microRNAs在急性肺栓塞中的研究進(jìn)展

金 釗，施熠煒

肺栓塞(pulmonary embolism，PE)是以各種栓子阻塞肺動(dòng)脈或其分支為其發(fā)病原因的一組疾病或臨床綜合征的總稱，其中肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)為肺栓塞最常見(jiàn)類(lèi)型。引起PTE的血栓主要來(lái)源于下肢的深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)，二者合稱為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism， VTE)。二者具有相同易患因素，是VTE在不同部位、不同階段的兩種臨床表現(xiàn)形式[1]。

作為全球第三大急性心血管綜合征，VTE位于心肌梗死與腦卒中之后[2]。流行病學(xué)研究表明，肺栓塞年發(fā)病率為39/10萬(wàn)～115/10萬(wàn)，深靜脈血栓年發(fā)病率為53/10萬(wàn)～162/10萬(wàn)[3-4]。隨著年齡增加，VTE發(fā)病率增加，年齡>40歲較年輕病人風(fēng)險(xiǎn)增高，其風(fēng)險(xiǎn)大約每10年增加1倍[5]；而在老年人中更為明顯，年齡≥80歲人群VTE發(fā)病率幾乎是50歲人群的8倍[3]。PTE致殘率和致死率都很高，其7 d全因病死率為1.9%～2.9%，30 d全因病死率為4.9%～6.6%[6]。此外，初始治療前6個(gè)月內(nèi)為VTE全因病死率高峰期，隨后明顯下降[7]。以上的流行病學(xué)研究表明，VTE的早期有效診治仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)是一種常見(jiàn)的突發(fā)的具有高發(fā)病率及死亡率的VTE[8]，其臨床表現(xiàn)多樣化，缺乏可靠的篩查方式，漏診率較高。早期及時(shí)準(zhǔn)確的診斷非常關(guān)鍵，主要包括實(shí)驗(yàn)室標(biāo)志物及影像學(xué)檢查。D-二聚體是纖維蛋白降解產(chǎn)物，升高反映繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，診斷肺栓塞具有高度敏感性，但其特異性較低，即陰性具有排除價(jià)值，而陽(yáng)性仍需進(jìn)一步檢查[9]。肺動(dòng)脈造影曾是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，因其有創(chuàng)性已逐漸被CT肺血管造影(CTPA)取代，但腎功能不全以及對(duì)造影劑過(guò)敏等病人無(wú)法行CTPA檢查?？傊?，早期及時(shí)并準(zhǔn)確診斷APE的新型無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物的研究非常必要。

microRNA(miRNA)是內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，通過(guò)結(jié)合靶基因mRNAs 3′非翻譯區(qū)抑制其翻譯[10]。循環(huán)miRNAs在內(nèi)源性RNA酶的保護(hù)下較為穩(wěn)定，易于收集且重復(fù)度高，是一種簡(jiǎn)便可靠的生物標(biāo)志物，疾病狀態(tài)下，可從細(xì)胞中被動(dòng)或選擇性地釋放進(jìn)入血液，作為信號(hào)交流的信使[11]，于血漿或血清中迅速靈敏地定量檢測(cè)到，在心血管系統(tǒng)疾病方面已有廣泛的研究。此外，miRNAs與CTPA相比無(wú)創(chuàng)且沒(méi)有輻射，與D-二聚體相比則往往有更高的診斷準(zhǔn)確性。miRNAs對(duì)早期準(zhǔn)確診斷APE具備很高的價(jià)值，同時(shí)參與了APE的發(fā)病機(jī)制通路。本研究對(duì)microRNA在APE中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA-134與miRNA-1233

miRNAs用于診斷APE最早在Xiao等[12]的一項(xiàng)前瞻性研究中提出。該實(shí)驗(yàn)收集了APE組32例、健康對(duì)照組32名、非APE組22例，通過(guò)Taqman微陣列分析篩選出30種差異化表達(dá)的miRNAs，并通過(guò)Taqman miRNA 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)3組miRNA-134，結(jié)果顯示，APE組血漿miRNA-134明顯高于健康對(duì)照組及非APE組，首次提出miRNA-134可作為診斷APE的潛在生物標(biāo)志物。但該研究存在一定的局限性，如樣本數(shù)量相對(duì)較小，沒(méi)有結(jié)合臨床指標(biāo)(如D-二聚體)探究更高的診斷準(zhǔn)確性，同時(shí)未涉及miRNA-134的生物學(xué)功能、相關(guān)病理生理學(xué)機(jī)制及其對(duì)APE診斷模式的價(jià)值等。

Liu等[13]的Meta分析系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了循環(huán)miRNA-134對(duì)于早期診斷APE的臨床價(jià)值。該Meta分析發(fā)現(xiàn)，APE組血清或血漿中miRNA-134明顯高于對(duì)照組，其整體靈敏度與特異度都很高，反映了miRNA-134對(duì)APE的診斷準(zhǔn)確性較高。由于D-二聚體的靈敏度高及特異度低，其陰性常用于APE的排除診斷，該Meta分析提出miR-134聯(lián)合D-二聚體對(duì)準(zhǔn)確診斷APE可能優(yōu)于單一指標(biāo)。該Meta分析也存在一定的局限性，其收錄文獻(xiàn)較少，且不同文獻(xiàn)具有異質(zhì)性。盡管存在局限性，該Meta分析闡釋了miRNA-134可作為APE早期診斷的新型生物標(biāo)志物。

