中醫(yī)藥治療慢性心力衰竭的網絡藥理學研究進展

孫梓宜，張?zhí)煅牛踝雍?，黃 力

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作為多種心血管疾病的終末階段，是一種導致高住院率、高死亡率的疾病，給公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了重大負擔。雖然新的治療方案不斷涌現與優(yōu)化，但5年的死亡率仍約為50%[1]。中藥復方是很好的新藥開發(fā)資源，其臨床療效已在幾千年的中醫(yī)臨床實踐中得到了證實，有望為心力衰竭病人帶來福祉，但其多成分、多靶點、多效應的作用機制是中醫(yī)藥研究的難題。網絡藥理學可利用各種組學技術或者高通量手段篩選出藥物活性成分，經過多組學網絡融合，找到與這些活性成分所對應的關鍵節(jié)點蛋白，通過對關鍵節(jié)點蛋白進行生物富集分析，進而揭示中藥的有效成分及其作用機制。它可以系統(tǒng)地將藥物、化合物、靶點和疾病之間的相互關系呈現出來。網絡藥理學已經成為研究多成分、多途徑、多靶點的中藥復方的重要方法，對于新藥的開發(fā)以及闡明藥物背后的分子機制具有指導作用[2]。隨著網絡藥理學概念的提出，涌現出大量中藥單體及復方治療慢性心力衰竭的網絡藥理學相關研究，基于此，本研究旨在通過對相關文獻進行系統(tǒng)梳理，以總結目前研究概況并為未來的研究提供參考與借鑒。

1 網絡藥理學的主要研究方法

在過去的很長一段時間，通過設計具有最大選擇性的配體作用于單個藥物靶點是藥物發(fā)現的主要主導模式。然而，許多有效的藥物是通過調節(jié)多個蛋白質而不是單個靶點發(fā)揮作用的?；诖吮尘?，2008年，Hopkins[3]首次提出網絡藥理學的概念，將生物信息學、系統(tǒng)生物學與多向藥理學聯合應用于藥物的設計。因網絡藥理學所強調的“多靶點”“協同機制”與中醫(yī)理論所強調的“整體觀念”“辨證論治”不謀而合，故一經提出許多中醫(yī)學者就嘗試將其應用于中藥及復方的開發(fā)與預測方面[4]。為解決中草藥配方的分子基礎研究所面臨的復雜性等問題，2011年，李梢[5]首次提出了“網絡靶標”的概念，其可通過將方藥、病證映射于生物分子網絡中，以網絡為基礎建立方藥與病證的關聯機制。網絡藥理學以及“網絡靶標”概念的提出，打開了中藥及復方研究的潘多拉魔盒，大量相關研究相繼涌現。

網絡藥理學通過整合多學科領域的大量信息，將實驗與計算相結合從而預測、發(fā)現新的藥物及作用網絡。實驗方法包括各種高通量組學技術與生物和藥理實驗，計算方法包括數據挖掘、建模、圖論、統(tǒng)計方法和信息可視化等方法[3]。而中藥網絡藥理學研究方法包括對中藥復方中有效成分的鑒定、基于藥物算法的靶標預測、活性成分對應靶標的篩選、基于網絡的疾病基因預測、疾病特異性網絡的構建以及最終的藥物-基因-疾病共模塊的定量分析[6]。

2 網絡藥理學研究的常用工具

2.1 藥物活性成分的篩選及靶點預測的數據庫 目前常用的藥物活性成分的篩選及靶點預測的數據庫包括：①中藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[7]收錄了近500味中草藥的近2.9萬個的活性成分及對應的靶點蛋白，可根據藥物的吸收、代謝、分布(ADME)參數篩選中藥的活性成分及對應靶標，是目前最常用的數據庫之一。②本草組鑒數據庫(HERB，http://herb.ac.cn/)[8]是由北京中醫(yī)藥大學開發(fā)的包含大量高通量的中醫(yī)藥實驗的數據庫，收集并重新分析了1 037個用中藥或中藥成分處理的高通量測序實驗，支持對中藥、成分、靶標以及疾病的檢索與預測。③SwissTargetPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)[9]是基于相似性原理，通過反向篩選預測可能的小分子靶點蛋白，可用于中藥活性成分靶標的反向預測。④其他常用的數據庫還有中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺(TCMIP，http://www.tcmip.cn)[10]、中藥信息數據庫(TCMID，http://bidd.group/TCMID/index.html)[11]、BAT-MAN(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)數據庫[12]、Pharmmapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)[13]數據庫等。

