酶解禽類蛋白制備呈味基料的研究進展

李自會，張順棠，段曉杰,*，布冠好*，劉昆侖，高立棟，井金峰

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001；2.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司，河南 項城 466200)

中國飲食文化源遠流長，調(diào)味料是中國傳統(tǒng)特色產(chǎn)品。隨著人們生活水平的提高，飲食安全、健康、營養(yǎng)受到越來越多的重視。然而，當(dāng)前市場上的調(diào)味料品質(zhì)參差不齊，因此開發(fā)營養(yǎng)型調(diào)味料具有廣闊的前景。禽肉是我國蛋白質(zhì)消費的主要來源之一，禽肉及其骨骼中含有多種復(fù)雜的鮮味成分，具有濃郁的味道，可作為食品的原料或呈味基料用于調(diào)味料的生產(chǎn)中，滿足人們的消費需求，促進食品工業(yè)的發(fā)展[1]。因此，以禽類蛋白為原料，利用技術(shù)手段開發(fā)營養(yǎng)、健康、味道鮮美、濃郁天然的調(diào)味料具有重要意義。

蛋白質(zhì)酶解是蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下被水解成小分子肽或氨基酸的過程。酶法水解具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、安全性高、高效環(huán)保、能較好保留酶解產(chǎn)物生物活性等優(yōu)點，已成為食品加工領(lǐng)域用于改造和提高蛋白質(zhì)價值的重要方法之一[2]。禽類蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生的氨基酸和多肽不僅可以提高蛋白質(zhì)的吸收利用率，而且能增強抗氧化、降血壓、抗疲勞等功效，還可以增強風(fēng)味[3]。

近年來，蛋白質(zhì)酶解技術(shù)被廣泛應(yīng)用于調(diào)味料領(lǐng)域。蛋白質(zhì)經(jīng)過適度酶解后產(chǎn)生的氨基酸和小分子肽，可與味蕾細胞接觸呈現(xiàn)甜、苦、鮮、酸等味道。此外，氨基酸和多肽是加工食品的風(fēng)味和芳香化合物形成的前體物質(zhì)，熱反應(yīng)后能有效提高香氣。蛋白酶解物風(fēng)味天然、濃郁，且具有營養(yǎng)價值，成為高檔調(diào)味料研究和發(fā)展的一個重要方向[4]。

本文對禽類蛋白的酶解工藝、酶解產(chǎn)物中的呈味物質(zhì)以及呈味肽的分離純化與鑒定進行了綜述，以期為酶解禽類蛋白制備呈味基料提供理論依據(jù)，促進調(diào)味料行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

1 禽類蛋白的酶解工藝

蛋白質(zhì)的酶解主要是蛋白酶作用于蛋白質(zhì)的肽鍵，使蛋白質(zhì)逐漸水解為多肽、小分子肽、游離氨基酸等。生物酶法制備的呈味肽具有安全性高、反應(yīng)條件溫和、可控性強等優(yōu)點，已成為制備呈味肽的常用方法[5]。

目前以雞肉作為底物酶解制備調(diào)味基料的研究報道較多，而以鴨肉、鵝肉和禽骨為底物的研究相對較少。以禽肉為底物得到的產(chǎn)品香味濃郁，但是成本較高。禽骨中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是一種營養(yǎng)價值高的肉類加工副產(chǎn)物。酶解禽骨生產(chǎn)呈味基料，成本相對低，但是風(fēng)味較淡。針對酶解單一底物存在的弊端，孫麗霞等[6]以雞脯肉和雞骨架為復(fù)合底物進行酶解，在提升產(chǎn)品風(fēng)味的同時降低了生產(chǎn)成本。

酶解方式主要包括單一酶水解、復(fù)合酶水解和輔助酶解(見表1)。在酶解過程中，酶解條件如溫度、pH、加酶量、料液比等存在復(fù)雜的交互作用，影響水解效果和產(chǎn)物的風(fēng)味特征。此外，在加熱滅酶過程中，隨著溫度的逐漸升高，酶解體系中會發(fā)生分解、氧化、還原等前體物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)。常使用的滅酶條件為75～100 ℃，10～25 min。