非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)具有與APE難于鑒別的臨床癥狀(如呼吸困難與胸痛)，早期識(shí)別這兩種致命性胸痛并給予針對(duì)性治療對(duì)改善預(yù)后非常關(guān)鍵，而常用的肌鈣蛋白及D-二聚體并不足以將二者有效鑒別。Kessler等[14]首次提出miRNA-1233可作為鑒別二者的生物標(biāo)志物，且具有高度的靈敏度(90%)及特異度(100%)。該研究測(cè)序了肺栓塞急性期(第1天)與慢性期(9個(gè)月后)的754種miRNAs，發(fā)現(xiàn)了37種差異化表達(dá)的miRNAs，其中miRNA-1233在急性與慢性肺栓塞中差異最明顯，并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了其在NSTEMI組及健康組中明顯的差異化表達(dá)。但由于缺乏可靠的床旁測(cè)量技術(shù)及正常值范圍，miRNAs用于臨床早期鑒別APE與NSTEMI尚需更多研究。該研究仍存在一定的局限性，如樣本量較小以及實(shí)驗(yàn)組為高選擇性高栓塞風(fēng)險(xiǎn)的中心型栓塞重癥病人。該研究首次提出miR-1233作為鑒別診斷APE與NSTEMI具有高度準(zhǔn)確性，可作為診斷APE更有前景的生物標(biāo)志物。

隨著以上兩種miRNA在APE中的研究愈發(fā)廣泛，Peng等[15]為早期鑒別慢性阻塞性肺疾病(COPD)是否合并APE，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miRNA-134與miRNA-1233表達(dá)，結(jié)果顯示慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)合并APE組miRNA-134與miRNA-1233表達(dá)較COPD穩(wěn)定期及急性加重期組明顯上調(diào)。在APE組中，miRNA-134的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.931，miRNA-1233的AUC為0.884，二者AUC均高于D-二聚體(AUC 為0.628)，經(jīng)年齡調(diào)整后的D-二聚體(AUC 為0.705)及Wells評(píng)分(AUC 為0.705)，提示miRNA-134和miRNA-1233可作為鑒別診斷AECOPD是否合并APE的潛在生物標(biāo)志物。該研究還表明miRNA-134聯(lián)合miRNA-1233(AUC為0.957)診斷準(zhǔn)確性高于單一miRNA，以及二者分別聯(lián)合經(jīng)年齡調(diào)整后的D-二聚體對(duì)診斷準(zhǔn)確性無(wú)明顯提高。該研究為單中心小樣本研究，而且因科室特殊性收集的AECOPD均為中重度，長(zhǎng)期缺氧且活動(dòng)不足，具備血栓形成高危因素。

2 miRNA-27a/b 與miRNA-221

不同miRNAs在診斷APE的研究也有所不同。Wang等[16]收集了78例APE病人與70名年齡、性別匹配的健康人，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)血漿miR-27a與miR-27b表達(dá)，結(jié)果顯示，APE組血漿miR-27a與miR-27b明顯增高，且miR-27a(AUC為0.784)優(yōu)于miR-27b(AUC為0.707)，并且miR-27a或miR-27b聯(lián)合D-二聚體明顯增加了APE診斷的準(zhǔn)確性。該研究也有一定的局限性：首先，這項(xiàng)單中心研究的樣本量仍相對(duì)較??；其次，該研究只測(cè)量了APE病人出現(xiàn)癥狀6 h以內(nèi)的miRNA含量，并未測(cè)量其后續(xù)水平，且相關(guān)機(jī)制尚未明確；最后，miRNA的標(biāo)準(zhǔn)化正常范圍仍未確定。此外，Liu等[17]納入了60例APE病人及50名正常人，通過(guò)miRNA微陣列分析鑒別出血漿中差異化表達(dá)的32種miRNAs，并應(yīng)用qRT-PCR驗(yàn)證了miR-221(AUC為0.823)在APE組明顯上調(diào)，其程度與肺栓塞風(fēng)險(xiǎn)性增加相關(guān)，miR-221表達(dá)量與腦鈉肽(BNP)、肌鈣蛋白I及D-二聚體呈正相關(guān)，且其對(duì)于APE診斷的準(zhǔn)確性更高。該研究也存在局限性，同其他實(shí)驗(yàn)一致為單中心、小樣本研究；而且測(cè)序miRNA數(shù)量較少，無(wú)法確定有無(wú)其他miRNA參與APE進(jìn)展；此外，因miRNA嚴(yán)格的時(shí)空特異性也無(wú)法確定miR-221是否為APE早期特異性標(biāo)志物。