2.2 疾病靶點篩選的數據庫 目前常用于疾病靶點篩選數據庫包括：①GeneCards(https://www.genecards.org/)[14]數據庫將150個網絡基因數據中心進行整合，包含了基因組、轉錄組、蛋白組以及臨床疾病的蛋白靶點，是十分全面的綜合性數據庫。②DrugBank(https://go.drugbank.com/)[15]數據庫，包含已批準的藥物2 358個，還包括數百種藥物對代謝物水平(藥物代謝組學)、基因表達水平(藥物轉錄組學)和蛋白質表達水平(藥物原生學)影響的信息。③OMIM(https://www.omim.org/)[16]數據庫，由Victor A. McKusick博士在19世紀60年代初期創(chuàng)建，目前以包含超過1.6萬個基因的信息，并仍在不斷更新。④其他常用的數據庫還有TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[17]數據庫、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)[18]數據庫等。

2.3 蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建及生物富集分析的數據庫 生命體的活動依賴于生物分子之間的相互作用，PPI網絡可以展示靶點在蛋白水平上的相互作用關系。STRING(https://cn.string-db.org/)[19]數據庫覆蓋了1.4萬多個物種之間的蛋白網絡，整合了所有已知的與預測的蛋白質之間的關聯，包括物理相互作用和功能關聯，是常用的構建PPI網絡的數據平臺。生物富集分析可選擇的數據庫包括DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[20]數據庫，其是一個集合了注釋、可視化和集成發(fā)現的數據庫，可以提供差異表達基因的功能注釋與分析微陣列數據。Metascape(https://metascape.org/)[21]數據庫整合利用40多個獨立的知識庫，可以提供全面的基因列表注釋和分析資源，結合了功能豐富分析、交互組分析、基因注釋和成員搜索等功能，是提供生物富集分析的高效工具。同時常應用Cytoscape[22]軟件對網絡進行網絡的構建及可視化展示。

3 中藥活性成分及單藥防治慢性心力衰竭的網絡藥理學研究

中藥活性成分是中藥中具有醫(yī)療效用或生理活性的單體化合物，是新藥研發(fā)、藥品制備的重要途徑來源。譚鑫等[23]應用網絡藥理學和分子對接技術探索槲皮素治療慢性心力衰竭的分子機制，得到與慢性心力衰竭相關80個靶標，篩選出了蛋白激酶B1(AKT1)、胱天蛋白酶3(CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和MAPK8共5個關鍵靶點，細胞實驗表明槲皮素可明顯降低心力衰竭細胞AKT1、Phospho-AKT(Ser473)、 內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、MMP9和Caspase-3水平(P<0.01)，并得出結論：槲皮素可能通過調節(jié)AKT1-eNOS-MMP9通路抑制凋亡從而改善慢性心力衰竭。Zhu等[24]運用網絡藥理學方法研究雷公藤甲素治療糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的作用機制，篩選出信號傳導及轉錄激活蛋白3(STAT3)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、FOS、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤蛋白p53(TP53) 和轉化生長因子-B1(TGFB1)共6個關鍵靶點。富集主要集中在晚期糖基化受體終末產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、胰腺癌、MAPK等信號通路上。Luo等[25]通過TCMSP數據庫篩選出了葶藶子包含12個活性成分以及所對應的29個慢性心力衰竭相關靶標蛋白，通過對網絡的分析以及富集分析，認為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素為發(fā)揮治療作用的主要活性成分，β2腎上腺素能受體(ADRB2)、血紅素加氧酶1(HMOX1)為關鍵靶標，可能通過調節(jié)AGE-RAGE信號通路、低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、雌激素信號通路而發(fā)揮治療作用。Tao等[26]運用網絡藥理學方法確定了黃芪中所包含的21種有效成分以及對應的407個靶標，通過網絡構建共獲得46個交集靶點蛋白，對交集蛋白進行生物富集分析后顯示，黃芪在調節(jié)AGE-RAGE、白細胞介素-17(IL-17)、HIF-1等信號通路方面具有潛在作用。李昊楠等[27]通過整合多個數據庫，篩選獲得人參所包含的33種活性成分，以及與心力衰竭相關的STAT3、 c-Jun蛋白(JUN)、白細胞介素-1β(IL-1β)、TNF等靶點，富集分析結果表明，人參治療心力衰竭可能涉及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、TNF、胰島素抵抗、甲狀腺激素等共55條信號通路，為人參治療心力衰竭的臨床應用提供了科學依據。