表1 酶解禽類蛋白制備呈味基料

1.1 單一酶水解

蛋白酶根據(jù)來源可以分為植物蛋白酶、動物蛋白酶和微生物蛋白酶。不同的蛋白酶具有不同的酶切位點，酶的選擇可以直接影響蛋白質(zhì)的水解度、酶解產(chǎn)物肽分子量大小、游離氨基酸組成以及酶解液風(fēng)味和營養(yǎng)價值等[16]。目前用于禽類蛋白呈味研究的酶主要有堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶。

為了獲得理想的風(fēng)味前體物質(zhì)，特別是游離氨基酸和多肽，需控制水解度和水解時間以獲得合適的禽類蛋白酶解物[17]。Zhang等提出由復(fù)合蛋白酶FH-G-NA-XII和胰蛋白酶同步酶解3～6 h得到的雞肉蛋白水解物可能是食品工業(yè)生產(chǎn)理想雞肉風(fēng)味的前體物質(zhì)。Dong等[18]發(fā)現(xiàn)8 h是風(fēng)味酶水解雞骨生產(chǎn)氨基酸的最佳時間，這種差異可能是酶解原料不同以及不同蛋白酶的酶活性和酶切位點不同造成的。于亞輝等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)單一酶酶解后的雞肉酶解液水解度為10%～20%，其中動物蛋白酶的酶解效果最佳，水解度為19.21%，得到的酶解液中鮮味、甜味氨基酸含量相對較高，這可能是由于動物蛋白酶含有內(nèi)切酶、外切酶以及風(fēng)味酶，因此整體酶解效果好。復(fù)合蛋白酶主要含內(nèi)切酶，水解度較高，但產(chǎn)物中多含有低聚肽，易產(chǎn)生苦味。風(fēng)味蛋白酶可以通過選擇性酶切苦味肽的N-端或C-端肽鍵，使游離的疏水氨基酸釋放出來，從而降低苦味，改善酶解液風(fēng)味[19]。

另外，不同品種以及不同部位的雞肉水解度和風(fēng)味差異顯著，其中雞胸肉酶解物的水解度最高，雞骨架最低；淘汰蛋雞不同部位之間以雞骨架酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物呈味效果最好[20]。

1.2 復(fù)合酶水解

單一酶水解雖然操作簡單、成本較低，但由于酶切位點單一，故酶解液的水解度不高，酶解時間較長，另外經(jīng)單一酶水解的熱反應(yīng)產(chǎn)物的香氣不突出。當(dāng)僅用一種酶難以達到預(yù)期效果時，可以將兩種或幾種酶結(jié)合形成復(fù)雜的酶系統(tǒng)。復(fù)合酶水解相對于單一酶水解可顯著提高酶解液的水解度，且特征香更加明顯，因此多采用復(fù)合酶水解制備呈味基料[21]。復(fù)合酶水解分為多酶同步水解和多酶分步水解。

有研究發(fā)現(xiàn)，分步水解與同步水解對雞骨酶解物的影響并不顯著，為了簡化工藝，采用同步酶解工藝。單一風(fēng)味酶能有效降低酶解產(chǎn)物的苦味，但其缺乏足夠多的酶切位點，因此酶解液的水解度較低。一般采用風(fēng)味蛋白酶與其他內(nèi)切酶復(fù)配酶解禽肉或禽骨，得到的酶解液水解度為20%～40%，且風(fēng)味的感官評價較好。

邱燕翔等發(fā)現(xiàn)經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解制得的雞肉酶解液水解度為20.1%，且香氣純正，無明顯苦味；而經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解制得的酶解液水解度為28.7%，但香氣較淡，苦味較重，最終采用在不滅酶條件下復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按1∶2分步酶解雞胸肉，水解度達到了48.8%，制得的酶解液香氣濃郁，無明顯苦味。

1.3 輔助酶解

近年來，越來越多的研究表明，一些輔助手段與生物酶解技術(shù)結(jié)合使用可以縮短酶解時間，提高酶解效果。輔助酶解手段主要包括超聲波、微波、超高壓等，目前多以超聲輔助酶解技術(shù)水解禽類蛋白。

