，存在于多種發(fā)酵食品中，醬油在發(fā)酵過程中也存在形成生物胺的風(fēng)險[37]。明串珠菌屬、短乳桿菌等乳酸菌都具有氨基脫羧酶活性，與生物胺的產(chǎn)生密切相關(guān)，然而一些乳酸菌能夠降低發(fā)酵食品中生物胺的生成。有文獻(xiàn)報道，部分嗜鹽四聯(lián)球菌添加至醬醪中能夠降低醬油中有害物質(zhì)組胺的形成[38]，楊明泉等[39]從醬醪中篩選得到一株嗜鹽片球菌，在發(fā)酵初期使用能夠顯著減少55.21%最終產(chǎn)品的總生物胺含量。

2.6 其他功能

近年來，關(guān)于醬油發(fā)酵過程中乳酸菌作用的研究逐漸豐富，除了以上幾種主要功能外也有其他發(fā)現(xiàn)。

醬油成品在貨架期過程中產(chǎn)生二次沉淀是一大難題，目前國內(nèi)已對國產(chǎn)醬油二次沉淀成分、形成機(jī)制和去除技術(shù)進(jìn)行了初步研究。楊明泉等篩選得到的嗜鹽片球菌在減少生物胺含量的同時也推遲了醬油二次沉淀出現(xiàn)時間，減少了其89.12%的生成量，顯著改善了醬油的外觀品質(zhì)?；瑲g歡等[40]通過篩選得到的一株乳酸菌也能明顯降低醬油二次沉淀的產(chǎn)生，沉淀量僅為對照樣的10%。

醬油呈紅褐色是氨基酸與糖類發(fā)生褐變反應(yīng)造成的，一些醬油中乳酸菌菌株能夠顯著降低其生長環(huán)境的氧化還原電位，在醬醪中部分抑制了褐變。這類乳酸菌的還原活性來源尚不清楚，但能在褐變反應(yīng)中還原一部分類醌類中間體，使醬油的色澤更加柔和[41]。

還有一些乳酸菌能夠提高醬油的營養(yǎng)價值，例如在食品發(fā)酵過程中，魏斯氏菌可將原料分解轉(zhuǎn)化，生成短鏈脂肪酸和胞外多糖，使醬油更富有營養(yǎng)價值[42]。

3 展望

乳酸菌雖不是醬油的主要生產(chǎn)菌株，但其功能卻不容忽視。隨著人們對醬油中乳酸菌研究的不斷深入，已經(jīng)有越來越多的研究者和生產(chǎn)廠家嘗試在醬油發(fā)酵過程中添加乳酸菌，提升具有特殊功能的乳酸菌的生長優(yōu)勢，從而起到改善風(fēng)味、提高發(fā)酵效率、抑制雜菌等作用。日本醬油在生產(chǎn)過程中大多已將乳酸菌的菌種和添加量作為關(guān)鍵控制因素，但是到目前為止，國內(nèi)對于醬油中乳酸菌的認(rèn)識更多停留在理論層面，在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍然較少。醬油發(fā)酵過程較為復(fù)雜、環(huán)境開放，若要使具有特定功能的乳酸菌菌株發(fā)揮應(yīng)有的作用則必須改善其發(fā)酵條件，對整個發(fā)酵過程精準(zhǔn)調(diào)控。本文對醬油中主要乳酸菌菌種類型及其功能進(jìn)行了綜述，期望能為醬油乳酸菌的功能應(yīng)用提供基礎(chǔ)，為乳酸菌最大程度地發(fā)揮功能作用、改善國內(nèi)醬油的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品品質(zhì)提供參考。