4 中藥復方防治慢性心力衰竭的網絡藥理學研究

相較于中藥的活性成分與單味中藥，中藥復方更符合中醫(yī)的辨證論治特點，臨床治療中也多是以復方的形式進行辨證治療。目前已有較多學者將網絡藥理學應用于研究中藥復方防治慢性心力衰竭的作用機制中[28-31]。Xu等[32]的研究發(fā)現，參附湯可以提高心力衰竭大鼠的射血分數，減輕心肌組織病理學改變，降低血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、醛固酮(aldosterone，ALD)、心房利鈉肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)和腎素(renin，REN)水平。并進一步通過網絡藥理學與分子對接技術篩選出參附湯所作用的22個核心靶點蛋白，利用表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術發(fā)現參附湯可能通過烏頭堿(aconitine，AC)、苯甲酰胺(benzoylaconine，BAC)、人參皂苷 Re(Ginsenoside Re)、人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)、人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)作用于ACE2、REN、ACE、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、表皮細胞生長因子(EGF)、人5-羥色胺受體2B(HTR2B)、多聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)、重組人B型鈉尿肽(NPPB)等蛋白發(fā)揮協同作用改善心力衰竭。Liu等[33]通過整合多個數據庫，篩選出了芪參益氣顆粒所包含的243種生物活性成分與129個交集靶點，確定了內皮素1(EDN1)、血管緊張素原(AGT)、cAMP反應元件結合蛋白1(CREB1)、ACE等10個關鍵靶標，并通過進一步的聚類及富集分析篩選出與慢性心力衰竭相關的神經活性配體-受體相互作用信號通路、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路、腎素分泌、血管平滑肌收縮和腎素-血管緊張素系統(tǒng)等信號通路。孫梓宜等[34]聯合網絡藥理學與分子對接技術探討升解通瘀湯治療慢性心力衰竭的潛在作用機制，通過聯合多個數據庫信息以及網絡的拓撲分析，最終確定75個藥物活性成分及109個與慢性心力衰竭相關的靶標蛋白，認為升解通瘀湯可能通過調節(jié)免疫炎癥反應、細胞的增殖和凋亡、血管生成和氧化應激等生物學過程發(fā)揮治療作用。Wu等[35]將網絡藥理學與動物實驗相結合，通過網絡藥理學方法確定了63 個養(yǎng)心氏片包含的與心力衰竭進展密切相關的主要靶點，富集分析顯示養(yǎng)心氏片治療心力衰竭與氧氣輸送、葡萄糖利用和線粒體生物發(fā)生等通路有關。進一步的實驗表明養(yǎng)心氏片可以通過增加磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、Akt、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白S6(rpS6)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化來促進下游低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC1α)和葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的表達，通過激活PI3K/Akt/mTOR/rpS6/HIF-1α和AMPK/PGC1α/GLUT4信號通路改善慢性缺血性心力衰竭大鼠的心肌能量代謝障礙，對于養(yǎng)心氏片活性化合物的確定、潛在靶點以及分子機制明確具有重要意義。

5 網絡藥理學所面臨的問題與挑戰(zhàn)

中藥網絡藥理學的出現豐富了中醫(yī)藥的研究策略，對于靶標的發(fā)現、生物活性成分的篩選、毒性評價、藥效作用背后機制的闡釋以及中藥的研發(fā)具有重要意義，同時中藥網絡藥理學方法為中醫(yī)藥從經驗醫(yī)學向循證醫(yī)學系統(tǒng)的轉化提供了一種新的研究范式[36]。但目前網絡藥理學仍存在一定局限，首先，網絡藥理學的數據來源于現有數據庫，而數據的準確性與完整性直接決定了結果的可靠性。同時現有數據庫的數據紛繁復雜，如何對數據進行篩選以及保證結果的可重復性也是不容忽視的問題。其次，對于關鍵活性成分以及靶標的確定多是依據不同的模型與算法，而不同的算法往往會產生不同的預測結果，選擇何種算法并保證預測結果的準確性仍需進一步研究。再次，中藥方劑的配伍講究“君、臣、佐、使”，根據治法的要求，有主有次，有專攻有配合，而網絡藥理學中“藥物-有效成分”的對應關系僅僅是中藥中化學成分的簡單相加，這有悖于中醫(yī)的組方理論。尹文萱等[37]分別制備了人參、附子的單煎液與合煎液，結果表明，人參與附子的合煎液與單煎液的結構發(fā)生了變化，合煎液中有新的物質產生，各味中藥在合煎過程中存在著復雜的相互作用，因此不能將中藥復方簡單理解為單種藥物活性成分的簡單加和。最后，對于藥物活性成分的確定多以口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)作為標準，但卻忽視了成分含量對藥效的影響，同時，不同中藥的劑量不同其功效也大不相同，如中藥三七，小劑量可散瘀止血，大劑量具有活血作用，因此，將所有藥物按統(tǒng)一標準等同對待顯然也是不合理的[38-39]。

6 小結與展望

即使在網絡藥理學的研究中存在著一些不可避免的局限性，但它仍為復雜的中藥配方提供了一個多維的研究策略。隨著網絡藥理學研究的不斷深入以及儀器分析和數據分析手段的進步，希望能夠在中醫(yī)理論的指導下、在充分認識到中藥組方內在邏輯的基礎上，找到一種超高通量、快速、準確的方法來有效解決上述局限，從而進一步推動中醫(yī)藥的現代化進程。