超聲波是一種綠色技術(shù)，主要通過空化效應(yīng)來改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)[22]。超聲波在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氣泡經(jīng)過擠壓破裂，能在瞬間產(chǎn)生較強的機械剪切力，對液體介質(zhì)中的大分子產(chǎn)生機械性斷鍵作用，從而促使更多親水基團暴露，有利于底物與酶的結(jié)合，提高蛋白質(zhì)的水解程度，達到預(yù)期的效果。有學(xué)者采用超聲輔助堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解雞骨架，先調(diào)節(jié)pH至8.5，添加0.2%的堿性蛋白酶，55 ℃下恒溫酶解1.5 h后，再將pH值調(diào)節(jié)至7，向其中加入0.2%的風(fēng)味蛋白酶，50 ℃下恒溫酶解1.5 h，確定了最佳輔助條件為超聲功率800 W、超聲時間30 min，此條件下，水解度達到了24%，經(jīng)超聲處理后雞骨酶解液中鮮味氨基酸含量增加，鮮味增強。

超高壓、微波和酶解相結(jié)合可以提高原料的利用率，縮短酶解時間，提高蛋白水解度和酶解效率，改善植物蛋白酶解產(chǎn)物的風(fēng)味[23-24]。但目前采用超高壓或微波輔助酶解技術(shù)改善禽類蛋白酶解物風(fēng)味的研究鮮有報道。

2 酶解產(chǎn)物中呈味物質(zhì)研究

禽類蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，呈味物質(zhì)如氨基酸、肽、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等的組成和含量發(fā)生改變，從而影響酶解產(chǎn)物的呈味特性。

氨基酸在生物的生長和發(fā)育中起著重要作用，并且可以增強食物的味道。氨基酸可以呈現(xiàn)酸、甜、苦、鮮等多種滋味，例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸呈甜味，天冬氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸呈鮮味，亮氨酸、苯丙氨酸呈苦味。鮮味氨基酸共同的基本骨架結(jié)構(gòu)為-O-(Cn)-O-(n=3～9)；當(dāng)n=4～6時，鮮味最強[25]。采用復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解雞肉蛋白，酶解物中氨基酸含量較高的為谷氨酸(243.08 mg/g)，其次為天冬氨酸，這是雞肉酶解液產(chǎn)生鮮味的重要原因[26]。而利用風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶分步酶解制備的雞肉酶解物中含量最高的氨基酸為5種呈苦味的氨基酸，包括亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、纈氨酸和賴氨酸，呈鮮味的谷氨酸居第六位(285.28 μg/mL)。

源自蛋白水解的肽可以賦予味道，例如，谷氨酰肽賦予鮮味，而含有脯氨酸的疏水肽賦予苦味。肽的功能與其分子量密切相關(guān)，1000～5000 Da之間的肽可有效提升產(chǎn)品風(fēng)味[27]。有報道顯示雞肉酶解液中2000～5000 Da的肽是雞肉呈現(xiàn)濃郁香味的原因[28]。相對分子量較小的肽作為肉的風(fēng)味前體物質(zhì)易產(chǎn)生更多的揮發(fā)性化合物。

風(fēng)味核苷酸主要包括5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)，它們對谷氨酸的鮮味有強化作用[29]。禽肉中的鮮味核苷酸主要產(chǎn)生于肌肉中ATP的降解，5′-IMP在肉類中含量更高，5′-GMP在植物性食物中含量更高[30]。雞肉酶解液中檢測到5′-IMP和5′-GMP的含量高達74.73 μg/mL，可作為很好的風(fēng)味增強物質(zhì)。5′-IMP與多肽之間存在復(fù)雜的相互作用，從雞肉酶解物中合成的多肽中，EV、EE呈現(xiàn)淡鮮味，但當(dāng)它們與5′-IMP混合時，鮮味增強，其他二肽或三肽本身并沒有鮮味，但與0.02%的5′-IMP混合時，也呈現(xiàn)出鮮味[31]。

除呈味氨基酸、肽和核苷酸外，在禽類酶解液中還鑒定出了多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。例如鴨骨酶解液中主要含醛類、酮類、酯類、烴類、呋喃類化合物[32]。研究顯示，酯類可以提高并改善肉香味，呋喃類化合物不僅可以對肉香味起到一定的修飾作用，還會生成如2-甲基-3-呋喃硫醇等肉香味物質(zhì)的重要中間產(chǎn)物[33]。