3 miRNA let-7i-5p與miRNA-320a

Fabro等[18]研究了經(jīng)時(shí)間變化的PTE及不同表型肺動(dòng)脈高壓miRNA的差異，并預(yù)測(cè)了相應(yīng)miRNA的靶基因。該研究比較了急性肺血栓栓塞癥(APTE)與慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓(CTEPH)中miRNA的改變，以及CTEPH與特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(IPAH)中miRNA的差異，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)差異最明顯的miRNA。APTE組miR-let-7i-5p、miR-320a、miR-320b-1、miR-320b-2及miR-1291上調(diào)；CTEPH組miR-320b-1上調(diào)，miR-let-7i-5p、miR-320a、miR-320b-2及miR-1291下調(diào)；而在IPAH組miR-let-7i-5p與miR-320b-1上調(diào)，miR-320a和miR-1291下調(diào)。與對(duì)照組相比，APTE組miR-let-7i-5p和miR-320a明顯上調(diào)，CTEPH組明顯下調(diào)；而IPAH組miR-let-7i-5p明顯上調(diào)，miR-320a明顯下調(diào)。該研究表明miR-let-7i-5p作用的11個(gè)靶基因及miR-320a作用的20個(gè)靶基因，可能參與調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖、血管收縮、炎癥及DNA損傷，且兩種miRNA的靶基因雄激素受體(AR)及蛋白激酶Cα(PRKCA)在癌癥中均有所研究。APTE組miR-let-7i-5p上調(diào)，而CTEPH組下調(diào)，與已知的D-二聚體、C反應(yīng)蛋白及心臟指數(shù)等一致，反映了隨時(shí)間變化的異常血管重塑。在可能由于肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖與抗凋亡表型不平衡導(dǎo)致了二者差異的IPAH組與CTEPH組中，即let-7i-5p在前者上調(diào)，而在后者下調(diào)。miRNA-320a與miR-let-7b-5p聯(lián)合臨床特征有助于經(jīng)時(shí)間變化的APTE與CTEPH以及不同表型的IPAH與CTEPH的鑒別診斷。

綜上所述，miRNA早期診斷APE具備很高的價(jià)值。

4 miRNA-21、miRNA let-7b-5p與miRNA-106b-5p

Liang等[19]通過(guò)建立姜黃素處理的APE大鼠模型，經(jīng)蛋白免疫印跡法(Western Blot)分析及RT-qPCR證實(shí)了APE組Sp1、miRNA-21、NF-κB下調(diào)以及磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)上調(diào)。病人研究表明，姜黃素可降低APE大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、右心室收縮壓(RVSP)、血栓體積及肺部炎性因子。雙熒光素酶報(bào)告分析及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析顯示，Sp1可通過(guò)結(jié)合miR-21啟動(dòng)子增加miR-21表達(dá)，且PTEN為miR-21的靶點(diǎn)。此外，通過(guò)評(píng)估腺病毒注射APE大鼠發(fā)現(xiàn)了miR-21或Sp1下調(diào)以及PTEN上調(diào)可降低肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)、右心室收縮壓(RVSP)、肺濕重與干重比值(W/D)、血栓體積及肺部炎性因子，表明姜黃素通過(guò)下調(diào)Sp1降低miR-21的表達(dá)，從而上調(diào)PTEN并削弱NF-κB信號(hào)通路，抑制APE大鼠肺損傷和炎癥。

Liu等[20]在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，發(fā)現(xiàn)APE中miRNA let-7b-5p可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)應(yīng)激相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白1(SERP1)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而SERP1激活后可調(diào)節(jié)其伴侶蛋白SEC61B參與應(yīng)答，SEC61B可介導(dǎo)未折疊蛋白GRP78、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)以及PERK-C/EBP同源蛋白(CHOP)通路的CHOP引發(fā)炎癥反應(yīng)與肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。該研究表明miRNA let-7b-5p可通過(guò)上調(diào)SERP1并調(diào)節(jié)其伴侶蛋白SEC61B介導(dǎo)的GRP78及PERK-CHOP通路的PERK與CHOP參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致肺部細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，參與了APE的發(fā)病過(guò)程。

Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)在APE小鼠體內(nèi)及體外血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)中，miR-106b-5p下調(diào)，腫瘤細(xì)胞核NR4A3(NOR-1)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)上調(diào)。在PASMCs中，PDGF可降低miR-106b-5p水平，并增強(qiáng)NOR-1/PCNA通路的表達(dá)；同時(shí)，也驗(yàn)證了NOR-1過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)該miRNA對(duì)PDGF誘導(dǎo)的PASMCs增殖及遷移的抑制。該研究表明，miR-106b-5p可通過(guò)作用于NOR-1 mRNA 3′非翻譯區(qū)降低其表達(dá)，逆轉(zhuǎn)PDGF誘導(dǎo)的PASMCs增殖及遷移，改善肺血管重塑，降低APE 死亡率。

APE病人病情危重，漏診率高，及時(shí)識(shí)別并給予有效診治對(duì)改善預(yù)后非常關(guān)鍵。臨床常用的D-二聚體及CTPA存在一定的局限性，而新型生物標(biāo)志物miRNA則為APE早期診治提供了突破性的進(jìn)展，期待更多研究結(jié)果實(shí)現(xiàn)其真正地應(yīng)用并指導(dǎo)臨床實(shí)踐。