在禽肉酶解過程中，上述風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量發(fā)生動態(tài)變化，并影響酶解物的風(fēng)味。Kong等在雞肉蛋白酶解物中共發(fā)現(xiàn)了17種氨基酸，其中苦味氨基酸含量為2819.78 μg/mL，占70.28%；乳酸和琥珀酸含量高達6.75 mg/mL和1.76 mg/mL；與其他核苷酸相比，5′-IMP對鮮味的貢獻顯著，含量達57.70 μg/mL，這些風(fēng)味物質(zhì)對雞肉酶解液的整體風(fēng)味作出了重要貢獻。以復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解制備的雞肉蛋白水解液中谷氨酸、丙氨酸、精氨酸和亮氨酸的含量均較高(>200 mg/dL)；呈味核苷酸二鈉含量達到了110.71 mg/dL；酶解產(chǎn)物中的小肽(相對分子質(zhì)量<1000 u)占比99.85%，有利于熱反應(yīng)調(diào)味品的制備。但是這些風(fēng)味物質(zhì)之間的相互作用以及影響酶解物風(fēng)味的關(guān)鍵呈味物質(zhì)尚不清楚。

3 呈味肽的分離純化與鑒定

呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成的對食品風(fēng)味有一定貢獻的低聚肽(分子量<3000 Da)。不同鏈長和結(jié)構(gòu)序列以及不同氨基酸組成的呈味肽具有不同的呈味特征，呈味肽包括甜味、酸味、咸味、苦味和鮮味5種味感。苦味來源于肽中如精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸等疏水性氨基酸，氨基酸疏水性基團裸露在肽鏈表面與苦味受體結(jié)合可產(chǎn)生苦味；酸味和咸味主要是由于存在帶電荷的末端和/或帶電荷的側(cè)鏈，酸味通常與鮮味有關(guān)，鑒定出的二肽VE、AD等同時具有鮮味和酸味特性(見表2)；鮮味肽中的大多數(shù)氨基酸序列中含有酸性氨基酸谷氨酸或天冬氨酸，它們對雞肉酶解物鮮味的產(chǎn)生起到了關(guān)鍵性的影響；此外，呈味肽可以賦予食物厚度、口感和豐富的味道，這種味道被稱為“kokumi”，其特點是味道增強、復(fù)雜且持久[34]。呈味肽兼具營養(yǎng)價值和呈味功能，是高檔復(fù)合調(diào)味料的重要基料。

呈味肽分離純化的方法主要包括超濾、凝膠過濾色譜以及反向高效液相色譜等，多是兩種及兩種以上方法聯(lián)合使用。目前國內(nèi)外已從雞肉酶解物中鑒定出多種呈味肽(見表2)，而鴨肉、鵝肉和禽骨酶解物中的呈味肽鮮有報道。鑒定出的呈味肽中，AM已被報道呈苦味[35]；VE、AEA、ED和AE具有鮮味[36-38]。從雞肉酶解物中鑒定出的3種肽(WVNEEDHL、NSLEGEFKG和KDLFDPVIQD)，由其序列可知，肽中含有帶正電的堿性基團、帶負電的酸性基團(-Glu-Glu-Asp-)以及疏水基團，它們的協(xié)同作用使得肽段呈現(xiàn)出酸味、甜味和鮮味，并且這3種肽均能顯著增強雞肉粉溶液的肉味、鮮味和厚度[39]。

表2 禽類蛋白酶解物中鑒定的呈味肽

4 結(jié)語與展望

采用酶法水解禽類蛋白是開發(fā)營養(yǎng)、健康、風(fēng)味天然、鮮美濃郁的高品質(zhì)呈味基料的有效途徑。目前國內(nèi)外學(xué)者對酶解禽類蛋白制備呈味基料已開展了大量研究，主要集中于酶解雞肉的工藝優(yōu)化，酶解過程中呈味物質(zhì)的變化規(guī)律，雞肉酶解物中呈味肽的鑒定。未來在以下幾個方面值得深入研究：禽骨或禽骨與禽肉復(fù)合酶解物的呈味特點；探索輔助酶解技術(shù)在制備呈味基料中的應(yīng)用及機理；研究酶解制備呈味基料的風(fēng)味形成機制，風(fēng)味物質(zhì)之間的交互作用，明確關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)并進行定向調(diào)控；進一步發(fā)掘禽類蛋白酶解物中的鮮味肽。對禽類蛋白酶解物呈味的研究將促進我國調(diào)味品行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，且對實現(xiàn)禽類骨架的高值化利用以及禽肉加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。